牛病毒性腹瀉病毒LAMP-LFD檢測方法的建立及初步應(yīng)用

鄭如雯,黃 濤*,吳道義,禹光美,李芳芳,隋 鑫,閔婷玉

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025;2.畢節(jié)市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所,畢節(jié) 551700)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是引起牛病毒性腹瀉-黏膜病(bovine viral rapid-mucosal disease,BVD-MD)的病原,屬于黃病毒科瘟病毒屬,主要感染牛,也可感染豬、羊等其他動物[1-2]。BVDV感染可造成牛免疫障礙并引發(fā)出血性感染,引起嚴(yán)重的消化道黏膜糜爛壞死、胃腸炎、腹瀉等癥狀[3],妊娠母牛感染BVDV可導(dǎo)致繁殖障礙,包括產(chǎn)奶量下降,流產(chǎn)、胎兒生長緩慢及胎兒畸形等[4]。各年齡段的牛對此病毒都易感,其中幼齡牛易感性最高。更重要的是,此病毒會引起牛群中犢牛持續(xù)感染并不斷向外界輸出病毒,造成疾病的大范圍傳播,給畜牧業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失[5]。本文研究建立了一種針對BVDV的快速、簡便的診斷方法,旨在為臨床診斷BVDV提供參考依據(jù)。

LAMP檢測技術(shù)是一種在恒溫條件下利用鏈置換DNA聚合酶實現(xiàn)核酸快速擴(kuò)增的方法[6]。LAMP的原理是利用BstDNA聚合酶的鏈置換特性,在靶基因的6個特定區(qū)域設(shè)計的4對引物,在一定的溫度下能識別靶基因的6個位點并能連續(xù)對其進(jìn)行替換的過程,LAMP檢測方法靈敏度高、特異性好、用時短且操作簡單[7-8]。目前已經(jīng)有文獻(xiàn)顯示牛病毒性腹瀉病毒LAMP檢測方法比很多傳統(tǒng)方法如PCR、ELISA等檢測方法更快捷[9]。本試驗將擴(kuò)增速度快、靈敏度高的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)與能現(xiàn)場觀察結(jié)果的橫向流動試紙條相結(jié)合建立可視化的LAMP-LFD檢測技術(shù)[10],該技術(shù)的原理是利用生物素標(biāo)記的LAMP產(chǎn)物與異硫氰酸熒光素的DNA探針進(jìn)行雜交,可在5 min內(nèi)于LFD上完成顯色和結(jié)果判斷,LAMP-LFD僅需水浴鍋或常規(guī)加熱儀器就可快速檢測目的基因,無需復(fù)雜精密的儀器,大大縮短了檢測的成本和時間,該技術(shù)適用于基層和小型企業(yè),具有良好的應(yīng)用前景。

由于BVDV的5′非翻譯區(qū)(5′UTR)是最保守的區(qū)域之一[11-13],因此該基因常常用于診斷BVDV感染[14]。本研究依據(jù)保守區(qū)段設(shè)計了1套LAMP引物和1條FITC標(biāo)記探針,通過對各反應(yīng)條件的優(yōu)化建立了BVDV的LAMP-LFD檢測方法,同時與常規(guī)PCR在敏感性和臨床樣本的檢出符合率方面進(jìn)行比較研究,旨在為臨床BVDV感染的診斷提供一種新型的快速檢測手段。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及試劑

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)O型、牛流行熱病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV),牛皰疹病毒1型(bovine herpesvirus 1,BoHV-1)、52份BVDV牛血清均由貴州大學(xué)動物疫病研究室保存;Bst DNA2.0聚合酶購自NEB公司;橫向流動試紙條購自Millenia Biotec GmbH公司;dNTP Mix、RNA提取試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。牛病毒性腹瀉病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUC57-5′UTR(287 bp)由貴州省動物疫病研究室前期構(gòu)建并保存。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI中GenBank公布的BVDV的5′UTR基因(GenBank登錄號:AY278 559.1),利用Meg Align分析其保守區(qū)序列,應(yīng)用Primer Explore V5在線軟件設(shè)計4條用于LAMP擴(kuò)增的特異性引物,分別如下:外引物BVDV-F3/BVDV-B3、內(nèi)引物BVDV-FIP/BVDV-BIP,在上游內(nèi)引物BVDV-FIP的5′端用BIO標(biāo)記;同時設(shè)計合成1條經(jīng)FITC標(biāo)記的特異性探針BVDV-HP,用于LFD的雜交試驗(表1)。以上引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,探針由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

利用質(zhì)粒小提試劑盒提取pUC57-5′UTR陽性質(zhì)粒作為DNA模板,建立LAMP反應(yīng)體系,總體積為25 μL:1 μL Bst DNA 2.0聚合酶(8 U·μL-1), 2.5 μL 10×等溫擴(kuò)增緩沖液, 3 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1), 2 μL MgSO4(100 mmol·L-1), BVDV-F3/BVDV-B3各2.5 μL, BVDV-FIP/BVDV-BIP各0.5 μL, 1 μL DNA模板,以及9.5 μL ddH2O。LAMP反應(yīng)結(jié)束后,立即取出反應(yīng)管置于冰盒中終止反應(yīng)。取10 μL反應(yīng)液與190 μL ddH2O混合均勻。將橫向流動試紙條的樣本端插入混合液中進(jìn)行反應(yīng)并于5 min之內(nèi)讀取試驗結(jié)果。

1.3.1 溫度優(yōu)化 將上述反應(yīng)體系分別在溫度為61、62、63、64、65、66 ℃的條件擴(kuò)增反應(yīng)1 h后,經(jīng)80 ℃終止反應(yīng)5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳反應(yīng)溫度。

1.3.2 時間優(yōu)化 保持其他條件不變,對反應(yīng)體系的時間進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)初始時間為10 min,間隔10 min為一個刻度進(jìn)行優(yōu)化(10、20、30、40、50、60 min),反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳反應(yīng)時間。

1.3.3 聚合酶濃度優(yōu)化 保持其他條件不變,對聚合酶濃度進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)置Bst DNA 2.0聚合酶濃度分別為80、160、240、320、400、480 U·mL-1進(jìn)行擴(kuò)增,取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳聚合酶濃度。

1.3.4 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化 保持其他條件不變,對內(nèi)外引物濃度比進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)置內(nèi)外引物濃度比分別為1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1進(jìn)行擴(kuò)增,取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳內(nèi)外引物濃度比。

1.3.5 dNTP Mix濃度優(yōu)化 保持其他條件不變,對dNTP Mix濃度進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)置dNTP Mix濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol·L-1進(jìn)行擴(kuò)增,取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳dNTP Mix濃度。

1.3.6 Mg2+濃度優(yōu)化 保持其他條件不變,對Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)置Mg2+濃度分別為2、4、6、8、10 mmol·L-1進(jìn)行擴(kuò)增,取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定最佳Mg2+濃度。

1.4 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的LFD檢測

對LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化后,使用BIO標(biāo)記的探針進(jìn)行LAMP反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束時不經(jīng)過終止反應(yīng),在反應(yīng)體系中加入濃度為20 pmoL探針RA-HP 2 μL,63 ℃雜交5 min。雜交結(jié)束后,從反應(yīng)液中取8 μL雜交液加入到100 μL緩沖液中混勻,將試紙條浸入其中,靜置3 min觀察質(zhì)控線與檢測線的顏色變化。

1.5 LAMP-LFD特異性試驗

根據(jù)RNA提取試劑盒提取FMDV、BEFV、BoHV-1的RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用上述優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)條件,設(shè)立陰性對照,分別以pUC57-5′UTR的DNA及上述cDNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,再取反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及LFD分別進(jìn)行檢測,分析本研究建立的LAMP-LFD檢測方法的特異性。

1.6 LAMP-LFD敏感性試驗

將提取的pUC57-5′UTR質(zhì)粒DNA并測量其濃度,根據(jù)拷貝數(shù)計算公式:(6.02×1023拷貝·mol-1)×質(zhì)粒濃度(ng·μL-1)×10-9/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)=拷貝數(shù)(copies)·μL-1,計算所提取的質(zhì)粒pUC57-5′UTR拷貝數(shù)并將其稀釋至107～100拷貝·μL-1,以濃度分別為1.9×107～1.9×100拷貝·μL-1的質(zhì)粒為模板,以無菌ddH2O為陰性對照,用上述優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)LFD進(jìn)行檢測,同時將相同模板利用BVDV-F3/BVDV-B3特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 35個循環(huán);72 ℃ 10 min, 終止反應(yīng)后取反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。分析本研究建立的LAMP-LFD檢測方法和PCR檢測方法的敏感性。

1.7 BVDV的臨床應(yīng)用及檢測

將采集的52份臨床疑似BVDV感染樣品提取RNA,再反轉(zhuǎn)錄為cDNA分別進(jìn)行LAMP-LFD和PCR檢測(PCR擴(kuò)增所用引物為BVDV-F3/BVDV-B3,預(yù)擴(kuò)增片段為225 bp),分析兩種檢測方法的檢測結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 LAMP的反應(yīng)溫度的優(yōu)化

為優(yōu)化LAMP反應(yīng)溫度,設(shè)置6組反應(yīng)溫度(61～66 ℃)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖1所示,反應(yīng)溫度為64 ℃時,條帶最為清晰明亮,所以選用64 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

2.2 LAMP的反應(yīng)時間的優(yōu)化

為優(yōu)化LAMP反應(yīng)時間,設(shè)置6組反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖2所示,反應(yīng)時間為40 min時,條帶最為清晰明亮,所以選用40 min作為最佳反應(yīng)時間。

2.3 LAMP的Bst DNA 2.0聚合酶濃度的優(yōu)化

為優(yōu)化LAMP的Bst DNA 2.0聚合酶濃度,設(shè)置6組聚合酶濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖3所示,Bst DNA 2.0聚合酶濃度為320 U·μL-1時,條帶最為清晰明亮,所以選用320 U·μL-1作為反應(yīng)的最佳Bst DNA 2.0聚合酶濃度。

M. DL 2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); NC. 陰性對照; 1～6. 80、160、240、320、400、480 U·μL-1 Bst DNA 2.0聚合酶 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-6. 80, 160, 240, 320, 400, 480 U·μL-1 Bst DNA 2.0 polymerase圖3 LAMP Bst DNA 2.0聚合酶濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization results of Bst DNA 2.0 polymerase concentration

2.4 LAMP的內(nèi)外引物濃度比的優(yōu)化

為優(yōu)化LAMP的內(nèi)外引物濃度比,設(shè)置6組內(nèi)外引物濃度比進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖4所示,內(nèi)外引物濃度比濃度為4∶1時,條帶最為清晰,所以選用4∶1作為反應(yīng)的最佳內(nèi)外引物濃度比。

M. DL 2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); NC. 陰性對照; 1～5. 濃度比分別為1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-5. Concentration ratio were 1∶1, 2∶1, 4∶1, 8∶1, 16∶1, respectively圖4 LAMP 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization results of lamp concentration ratio between internal and external primers

2.5 LAMP的dNTP Mix濃度的優(yōu)化

為優(yōu)化LAMP的dNTP Mix濃度,設(shè)置6組dNTP Mix濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖5所示,dNTP Mix濃度為1.0 mmol·L-1,條帶最為清晰,所以選用1.0 mmol·L-1作為反應(yīng)的最佳dNTP Mix濃度。

M. DL 2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); NC. 陰性對照; 1～6. 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol·L-1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-6. 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 mmol·L-1圖5 LAMP dNTP Mix濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimization results of dNTP Mix concentration

2.6 LAMP的Mg2+濃度的優(yōu)化

為優(yōu)化LAMP的Mg2+濃度,設(shè)置5組Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖6所示,Mg2+濃度為4 mmol·L-1,條帶最為清晰,所以選用4.0 mmol·L-1作為反應(yīng)的最佳Mg2+濃度。

M. DL 2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); NC. 陰性對照; 1～5. 2、 4、 6、 8、 10 mmol·L-1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1-5. 2,4,6,8,10 mmol·L-1圖6 LAMP Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optimization results of Mg2+ concentration

根據(jù)上述條件進(jìn)行優(yōu)化后,LAMP最佳反應(yīng)體系:1 μL Bst DNA 2.0聚合酶(320 U·μL-1),2.5 μL 10×等溫擴(kuò)增緩沖液,2.5 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1),1 μL MgSO4(4 mmol·L-1),BVDV-F3/BVDV-B3各2 μL,BVDV-FIP/BVDV-BIP各1 μL,1 μL DNA模板,11 μL ddH2O;64 ℃反應(yīng)40 min。

2.7 LAMP-LFD特異性試驗

分別以pUC57-5′UTR的DNA及BVDV、FMDV、BEFV、BoHV-1的cDNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果顯示,以pUC57-5′UTR為模板的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳及LFD檢測的結(jié)果為陽性,其他模板及陰性對照均呈陰性(圖7),結(jié)果表明該方法特異性強(qiáng)。

M. DL 2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); NC. 陰性對照; 1. BVDV; 2. FMDV; 3. BEFV; 4. BoHV-1 M. DL 2000 DNA marker; NC. Negative control; 1. BVDV; 2. FMDV; 3. BEFV; 4. BoHV-1圖7 LAMP-AGE(A)和LAMP-LFD(B)的特異性檢測結(jié)果Fig.7 Specific detection results of LAMP-AGE(A) and LAMP-LFD(B)

2.8 LAMP-LFD敏感性試驗

對提取的pUC57-5′UTR質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋,以濃度1.9×107～1.9×100拷貝·μL-1的質(zhì)粒為模板,以無菌ddH2O為陰性對照,并在優(yōu)化條件上進(jìn)行LAMP擴(kuò)增及普通PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳的檢測最低模板濃度為1.9 ×103拷貝·μL-1; LAMP擴(kuò)增后,LFD的檢測最低模板濃度為1.9×101拷貝·μL-1(圖8)。結(jié)果表明,LAMP-LFD的敏感性較高。

2.9 臨床病料檢測

利用本研究建立的LAMP-LFD方法和PCR方法對臨床52份疑似感染牛病毒性腹瀉病毒的病料進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示(圖9),兩種檢測方法的陽性樣本數(shù)均為5份,檢測符合率為100%(表2),表明本研究所建立的LAMP-LFD方法可應(yīng)用于臨床實踐。

表2 BVDV LAMP-LFD檢測方法的臨床應(yīng)用Table 2 Clinical application of BVDV LAMP-LFD

3 討 論

隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速增長和人們生活質(zhì)量的提高,對畜禽產(chǎn)品的需求增加,促進(jìn)了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為了提高養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益,不僅需要引進(jìn)先進(jìn)的養(yǎng)殖技術(shù),還需要做好動物疾病的防控工作[15]。BVDV是常見一種傳染性較強(qiáng)的病毒性疾病。近年來,BVDV在我國西北、西南、華北、東北等地區(qū)流行,呈廣泛流行趨勢[16]。BVDV不僅可在不同年齡階段的牛群中快速傳播,還會感染豬、羊等其他動物,造成的一定的經(jīng)濟(jì)損失,故建立一種快速、簡單、可靠的檢測方法對控制BVDV傳播非常重要。

目前針對BVDV的檢測方法有PCR、qPCR、ELISA、競爭性阻斷酶聯(lián)免疫測定法以及RT-LAMP等[17-20],最常用于BVDV檢測的分子生物學(xué)方法為PCR擴(kuò)增,但這些檢測方法需要配備價格昂貴的專業(yè)檢測設(shè)備,基層推廣存在很大難度。LAMP應(yīng)用廣泛,耗時短、敏感度高,但單一的LAMP技術(shù)需要采用鈣黃綠素測定、瓊脂糖凝膠電泳、焦磷酸鎂的濁度測量及熒光染料檢測等步驟來判定,這些檢測技術(shù)的操作條件要求比較高,在基層會受限于設(shè)備條件或耗時過長等原因而不能廣泛應(yīng)用。另外,鈣黃綠素需要低溫保存,運輸成本較高,目視熒光檢測判定方法中使用的一些染料如SYBR Green可與擴(kuò)增產(chǎn)物核酸結(jié)合,影響擴(kuò)增產(chǎn)物量[21],以上方法均不能區(qū)分特異與非特異性擴(kuò)增。與單一的LAMP方法相比,LAMP-LFD檢測不需要鈣黃綠素,解決了鈣黃綠素的運輸問題,不需要瓊脂糖凝膠電泳,同時也不需要如PCR儀、熒光顯微鏡等特殊儀器,柴書軍等[22]建立的應(yīng)用于豬細(xì)小病毒7型檢測的LAMP-LFD法,檢測時間只需60 min;楊倩等[23]建立的應(yīng)用于羊口瘡病毒檢測的LAMP-LFD法,檢測時間只需40 min。孫盼盼等[24]建立的豬支原體肺炎LAMP-LFD快速檢測方法,從基因組DNA提取到LFD結(jié)果判斷只需40 min左右。LAMP-LFD檢測方法所需時間比常規(guī)PCR短,只需恒溫水浴即可完成。同時,LFD檢測方法對LAMP結(jié)果的判定是基于序列間特異性雜交,利用FITC標(biāo)記探針與BIO標(biāo)記LAMP產(chǎn)物特異性結(jié)合,可以在較短時間內(nèi)得到直觀正確的結(jié)果。

本研究通過將LAMP與LFD結(jié)合,建立了一種快速有效的LAMP-LFD檢測BVDV的方法,用此方法對BVDV及其他樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)除pUC57-5′UTR質(zhì)粒DNA為陽性外,其余均為陰性,表明該方法特異性較強(qiáng);同時,LAMP-LFD檢測BVDV的靈敏度為1.9×101拷貝·μL-1,比傳統(tǒng)PCR方法靈敏度高;此外,本研究還優(yōu)化了溫度、反應(yīng)時間Mg2+濃度、dNTP 濃度等反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,優(yōu)化后的LAMP能在40 min內(nèi)有效地完成擴(kuò)增;應(yīng)用LAMP-LFD對52例疑似BVDV感染的樣本進(jìn)行測試,確定5例為BVDV陽性,與PCR檢測結(jié)果符合率為100%,表明LAMP-LFD可應(yīng)用于BVDV的臨床檢測。

4 結(jié) 論

本研究成功建立了用于BVDV快速檢測的LAMP-LFD方法,特異性強(qiáng),檢測時間短,操作簡單,靈敏性高,可作為一種新型檢測方法應(yīng)用于現(xiàn)場及基層檢測,對于開發(fā)BVDV感染的新型診斷技術(shù)具有良好發(fā)展前景。