人類嗜T 淋巴細胞病毒抗體血清學篩查與確證試驗的相關性分析*

鄧燕清 王淏 單振剛 謝君謀 杜榮松 肖巽南 李仲平 戎霞 黃伯泉

(廣州血液中心 廣州市血液安全重點實驗室，廣東 廣州 510095)

人類嗜T 淋巴細胞病毒(human T - lymphotropic virus，HTLV)，是20 世紀70 年代末發(fā)現的第1 個人類逆轉錄病毒，有4 個亞型(HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ、HTLV-Ⅲ和HTLV-Ⅳ)[1]。 目前較有臨床意義的是Ⅰ型和Ⅱ型(即HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ)，屬逆轉錄病毒科的RNA 腫瘤病毒亞科[2]。HTLV-Ⅰ、Ⅱ的傳播方式主要有輸血(15%～60%)、注射或性接觸，也可通過垂直傳播(經胎盤、產道或哺乳)，國內有報道獻血者家庭成員陽性感染的情況[3]。 HTLV 病毒通過感染CD4＋T 淋巴細胞引起T 細胞白血病、毛細胞白血病、HTLV 相關的脊髓病/熱帶痙攣性截癱(HTLV-associated myelopathy /tropical spasticparaparesis)以及炎性疾病[4]，嚴重可引起死亡。 目前尚未發(fā)現治愈HTLV 感染的特效藥物，也無相關疫苗，有報道稱少部分藥物可以緩解HTLV 感染相關疾病。HTLV 目前主要流行于日本的西南部、撒哈拉沙漠以南的非洲地區(qū)、加勒比海地區(qū)、南美洲等。 近年，國內的HTLV 流行區(qū)域主要集中在福建省、廣東省、浙江省等東南沿海地區(qū)[5]。由于HTLV 可經輸血傳播，國家衛(wèi)生健康相關部門于2015年頒發(fā)《關于做好人類嗜T 淋巴細胞病毒監(jiān)測工作的通知》，要求部分采供血機構對無償獻血者開展HTLV 的篩查工作[6]。 目前，我國采供血機構對獻血者的抗-HTLV-Ⅰ、Ⅱ的篩查均采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，本研究通過對廣州地區(qū)無償獻血者抗-HTLVⅠ/ⅡELISA 檢測反應性的標本進行免疫印跡法(Western blotting，WB)確證，采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 檢測S/CO 值與WB 確證試驗結果的相關性與陽性預測值，旨在更好地選擇HTLV 監(jiān)測方法提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2016 年7 月—2022 年8 月廣州血液中心無償獻血者標本共2 223 225 份，EDTA-K2抗凝全血標本5 mL，2 000×g 離心5 min，血漿作血清學篩查，長期血漿保存于低溫冰箱(-30℃以下)。 參與本次研究的獻血者均簽訂了知情同意書，本次研究也獲得廣州血液中心倫理委員會的批準【廣州血液中心醫(yī)倫[2023]第033 號】。

1.2 試劑與儀器 抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 試劑(北京萬泰公司，批號:T20160101—T20220202B)，HTLV BLOT 2.4(MPBiomedicals 公 司， 批 號: AK9013—AK1008 )。 Microlab STAR8CH 全 自 動 加 樣 儀(HAMILTON 公 司)， Microlab FAME24/30 全自動酶免分析儀(HAMILTON 公司)，Multiskan MK3 酶標分析儀(Thermo Fisher 公司)、URANUS AE 288S 一體機(深圳愛康公司)。 所有試劑均在有效期內使用，儀器設備均按照要求操作，進行定期維護和校準。

1.3 方法 使用HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 試劑對獻血者標本進行篩查，初篩檢測呈反應性的標本進行單試劑雙孔檢測，雙孔均為陰性者則為初篩試驗陰性，雙孔為陽性則為初篩反應性，記錄各篩查試驗的S /CO 值。 抗體初篩呈反應性的標本均采用WB 進行確證，結果陽性的判定為HTLV 陽性，結果陰性的判定為HTLV 陰性，結果不確定則為不確定性，同時對獻血者進行隨訪。 檢測抗-HTLV 試驗過程嚴格按照其試劑說明書及廣州血液中心實驗的相關SOP 進行操作。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS26.0 軟件建立數據庫，同時以WB 確證結果作為HTLV 感染陽性的確證標準，繪制ROC 曲線，利用ROC 曲線尋找S/CO 最佳診斷臨界值；當Youden 指數(Youden 指數＝靈敏度＋特異度-1)最大時，其對應的S/CO 值為最佳閾值，用CI 表示95%的置信區(qū)間。 分析在最佳S/CO 閾值下試劑的靈敏度和特異度，計算其對確證試驗結果的預測率，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 獻血者標本抗-HTLV ELISA 檢測與WB 確證結果2016 年7 月—2022 年8 月區(qū)間廣州血站共篩查了獻血者2 223 225人次。 共395 份獻血者標本抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA檢測反應性，初篩陽性率為18/10 萬(395/2 223 225)。 395份初篩反應性標本經WB 確證有25 份為HTLV 陽性，不確定性為16 份，確診陽性率為6.33%(25/395)。 廣州地區(qū)獻血者中HTLV 的感染率約為1.1/10 萬(25/2 223 225)。

2.2 抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 檢測的S/CO 值與確證試驗結果相關性 繪制ROC 曲線分析:抗-HTLV ELISA 檢測的S/CO值ROC 曲線下面積為0.938(P＜0.05)，Youden 指數為0.801，此時S/CO 值為3.789，靈敏度為92.00%，特異度為80.10%；95%CI:0.885～0.990，見如圖1。 因此抗-HTLV ELISA 檢測的S/CO 值≥3.789 時，對WB 確證試驗的陽性預測率為35%，當S/CO 值＜3.789 時，其陰性預測率為99.4%，見表1。

圖1 抗-HTLV ELISA 檢測S/CO 值的ROC 曲線

表1 抗-HTLV ELASA 檢測的S/CO 值與WB 確證結果的相關性n(%)

2.3 WB 確證結果陽性、陰性、不確定性與ELISA 檢測S/CO值的對比 確證陽性標本S/CO 均值、中位數與確證陰性標本、不確定標本比較存在差異(P＜0.05)，見表2，提示標本ELISA 檢測S/CO 值越高，WB 確證試驗陽性率相對應越高。

表2 ELASA 檢測反應性標本S/CO 值分布

3 討論

HTLV 在全球范圍均有發(fā)現，各地區(qū)流行情況差異較大[7]。 日本于1984 年開始對獻血者進行篩查，其人群流行率高達0.66%～1.02%[8]。 其他發(fā)達國家如美國、法國，其感染率較低，分別為0.025 0%[9]、0.005 6%[10]。 我國HTLV 的流行區(qū)域主要集中在東南沿海城市，王惠榕等[11]、張秋文等[12]對我國福建寧德地區(qū)HTLV 感染情況作了早期報道。HTLV 流行情況調查主要是通過對獻血人群進行篩查，加拿大、美國、韓國、法國，以及中國香港特別行政區(qū)、中國澳門特別行政區(qū)、中國臺灣地區(qū)等已將HTLV-Ⅰ篩查列入獻血者常規(guī)篩查項目[7]。 目前我國大陸地區(qū)并未將HTLV 納入獻血者的法定常規(guī)篩查項目，僅于2015 年底提出對福建、廣東、浙江3 省獻血者進行全面篩查，其他各省、市按照10%比例進行獻血者抽樣篩查。

目前我國常見的HTLV 檢測方法主要為血清學與核酸檢測，血清學檢測方法以雙抗原夾心ELISA 為主，按方法學分有一步法和兩步法，確證方法則主要為WB 確證試驗。 對于無償獻血者這類低危感染人群，由于被檢者體內存在與被檢測病原體無關的非特異性抗原抗體，往往會造成WB 確證結果不確定。 國外研究表明，出現“不確定”確證結果的受檢者在半年內隨訪中一般轉為陰性，或繼續(xù)保持不確定性，即為假陽性，故在陰性預測值計算中，把不確定結果等同于陰性[13]。 在本研究中確證陽性率為6.32%(25/395)，與同屬于低流行區(qū)域的廣東省深圳市(6.06%，2/33)[14]、廣東省中山市(3.2%，4/125)[15]、北京市(7.7%，2/26)[16]、天津市(5.3%，1/19)[17]差異不大，低于高流行區(qū)域福建省(26.8%，254/947)[18]。 本研究采用ELISA 法(一步法)對獻血者標本進行篩查，非特異性抗體可引起假陽性反應率較高[19]，這與文獻報道ELISA 試劑的S/CO 值與陽性率呈正相關[20-21]相符。 有文獻報道2 種梅毒篩查ELISA 檢測對應的S/CO 值分別≥9 以及≥5 時，梅毒確認陽性率超過95%[20]；抗-HCV ELISA 檢測S/CO 值＞3.8 時，陽性預測率達95%以上[21]。 我們通過對獻血者抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 檢測反應性結果S/CO 值進行比對，同時繪制ROC 曲線分析抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 檢測S/CO 值與WB 確證試驗結果的相關性，綜合考慮陽性預測率和陰性預測率，選用Youden 指數最大所對應的S/CO 值作為報告確證陽性的參考閾值，得出ELISA 檢測最佳S/CO 值為3.789。 S/CO 值＜3.789 時其陰性預測率為99.4%，當S/CO 值為≥10 其確證陽性預測率可達71.4%。驗證結果陽性的S/CO 值與陰性的S/CO 值比較有差異(P＜0.05)，此結果與歐山海[22]結論一致。 在確證陽性的標本中，有2 份ELISA 反應性標本S/CO 值＜3.789，獻血者很可能為初期感染，HTLV 病毒載量較低，抗體滴度較低。 ELISA 法存在檢測結果假陽性的問題很難避免，用WB 進行確證就很有必要。 歐山海等[18]研究指出，HTLV 初篩同一試劑假陽性率跟當地流行率有關系，同一試劑在流行率較高的地區(qū)如寧德市，抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 檢測S/CO 值＞4 或5 時，其初篩試驗的驗證陽性率高達90%，而在HTLV 流行率較低的漳州市，其S/CO 值＞4 時驗證陽性率為33.3%，S/CO 值＞5 時驗證陽性率則為57.1%。 本地區(qū)2016—2022 年確診陽性率為1.1/10 萬，低于福建省寧德市的184.4/10 萬，福建省漳州市的3.7/10 萬，屬于低流行區(qū)域，初篩假陽性率高[18]。 周曉真等[19]的研究指出，使用2 種抗-HTLV ELISA 試劑(北京萬泰、意大利索尼)檢測出的雙試劑反應性標本，HTLV 確證試驗均為陽性。 由于WB 確認試劑昂貴，供應有限，操作復雜，很難普及使用。 因此，我們認為對于初篩反應性標本，可用另一廠家的ELISA 試劑進行復核，對于單試劑檢測S/CO 值＜3.789 可認為其為假陽性，對雙試劑檢測反應性標本或S/CO 值＞3.789 進行確證試驗。 確證試驗結果為“不確定”的16 名獻血者中僅有1 名進行歸隊復查，結果為陰性；本課題組將繼續(xù)對余下15 名“不確定”的獻血者追蹤隨訪。

綜上所述，S/CO 值的診斷閾值能為我們提供一個預估參考指標，對可疑ELISA 結果可以作一個初步判斷。 廣州地區(qū)獻血人群HTLV 流行率較低；抗-HTLV-Ⅰ/ⅡELISA 試劑檢測假陽性率較高，確證試驗很有必要。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。