馬立克病病毒單克隆抗體庫構(gòu)建及gB蛋白特異性單抗的篩選與鑒定

李林燕,滕 蔓,劉金玲,鄭鹿平,柴書軍,丁 軻,余祖華*,羅 俊*

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院,功能微生物與畜禽健康實(shí)驗(yàn)室,洛陽 471003;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物 免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450002; 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,中英禽病國際研究中心,鄭州 450002)

馬立克病(Marek’s disease,MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)早期感染雛雞引起的一種重要的家禽免疫抑制病和淋巴細(xì)胞增生性腫瘤病,通常以外周神經(jīng)、虹膜、皮膚以及多種內(nèi)臟器官組織的單核細(xì)胞浸潤為特征。1907年,Marek首次報道該病,并對主要的臨床癥狀和剖檢病變進(jìn)行了描述[1]。1961年,為了紀(jì)念Jozef Marek的貢獻(xiàn),Biggs建議使用Marek’s disease來命名該病[2]。MDV感染不僅可引起嚴(yán)重的免疫抑制、增加其它疫病繼發(fā)感染的風(fēng)險,而且誘發(fā)腫瘤導(dǎo)致大批雞死亡,更是給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。MDV的體內(nèi)感染可分為4個階段:第一階段為早期溶細(xì)胞性復(fù)制階段,此時病毒主要?dú)馨图?xì)胞并引起暫時性或持續(xù)性的免疫抑制,該過程主要取決于病毒株的毒力;第二階段為潛伏感染階段,在感染6～7 d之后,病毒感染進(jìn)入潛伏期,此時不再檢測到溶細(xì)胞性復(fù)制,且腫瘤尚未發(fā)生;第三階段為晚期溶細(xì)胞性復(fù)制階段,此階段并不一定都發(fā)生,其發(fā)展及程度取決于宿主的抗病力和MDV毒株的毒力;第四階段最終形成淋巴瘤或不形成淋巴瘤[3-4]。

MDV屬于α皰疹病毒亞科,馬立克病病毒屬。與MD相關(guān)的家禽皰疹病毒主要包括3種:禽皰疹病毒2型(血清1型,MDV-1)、禽皰疹病毒3型(血清2型,MDV-2)和火雞皰疹病毒1型(血清3型,MDV-3/HVT)[5]。除減毒疫苗株之外,只有MDV-1野毒株對宿主具有致病性和致瘤性。按照毒力差異,MDV-1分離株又可分為不同的致病型,包括溫和毒型(mild MDV,mMDV)、強(qiáng)毒型(virulent MDV,vMDV)、超強(qiáng)毒型(very virulent MDV,vvMDV)和特超強(qiáng)毒型(very virulent plus MDV,vv+MDV)[6-7]。如CVI988和CU2毒株屬于mMDV[8-9],JM、GA和HPRS-16毒株屬于vMDV[10-12],Md5、RB-1B和GX0101屬于vvMDV[13-15],648A和625毒株屬于vv+MDV[6]。MD是人類歷史上利用病毒疫苗免疫預(yù)防腫瘤疾病發(fā)生的首個成功案例。但是,隨著MD疫苗在全球長期廣泛的使用,MDV流行毒株的毒力持續(xù)增強(qiáng),目前vv+MDV和變異株的出現(xiàn)已導(dǎo)致MD疫苗免疫保護(hù)失敗,近些年國內(nèi)外MD疫情頻繁暴發(fā),給世界養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展帶來新的挑戰(zhàn)[16-19]。

MD的早期診斷對于該病的有效防控和及時止損至關(guān)重要。MD診斷的經(jīng)典方法包括病毒分離培養(yǎng)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等。最近10年,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、實(shí)時熒光定量PCR、重組酶聚合酶擴(kuò)增等分子生物學(xué)技術(shù)手段相繼建立[20]。其中,ELISA因操作簡單、檢測快速、敏感性高、特異性強(qiáng),在動物疫病診斷中的應(yīng)用最為成熟。抗體制備是建立ELISA方法和開發(fā)試劑盒的重要基礎(chǔ)。1982年,Ikuta等[21]首次利用親和色譜法純化了MDV-1和HVT感染CEF培養(yǎng)物作為免疫原,結(jié)合細(xì)胞融合技術(shù)制備了MDV和HVT的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫,并利用不同方法進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定和分析。1983年,Lee等[22]用自己研制的單克隆抗體,進(jìn)行了MDV分離株的血清型分類和鑒定。我國在MDV單抗研制方面起步較晚,直到20世紀(jì)80年代末才開始有學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究,如利用MDV全病毒制備免疫原免疫小鼠制備了一些單克隆抗體等,但并未對其進(jìn)行深入鑒定和應(yīng)用[23-24]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,有學(xué)者相繼用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)MDV編碼的gB、gI和pp38蛋白[25],Meq蛋白[26-27]以及gE蛋白[28]等作為免疫原制備相應(yīng)的單克隆抗體。由于MDV基因組比較龐大,編碼上百種病毒蛋白和非編碼RNA[29-30],但目前國內(nèi)外已報道且可有效利用的單克隆抗體還非常少,難以滿足MDV基因功能、致病與致瘤機(jī)制等相關(guān)基礎(chǔ)研究和MD診斷技術(shù)開發(fā)的需求。因此,本研究利用MDV嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合增殖特性,分別制備MDV感染CEF細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白免疫原,建立了特異性針對MDV編碼的全病毒蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫,并從中篩選和鑒定特定病毒蛋白的特異性單克隆抗體,以期為后續(xù)相關(guān)研究提供關(guān)鍵試劑。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動物

MDV疫苗株CVI988、SB-1和HVT,均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。vvMDV標(biāo)準(zhǔn)毒株Md5和GX0101,由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授惠贈。293 T細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞,均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。用于制備CEF的SPF 種蛋,購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。6～8周齡純系雌性BALB/c小鼠,購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 培養(yǎng)基、抗體和試劑

M199培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS),購自Gibco公司。1640培養(yǎng)基、蛋白預(yù)制膠、DAPI溶液(即用型),均購自Solarbio公司。NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents、LipofectamineTM2000均購自Thermo Scientific公司。胰蛋白酶-EDTA、蛋白酶抑制劑(100×)和ECL顯色液,購自新賽美公司。雞MDV陽性血清和陰性血清,由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存。HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG、DyLight 488標(biāo)記羊抗鼠IgG、DyLight 594標(biāo)記羊抗鼠IgG以及DyLight 594標(biāo)記羊抗雞IgG,均購自Abbkine公司。羊抗鼠β-actin內(nèi)參抗體,購自安諾倫(北京)生物科技有限公司。Western blot膜再生液,購自Solarbio公司。小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒,購自Proteintech公司。切向流超濾離心管,購自 Millipore公司。MDV-1 gB蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-gB-N1,根據(jù)vvMDV標(biāo)準(zhǔn)毒株Md5(NCBI參考序列:NC_002 229.3)的gB基因全長序列(2 598 bp)進(jìn)行密碼子優(yōu)化,由上海尚亞生物科技有限公司設(shè)計、合成并構(gòu)建。

1.3 病毒增殖

取8～10 日齡SPF雞胚制備CEF,細(xì)胞計數(shù)后用含5% FBS的M199細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋,按每瓶15 mL (含8×106個細(xì)胞)接種至T75細(xì)胞瓶中,置于38.5 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置,過夜培養(yǎng)。待CEF長至匯合單層后,更換含1% FBS的M199細(xì)胞維持液,并接種vvMDV毒株Md5,感染96 h待出現(xiàn)大量病毒噬斑后,胰蛋白酶-EDTA消化,1 500 r·min-1離心10 min,收集病毒感染的CEF沉淀備用。

1.4 蛋白制備

用PBS重懸細(xì)胞團(tuán),轉(zhuǎn)移至15 mL離心管,離心后棄凈PBS。用NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extracton Reagents提取病毒感染CEF的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白,簡述如下:首先加入10 mL冰浴的CER Ⅰ(加100 μL 100 ×蛋白酶抑制劑),大力渦旋15 s充分混懸細(xì)胞,冰上孵育10 min;然后加入500 μL冰浴的CER Ⅱ,高速渦旋5 s,冰上孵育1 min;再次高速渦旋5 s,16 000 r·min-1、4 ℃離心5 min。吸取上清,轉(zhuǎn)至預(yù)冷的新離心管中,即為胞質(zhì)提取物。剩余沉淀再次離心,16 000 r·min-1、4 ℃離心5 min,棄凈上清。加入50 mL冰浴的NER(加50 μL 100×蛋白酶抑制劑),渦旋混勻15 s,冰浴10 min,再渦旋15 s,重復(fù)4次。16 000 r·min-1、4 ℃離心10 min,立即轉(zhuǎn)移上清至冰浴的新離心管中,即為胞核提取物。最后,用切向流超濾離心管分別濃縮胞質(zhì)提取物和胞核提取物,分離制備免疫原蛋白。

1.5 動物免疫

將濃縮后的胞質(zhì)提取物和胞核提取物作為免疫原,分別免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠。初次免疫,將免疫原蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化,按50 μg·只-1的蛋白劑量頸背部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠。此后每隔3周,將免疫原蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行二免和三免,免疫方法和劑量與初免相同。三免后3周,采集免疫鼠尾靜脈全血,進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測多克隆抗體血清效價。

1.6 細(xì)胞融合

選取效價較高的免疫鼠,用總量為100 μg的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)蛋白腹腔注射進(jìn)行超免。3～5 d后,無痛處死超免小鼠,取脾細(xì)胞與生長狀態(tài)良好的SP2/0細(xì)胞,按常規(guī)方法進(jìn)行融合。細(xì)胞融合培養(yǎng)7 d后,可在顯微鏡下觀察雜交瘤細(xì)胞團(tuán)是否產(chǎn)生,待細(xì)胞團(tuán)長至細(xì)胞孔底面積2/3大小時,取50 μL雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行IFA檢測。

1.7 間接免疫熒光試驗(yàn)

CEF細(xì)胞計數(shù),用含5% FBS的M199培養(yǎng)基稀釋后,將細(xì)胞懸液按100 μL·孔-1(含4.5×104個細(xì)胞)鋪至96孔板中,置于38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜,待CEF長至致密單層后棄上清,換含1% FBS的M199細(xì)胞維持液,接種Md5病毒種。38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3 d。顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),待出現(xiàn)較小病毒噬斑時,棄去培養(yǎng)基,每孔加入50 μL預(yù)冷的甲醇/丙酮(1∶1)固定液,室溫固定10 min后棄凈固定液,用含0.05% Tween-20的PBS溶液(PBST)洗3次,甩凈PBST。每孔加入50 μL含5%脫脂奶的PBST,37 ℃溫箱封閉30 min,甩凈,PBST洗3次,甩凈。每孔加入50 μL雜交瘤細(xì)胞上清,37 ℃溫箱孵育30 min,甩凈,PBST洗3次,甩凈。每孔加入50 μL用5%脫脂奶PBS稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶500),37 ℃溫箱孵育30 min,甩凈,PBST洗3～5次,甩凈。每孔加100 μL PBST,剔除氣泡,置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。凡是細(xì)胞上清與CEF陰性對照發(fā)生染色反應(yīng)的雜交瘤一律丟棄,僅保留與MDV噬斑發(fā)生特異性陽性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞,用于進(jìn)一步的篩選和鑒定。

1.8 單克隆抗體血清型特異性鑒定

取僅與MDV噬斑發(fā)生特異性陽性反應(yīng)的的雜交瘤細(xì)胞株,按照有限稀釋法進(jìn)行2～3輪的單細(xì)胞亞克隆,純化并建立單克隆抗體細(xì)胞系。再次利用IFA方法,同“1.7”所述對雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行檢測,結(jié)果仍僅與MDV噬斑發(fā)生特異性陽性反應(yīng)且與CEF陰性對照無反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,凍存后置液氮中長期保存。留取的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞上清,分別用Md5、SB-1和HVT感染CEF,按“1.7”方法進(jìn)行IFA檢測,鑒定其對不同血清型毒株的交叉反應(yīng)性和特異性。

1.9 gB蛋白真核表達(dá)及IFA篩選鑒定

將293 T細(xì)胞鋪至24孔板,37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),待細(xì)胞長至50%左右匯合度時。按照LipofectamineTM2000說明書,將pEGFP-gB-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293 T 細(xì)胞,置于37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h,置熒光顯微鏡下觀察出現(xiàn)EGFP綠色熒光后,分別用雞MDV陽性血清、陰性血清和陽性雜交瘤細(xì)胞上清為待檢一抗,Dylight 594標(biāo)記的羊抗雞IgG或Dylight 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,按照“1.7”方法進(jìn)行IFA檢測,篩選gB蛋白特異性的陽性單克隆抗體。

1.10 單克隆抗體腹水制備及亞型鑒定

取無菌的液體石蠟,腹腔注射于經(jīng)產(chǎn)BALB/c母鼠,0.5 mL·只-1。1～2周后,腹腔接種單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞(3×106～6×106·只-1)。1周左右觀察小鼠腹部及精神狀態(tài),待小鼠腹部明顯膨大后,采集腹水,3 500 r·min-1離心10 min,吸取上清,-80 ℃保存?zhèn)溆谩８顾r按“1.7”方法進(jìn)行IFA測定,同時按照小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書,對所篩選到的陽性單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定。

1.11 共聚焦分析

CEF細(xì)胞計數(shù)后,用含5% FBS的M199培養(yǎng)基稀釋混勻,以2 mL·孔-1(含1.3×106個細(xì)胞)鋪至6孔板中,38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜,待CEF長至致密單層后棄上清,更換含1% FBS的M199細(xì)胞維持液并接種Md5病毒種。38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3 d。待顯微鏡下觀察出現(xiàn)典型病毒噬斑時棄去培養(yǎng)基,加胰蛋白酶-EDTA消化、收集、離心后,用含5% FBS的M199培養(yǎng)基重懸,以2 mL·孔-1(含3×105個細(xì)胞)鋪至Φ15 mm共聚焦培養(yǎng)皿中,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d,待細(xì)胞貼壁以后,棄去培養(yǎng)基并向每孔中加入500 μL甲醇/丙酮(1∶1)固定液,室溫固定10 min。棄凈固定液,PBST洗3次,棄凈PBST。每孔加入1 mL含5%脫脂奶的PBST,37 ℃溫箱封閉30 min。棄凈封閉液,PBST洗3次,棄凈。每孔加入500 μL 含5%脫脂奶的PBST稀釋的陽性單克隆抗體腹水(1∶10 000),37 ℃溫箱孵育30 min,棄凈,PBST洗3次,棄凈;每孔加入500 μL Dylight 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶1 000),37 ℃溫箱孵育30 min,棄凈,PBST洗3次,棄凈。每孔加入500 μL 含5%脫脂奶的PBST稀釋的雞MDV陽性血清或陰性血清(1∶1 600),37 ℃溫箱孵育30 min,棄凈,PBST洗3次,棄凈;每孔加入200 μL 含5%脫脂奶的PBST稀釋的Dylight 594標(biāo)記的羊抗雞IgG(1∶400),37 ℃溫箱孵育30 min,棄凈,PBST洗3～5次,棄凈。最后,每孔加入500 μL PBST稀釋的DAPI溶液(1∶1 000),室溫孵育10 min,棄凈,PBST洗3～5次,棄凈。每孔滴加1 mL PBST,剔除氣泡,置共聚焦熒光顯微鏡(LSM 800、Zeiss、德國)下觀察并記錄結(jié)果。

1.12 Western blot分析

收集Md5、SB-1和HVT感染的CEF和陰性對照細(xì)胞,分別加上樣緩沖液煮沸后離心,取上清點(diǎn)樣進(jìn)行SDS-PAGE,快速轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用含5%脫脂奶的PBST室溫封閉2 h,用待檢單克隆抗體腹水(1∶10 000)孵育,4 ℃冰箱過夜,PBST振搖洗滌3次,每次5 min。室溫孵育5%脫脂奶稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(1∶1 000),PBST 振搖洗滌3次,每次5 min。按照ECL顯色液使用手冊操作說明進(jìn)行顯色,凝膠自動成像儀(FUSION FX5、VILBER LOURMAT、法國)上掃描分析結(jié)果。取出顯色后的PVDF膜,加PBST振搖洗滌5 min取出,然后用5 mL Western blot膜再生液振搖洗滌10 min,棄去膜再生液后再用PBST振搖洗滌5 min。最后將PVDF膜再次按序孵育5%脫脂奶稀釋的羊抗鼠β-actin內(nèi)參抗體(1∶1 000)和HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(1∶1 000),ECL再次顯色后,置凝膠自動成像儀上掃描分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 免疫鼠血清多克隆抗體IFA效價測定

用Md5感染CEF,分別提取病毒/細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白,各免疫BALB/c小鼠3只。三免后3周采集小鼠尾靜脈全血,IFA測定多克隆抗體效價。結(jié)果顯示,兩種蛋白制備免疫原免疫小鼠均可產(chǎn)生特異性識別MDV噬斑的抗體,胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白免疫鼠大部分的IFA效價都很高、均可達(dá)到1∶3 200,并且前者較后者免疫效果更好(圖1)。

2.2 MDV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫的構(gòu)建及IFA篩選鑒定

各取胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白免疫的1號小鼠,分別超免后取脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞,按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合、鋪板及培養(yǎng)。經(jīng)過對雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行多輪的IFA染色篩選及單細(xì)胞亞克隆純化鑒定,共獲得 31 株穩(wěn)定分泌特異性識別MDV噬斑的單克隆雜交瘤細(xì)胞(表1),從而建立了一個MDV特異性的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫。統(tǒng)計顯示,由MDV感染CEF的胞質(zhì)蛋白免疫產(chǎn)生的陽性雜交瘤(編號1～26)占比達(dá)到83.9%,而由胞核蛋白免疫產(chǎn)生的陽性雜交瘤(編號27～31)僅占16.1%。分別用不同血清型MDV代表性毒株Md5、SB-1和HVT感染CEF,對表1列示的雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行IFA檢測。結(jié)果顯示,31株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞中,有4株(J-1F3-C6、J-5C3-F4、J-8B10-G11和J-4D9-C5)為MDV-1、MDV-2和HVT保守的陽性雜交瘤細(xì)胞,其余27株(87.1%)均為MDV-1特異性的陽性雜交瘤細(xì)胞(表1)。

2.3 MDV糖蛋白gB特異性單克隆抗體的篩選鑒定

用pEGFP-gB-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,真核表達(dá)MDV編碼的糖蛋白gB,然后分別以表1中列示的全部31株MDV陽性雜交瘤細(xì)胞上清、雞MDV陽性血清或陰性血清為一抗,以Dylight 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗雞IgG為二抗,進(jìn)行IFA染色。結(jié)果顯示,pEGFP-gB-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的各組293T細(xì)胞中均可觀察到EGFP的綠色熒光(圖2),說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并且均正常表達(dá)。31株待檢MDV陽性雜交瘤細(xì)胞上清中,命名為J-1F3-C6的細(xì)胞上清和雞MDV陽性血清一樣,可與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)的MDV糖蛋白gB產(chǎn)生特異性的紅色熒光染色、且與pEGFP-gB-N1轉(zhuǎn)染表達(dá)的EGFP綠色熒光完全重合,而在MDV陰性血清染色細(xì)胞中未見gB蛋白的特異性紅色染色(圖2)。上述結(jié)果表明,J-1F3-C6為特異性識別gB蛋白的單克隆抗體。

2.4 gB蛋白特異性單克隆抗體的制備及亞型鑒定

將 J-1F3-C6單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),腹腔注射經(jīng)產(chǎn)小鼠制備單克隆抗體腹水,然后用 MDV感染的CEF病毒噬斑和IFA染色測定單克隆抗體腹水的抗體效價。結(jié)果顯示,J-1F3-C6單克隆抗體腹水的IFA效價為 1∶25 600。同時用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示J-1F3-C6單克隆抗體的輕鏈型為Kappa、IgG亞型為IgG2a。

2.5 gB蛋白特異性單抗J-1F3-C6的應(yīng)用分析

分別用不同血清型的MDV毒株(包括MDV-1超強(qiáng)毒株Md5、GX0101、疫苗株CVI988和MDV-2疫苗株SB-1)以及HVT分別感染CEF,利用IFA染色檢測J-1F3-C6與不同來源的gB蛋白反應(yīng)譜。結(jié)果顯示,J-1F3-C6單克隆抗體與5種代表性毒株的病毒噬斑均呈現(xiàn)特異性陽性反應(yīng)(圖3)。共聚焦分析結(jié)果顯示,J-1F3-C6對Md5感染CEF中表達(dá)的gB蛋白綠色熒光染色主要集中在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),而雞MDV陽性血清對細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有一定程度的紅色熒光染色,并且這兩種熒光具有很好的重疊性(圖4)。進(jìn)一步對部分毒株感染的CEF培養(yǎng)物進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果顯示J-1F3-C6與Md5和HVT感染細(xì)胞樣品均呈現(xiàn)三個分子量大小明顯不同的特異性蛋白反應(yīng)條帶,而SB-1感染細(xì)胞樣品和CEF陰性對照中均無對應(yīng)的特異性蛋白反應(yīng)條帶(圖5)。

3 討 論

圖2 MDV糖蛋白gB特異性單克隆抗體的IFA篩選鑒定Fig.2 Screening and identification of monoclonal antibody specific for MDV glycoprotein gB by IFA staining

MDV基因組龐大,編碼上百種病毒蛋白,但目前可利用的單克隆抗體非常少,難以滿足MDV基因功能、致病機(jī)制以及診斷試劑等相關(guān)研究的需求。根據(jù)MDV嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合特性,本研究利用細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑,分別制備了MDV感染CEF的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白作為免疫原。該方法簡單快速、可操作性強(qiáng),僅需要1個T75細(xì)胞瓶培養(yǎng)的病毒培養(yǎng)物,即可制備足夠多次使用的小鼠免疫原蛋白。利用該方法提取的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白,雖然未經(jīng)過純化,但提取的蛋白中包含足夠多的MDV全病毒蛋白。相對于原核表達(dá)或真核表達(dá)的病毒蛋白,該方法提取的免疫原蛋白不僅可能包含病毒編碼的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白,而且它們的天然構(gòu)象能夠得以保持,避免了表達(dá)純化過程中對原有生物學(xué)結(jié)構(gòu)的破壞,比體外表達(dá)蛋白制備的免疫原更可靠。將提取的MDV感染細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白經(jīng)超濾濃縮后分別免疫小鼠,產(chǎn)生的免疫抗體效價高并且特異性強(qiáng),三免后小鼠血清多克隆抗體的IFA效價均可達(dá)到1∶3 200以上,說明該方法制備免疫原的可行性強(qiáng)。此外,利用該免疫原制備方法可以實(shí)現(xiàn)免疫一種抗原即可獲得針對多種不同病毒蛋白、構(gòu)建MDV單克隆抗體庫的要求。最終,通過細(xì)胞融合并結(jié)合IFA染色的特異性篩選方法,成功構(gòu)建了一個包含31個MDV特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的抗體庫,說明本研究采取的技術(shù)路線和方法非常成功。統(tǒng)計結(jié)果顯示,上述單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株中,83.9%(26/31)的雜交瘤都是由細(xì)胞質(zhì)提取蛋白免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生,這可能與MDV編碼表達(dá)的絕大部分結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白都主要分布于細(xì)胞質(zhì)中有關(guān),也與病毒粒子的復(fù)制和包裝主要位于細(xì)胞質(zhì)中相一致。相反,MDV編碼的蛋白主要分布于核內(nèi)的較少,如致瘤蛋白Meq等。進(jìn)一步的MDV血清型或HVT毒株特異性鑒定發(fā)現(xiàn),該單克隆抗體庫中有27株單克隆抗體是MDV-1特異性的,另外4株(J-1F3-C6、J-5C3-F4、J-8B10-G11和J-4D9-C5)是MDV-1、MDV-2和和HVT共同保守的單克隆抗體。該MDV單克隆抗體庫的建立,不僅為后續(xù)MDV單克隆抗體的篩選鑒定及相關(guān)研究奠定了重要基礎(chǔ),而且為其它類似病毒的抗體研制提供了借鑒。

MDV基因組主要由長獨(dú)特區(qū)(UL)和短獨(dú)特區(qū)(US)構(gòu)成,在其兩側(cè)分別是兩個序列完全相同的反轉(zhuǎn)重復(fù)序列區(qū)TRL/IRL和TRS/IRS。此前研究表明,獨(dú)特序列區(qū)中編碼的MDV基因與其它皰疹病毒具有高度的保守性[31]。在MDV-1、MDV-2和HVT編碼的保守結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白中,有9種糖蛋白包括gB(UL27)、gC(UL44)、gD(US6)、gE(US8)、gH(UL22)、gI(US7)、gK(UL53)、gL(UL1)和gM(UL10)在MDV的組裝和復(fù)制中發(fā)揮重要作用。其中,gB蛋白是MDV復(fù)制所必需的,與其他皰疹病毒的保守性最高,在MDV感染和抗感染中起著重要的免疫保護(hù)作用[32]。gB蛋白是由三種分子量大小不同的糖蛋白(gP100、gP60和gP49)組成的蛋白復(fù)合物,是一種非分泌性抗原,主要存在于MDV感染細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)和膜表面,可引起體液免疫和細(xì)胞免疫,具有一定的中和活性,在MDV基因工程疫苗研發(fā)中也曾被視為一個十分重要的保護(hù)性抗原[33]。本研究中,通過用真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-gB-N1轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞,對MDV-1編碼的gB蛋白進(jìn)行表達(dá),并結(jié)合IFA染色的方法從構(gòu)建的MDV單克隆抗體庫中成功篩選鑒定出一株gB蛋白的特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株J-1F3-C6。該株單克隆抗體不僅在IFA染色中可識別全部3種不同類型的家禽皰疹病毒,而且在Western blot分析中也可以同時識別MDV-1毒株和HVT表達(dá)的三種分子量大小不同的gB蛋白條帶。此外,用J-1F3-C6進(jìn)行共聚焦分析的結(jié)果,也進(jìn)一步驗(yàn)證了gB蛋白的非分泌性,表達(dá)后主要存在于MDV感染細(xì)胞的膜表面和胞質(zhì)內(nèi)[34]。

A. J-1F3-C6;B. β-actin圖5 單克隆抗體J-1F3-C6與MDV感染CEF的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of the reactions between MDV-infected CEF cultures and monoclonal antibody J-1F3-C6

在此前的研究中,課題組已嘗試?yán)们邢蛄鞒瑸V濃縮和凝膠層析技術(shù)相結(jié)合的方法,建立一套較為溫和的病毒粒子純化方法并制備免疫原,構(gòu)建了一個MDV單克隆抗體庫并從中篩選特異性的病毒抗體[35]。與此相比,本研究建立的MDV單克隆抗體庫從中篩選特異性的病毒蛋白單克隆抗體的效率更高。最近,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),我們還構(gòu)建了MDV特定的靶蛋白如pp38和meq的基因編輯缺失毒株、并結(jié)合病毒噬斑IFA交叉篩選的策略,建立了一套高效篩選和鑒定MDV特異性單克隆抗體的新技術(shù),大大提高了MDV單克隆抗體篩選的特異性[36-37]。由于gB基因是MDV復(fù)制的必需基因,無法通過基因編輯獲得缺失毒株并用于單克隆抗體的篩選和鑒定。因此,在本研究中作者通過真核表達(dá)gB蛋白并結(jié)合IFA染色,從已建立的MDV單克隆抗體庫中進(jìn)行篩選和鑒定,很好地解決了這一問題。此外,本研究建立的31個MDV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株中,僅將其中一株gB蛋白單克隆抗體的識別靶標(biāo)得以鑒定。在后續(xù)研究中,仍有待對其它30株雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體識別的抗原蛋白逐一進(jìn)行挖掘和鑒定,雖然該項(xiàng)任務(wù)十分艱巨,但對其后續(xù)有效利用至關(guān)重要。本文相關(guān)數(shù)據(jù),為后續(xù)MDV的基因功能、致病機(jī)制、診斷技術(shù)及產(chǎn)品研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用MDV嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合特性,提取病毒感染細(xì)胞蛋白制備免疫原并免疫小鼠,同時結(jié)合IFA染色篩選的方法,建立了一個容量為31株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的MDV單克隆抗體庫,從中篩選鑒定了一株gB蛋白特異性的單克隆抗體J-1F3-C6,并且是MDV-1、MDV-2和HVT毒株保守的單克隆抗體,可用于IFA染色、共聚焦分析及Western blot試驗(yàn)。