基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究補(bǔ)陽五湯治療脊髓損傷的作用成分和機(jī)制

李 杰 周邦瑜 馬彥博 李紹波

在我國脊髓損傷發(fā)病率高達(dá)50.484 人次/百萬人，且具有較高的致殘性[1]。目前主要通過大劑量激素沖擊治療，但因?yàn)閲?yán)重不良反應(yīng)，已不推薦[2]。補(bǔ)陽還五湯記載于清代醫(yī)學(xué)家王清任著作的《醫(yī)林改錯(cuò)》中，共由7 味中藥（黃芪、赤芍、歸尾、川芎、地龍、桃仁和紅花）組成，是益氣活血的代表藥方[3]。有學(xué)者將其應(yīng)用到脊髓損傷治療中取得良好效果[4]。然而，由于補(bǔ)陽還五湯成分多、機(jī)制復(fù)雜，其治療脊髓損傷的具體機(jī)制尚不清楚。因此，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接等現(xiàn)代研究技術(shù)，揭示補(bǔ)陽還五湯治療脊髓損傷的作用成分和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)陽還五湯的作用成分和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的篩選及校正 通過（https://www.tcmsp-e.com/，TCMSP）結(jié)合文獻(xiàn)查閱，收集補(bǔ)陽還五湯七味中藥作用成分及其靶點(diǎn)蛋白信息。口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18 則認(rèn)為該成分具有藥物活性。將藥物活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白信息與數(shù)據(jù)庫UniProt（https://www.uniprot.org）中的蛋白信息進(jìn)行匹配校正。

1.2 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在Cytoscape（https://cytoscape.org/）軟件中導(dǎo)入中藥、成分和靶點(diǎn)信息，構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，然后使用軟件插件工具（Network Analyser）計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的重要參數(shù)，獲取藥物主要的作用成分。

1.3 脊髓損傷的治療靶點(diǎn)篩選和韋恩圖構(gòu)建 以“spine core injure”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，通過參數(shù)“relevance score”的中位數(shù)進(jìn)行脊髓損傷靶點(diǎn)篩選。取標(biāo)準(zhǔn)化處理后的補(bǔ)陽還五湯作用靶點(diǎn)與脊髓損傷疾病靶點(diǎn)的交集，使用（http://www.bioinformatics.com.cn）在線網(wǎng)站構(gòu)建交集靶點(diǎn)韋恩圖。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將“1.3”獲得的交集靶點(diǎn)按照物種“人類”，中等置信度≥0.9，導(dǎo)入STRING 庫（https://string-db.org/）。檢索后將文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)可視化網(wǎng)絡(luò)，使用網(wǎng)絡(luò)分析工具進(jìn)行拓?fù)洹８鶕?jù)“degree”值（度值）大小篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，以圖形大小表示度值的大小，進(jìn)行展示。

1.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析 在DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）中導(dǎo)入交集靶點(diǎn)，依次選擇“官方基因標(biāo)志”“基因列表”“人類”，進(jìn)行GO 生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）和KEGG通路注釋，并繪制可視化的氣泡圖（http://www.bioinformatics.com.cn）。

1.6 主要作用成分與核心靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接 從數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)蛋白，應(yīng)用AutoDockTools（https://autodock.scripps.edu/）對(duì)其中的配體分子進(jìn)行提取，去掉水分子，加入氫原子。使用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取主要作用成分的三維結(jié)構(gòu)。通過半柔性對(duì)接，以核心靶點(diǎn)蛋白為受體，以主要作用成分為配體，利用Pymol（https://pymol.org/2/）展示對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 補(bǔ)陽還五湯作用成分及相關(guān)靶點(diǎn)信息 經(jīng)TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選化合物：赤芍14 個(gè)，川芎6 個(gè)，當(dāng)歸2 個(gè)，紅花16 個(gè)，黃芪17 個(gè)，桃仁19 個(gè)。地龍?jiān)赥CMSP 中未錄入，通過查找文獻(xiàn)得到其有效成分1個(gè)。去掉重復(fù)和缺乏有效靶點(diǎn)信息的化合物后，共獲得63 個(gè)藥物作用成分及260 個(gè)相對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白。

2.2 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 網(wǎng)絡(luò)共有330 個(gè)節(jié)點(diǎn)（7 個(gè)中藥，63 個(gè)作用成分，260 個(gè)靶點(diǎn)）和1296 條邊，兩節(jié)點(diǎn)間的連線越多，表示相互關(guān)系越緊密。其中菱形代表靶點(diǎn)，圓形代表中藥，八邊形代表中藥活性成分，三角形代表藥物共有活性成分（見圖1）。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析，度值前10 的是：槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、黃芪素、木犀草素、7-甲氧基異微凸劍葉莎醇、刺芒柄花素、異鼠李素、常春藤皂苷元、黃芩苷。見表1。

圖1 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.3 補(bǔ)陽還五湯治療脊髓損傷靶點(diǎn) 篩選得到752個(gè)脊髓損傷疾病相關(guān)靶點(diǎn)。共有106 個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖2。

圖2 補(bǔ)陽還五湯治療脊髓損傷韋恩圖

2.4 蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

取“2.3”中的交集靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，共有106 個(gè)節(jié)點(diǎn)（靶點(diǎn)蛋白）和498 條邊（蛋白相互作用）。選取度值排名前20 關(guān)鍵靶點(diǎn)在內(nèi)圈展示，分別是TP53、AKT1、MAPK1、RELA、TNF、CTNNB1、IL6、ESR1、MAPK14、FOS、EGFR、MYC、RB1、IL10、MAPK8、CCND1、HIF1A、CDKN1A、CAV1、AR。見圖3。

TCMSP MOL000098 MOL000422 MOL000359 MOL002714 MOL000006 MOL000378 MOL000296 MOL000354 MOL000392 MOL002776成分代號(hào)B2 B1 A3 A1 HH5 HQ9 B3 HQ3 HQ5 A2化合物名稱quercetin kaempferol beta-sitosterol baicalein luteolin 7-O-methyli somucronulatol hederagenin isorhamnetin formononetin Baicalin中文名稱槲皮素山奈酚β-谷甾醇黃芪素木犀草素7-甲氧基異微凸劍葉莎醇常春藤皂苷元異鼠李素刺芒柄花素黃芩苷OB（%）46.43 41.88 36.91 33.52 36.16 74.69 36.91 49.6 69.67 40.12來源黃芪、紅花黃芪、紅花赤芍、當(dāng)歸、紅花、桃仁赤芍、紅花紅花黃芪黃芪、桃仁黃芪黃芪赤芍、紅花DL 0.28 0.24 0.75 0.21 0.25 0.3 0.75 0.31 0.21 0.75度值307 123 118 72 58 46 46 40 40 35

圖3 補(bǔ)陽還五湯治療脊髓損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.5 GO 功能和KEGG 通路分析 對(duì)排名前20 的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能分析，共獲得GO 條目304個(gè)。其中BP242 個(gè)，CC18 個(gè)，MF44 個(gè)。BP 顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要與基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、凋亡、MAPK 信號(hào)、對(duì)活性氧反應(yīng)等過程相關(guān)；CC 顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)構(gòu)成大分子復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，廣泛分布細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)、線粒體等部位；MF 顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)可影響蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸、轉(zhuǎn)錄因子以及一氧化氮合酶和轉(zhuǎn)錄激酶活性。見圖4。

通過KEGG 分析得到信號(hào)通路128 條，將與脊髓損傷明顯無關(guān)的癌癥和病毒感染等通路棄去，根據(jù)“count 值”排序，取前15 條通路繪制氣泡圖（見圖4）。結(jié)果顯示，多數(shù)基因富集在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子（FoxO）、磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）、Toll 樣受體（TLRs）、腫瘤壞死因子（TNF）等通路，而且排名前4 的核心靶點(diǎn)TP53、AKT1、MAPK1、RELA 均被富集。見表2。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果 槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇是補(bǔ)陽還五湯排名前3 位的主要成分，TP53、AKT1、MAPK1、RELA 是補(bǔ)陽還五湯治療脊髓損傷的核心靶點(diǎn)，將二者進(jìn)行兩兩對(duì)接，共得到12 組配體-受體對(duì)接結(jié)果，結(jié)果見表3。圖5 展示部分對(duì)接結(jié)果的三維圖。

3 討 論

本研究表明，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇是補(bǔ)陽還五湯的主要作用成分。槲皮素可以激活PI3K/Akt通路調(diào)控自噬，改善脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能[5]。除此之外，槲皮素也可抑制Toll 樣受體4（TLR4）-核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路減輕脊髓損傷大鼠的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)和減輕脊髓空洞形成[6]。山奈酚可以抑制MAPK 和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）磷酸化，減少小膠質(zhì)細(xì)胞活化和氧化應(yīng)激[7]。β-谷甾醇可抑制p38 蛋白激酶（p38 MAPK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、NF-κB 通路，減少炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）、環(huán)氧化酶-2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)[8]。

TP53、AKT1、MAPK1、RELA 在補(bǔ)陽還五湯治療脊髓損傷中起到核心作用。脊髓損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體可通過調(diào)控p53 蛋白參與神經(jīng)元凋亡和軸突再生[9]。和TP53 一樣，AKT1 也可調(diào)控細(xì)胞存活和凋亡，抑制AKT-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，減輕脊髓損傷大鼠炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元調(diào)亡，減少膠質(zhì)瘢痕[10]。另外，通過對(duì)脊髓損傷模型兔行減壓手術(shù)后發(fā)現(xiàn)，由脊髓損傷引起的p-AKT 蛋白的上調(diào)被逆轉(zhuǎn)，兔的運(yùn)動(dòng)功能有了恢復(fù)趨勢(shì)[11]。脊髓損傷后MAPK1 表達(dá)顯著上調(diào)，抑制MAPK1 可以促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)恢復(fù)[12]。RELA 是NF-κB 家族的重要成員，又名p65，在調(diào)節(jié)炎癥、免疫應(yīng)答等活動(dòng)中起重要作用。抑制NF-κB p65 通路可減少炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 釋放，促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)恢復(fù)和軸突再生[13]。

Gene MAPK8，MYC，MAPK1，AKT1，F(xiàn)OS，MAPK14，TNF，TP53，RELA，EGFR IL6，CDKN1A，CCND1，MYC，MAPK1，AKT1，TP53，RELA，EGFR IL10，IL6，CDKN1A，MAPK8，CCND1，MAPK1，AKT1，MAPK14 EGFR IL6，MAPK8，MAPK1，AKT1，F(xiàn)OS，MAPK14，TNF，RELA IL6，MAPK8，MAPK1，AKT1，F(xiàn)OS，MAPK14，TNF，RELA KEGG 通路MAPK PI3K-Akt FoxO Toll 樣受體TNF Count 10 9988

KEGG 分析顯示，主要核心靶點(diǎn)富集在MAPK、PI3K-Akt、FoxO、TLRs、TNF 等通路。MAPK 是調(diào)控炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡的信號(hào)通路。甘草苷治療脊髓損傷大鼠，可顯著降低損傷組織中的磷酸化p38 MAPK 表達(dá)，減少中性粒細(xì)胞浸潤和神經(jīng)元的調(diào)亡[14]。PI3K/Akt 具有調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖、血管生成以及向體內(nèi)穩(wěn)態(tài)遷移等功能。抑制PI3K/Akt 通路可促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞遷移，有利于脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)[15]。FOX 家族成員的表達(dá)與脊髓損傷后的肌肉萎縮密切相關(guān)[16]，另外調(diào)節(jié)叉頭轉(zhuǎn)錄因子3a（FoxO3a）可減輕脊髓損傷后的調(diào)亡水平[17]。TLRs 與TNF 通路均與炎癥表達(dá)相關(guān)。臨床分析表明，脊髓損傷患者血清中TLR4、NF-κB、TNF-α、白細(xì)胞介素-12（IL-12）水平均高于健康體檢者[18]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，證明補(bǔ)陽還五湯中主要作用成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇通過干預(yù)TP53、AKT1、MAPK1、RELA等靶點(diǎn)，通過MAPK、PI3K-Akt、FoxO、TLRs、TNF 等信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)脊髓損傷的治療作用，為下一階段的深入研究提供參考依據(jù)。