白附子對(duì)大鼠腦缺血再灌注的保護(hù)作用研究

曹 明 丁 峰 涂玉婷 謝文天

腦卒中已逐漸成為全球第二大致死病因，缺血性腦卒中具有復(fù)發(fā)率高、死亡率高等特點(diǎn)，其根本病因是血管內(nèi)血栓形成，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織壞死和局灶性神經(jīng)元缺損[1-2]。白附子作為天南星科植物獨(dú)角蓮的干燥塊莖，具有祛風(fēng)痰、通經(jīng)絡(luò)和解毒鎮(zhèn)痛等功效。相關(guān)研究表明，含白附子的湯劑能改善腦神經(jīng)功能[3-5]，然而白附子對(duì)于腦缺血再灌注的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究從行為學(xué)評(píng)分、腦梗死率及氧化應(yīng)激等相關(guān)方面來(lái)探討白附子對(duì)大鼠腦缺血再灌注的保護(hù)作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康SD 雄性大鼠32 只，體質(zhì)量250～300 g，飼養(yǎng)于杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，12 h 晝夜交替，自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，倫理審批號(hào)：ZJCLA-IACUC-20040087。

1.2 藥物與試劑 白附子，購(gòu)自河南省禹州市，經(jīng)浙江省天臺(tái)縣人民醫(yī)院藥劑科主管中藥師徐世余鑒定為天南星科植物獨(dú)角蓮的干燥塊莖。稱取2 kg 白附子，置純凈水中浸泡過(guò)夜，至自動(dòng)煎藥機(jī)中煎煮2次，過(guò)濾濃縮后制成生藥量為1 g/mL 的藥液；尼莫地平片（規(guī)格：20 mg/片，批號(hào)2004009），購(gòu)自正大青春寶藥業(yè)有限公司；超氧化物歧化酶酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（superoxide dismutase，SOD），購(gòu)自南京建成生物工程研究所（批號(hào)20210409）；丙二醛ELISA 試劑盒（malonaldehyde，MDA），購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品編號(hào)S0131S）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 BZY150A 型三延煎藥機(jī)（天津三延精密機(jī)械有限公司，中國(guó)）、SpectraMAX M2 多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國(guó)）、動(dòng)物保護(hù)溫臺(tái)（Kent scientific，美國(guó)）、FinePix S602 Zoom 數(shù)碼相機(jī)（FinePix，日本）、Wayne Rasband ImageJ 1.37c 圖像分析軟件（National Institutes of Health，美國(guó)）（用于完成圖像采集和分析）。

1.4 分組及給藥 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為四組，分別是假手術(shù)組（未造模處理的對(duì)照組）、模型組（僅造模處理的對(duì)照組）、白附子組（10 g/kg）、尼莫地平組（10 mg/kg），每組8 只實(shí)驗(yàn)大鼠，白附子組和尼莫地平組于每日同一時(shí)間進(jìn)行相應(yīng)劑量灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組分別給予相同體積的生理鹽水，持續(xù)8 d，白附子組和尼莫地平組在給藥結(jié)束后造模。

1.5 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型制備 參考彭慧淵等[6]建立的MCAO 模型，以線栓法阻塞大腦動(dòng)脈來(lái)誘導(dǎo)大鼠腦缺血。將水合氯醛麻醉過(guò)的大鼠固定在保溫臺(tái)上，進(jìn)行頸正中心切口，結(jié)扎頸外動(dòng)脈和近心端的頸總動(dòng)脈，夾緊頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端。在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端和近端中間切口并插入尼龍線，約距頸總動(dòng)脈分叉1.8～2.0 cm處遇阻力停。假手術(shù)組只插入尼龍線0.5 cm 左右。缺血60 min 后抽出尼龍線縫合創(chuàng)面，再灌注24 h 后觀察各項(xiàng)指標(biāo)。提尾懸空時(shí)，右前肢屈曲，走路時(shí)旋轉(zhuǎn)到右側(cè)即為造模成功。

1.6 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 造模24 h 后按照Longa 評(píng)分[6-7]的分級(jí)法進(jìn)行評(píng)分。0 分：各項(xiàng)行動(dòng)正常進(jìn)行；1分：右前肢提尾時(shí)不能完全伸展（神經(jīng)功能輕度缺損；2 分：走路時(shí)向右側(cè)打圈（神經(jīng)功能中度缺損）；3分：自主運(yùn)動(dòng)時(shí)向右側(cè)傾斜（神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重）；4分：不能自發(fā)性行走（意識(shí)障礙）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中剔除MCAO 術(shù)后行動(dòng)正常的動(dòng)物。

1.7 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2、3、5-Triphenytetrazoliumchloride，TTC）染色 造模24 h 后，每組取6只大鼠，麻醉后斷頭取腦，冰箱速凍后切腦片，腦片置于37 ℃的0.5%TTC 溶液中避光振蕩孵育20 min，使染色均勻。染色后在4%多聚甲醛中固定，然后拍照。進(jìn)行影像分析計(jì)算腦梗死率，腦梗死率（%）=腦梗死體積/全腦體積×100%。

1.8 腦組織病理學(xué)改變觀察 取大鼠腦組織灌流固定后，脫水和透明，浸蠟和包埋，切片制作，脫蠟至水，加入蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）試劑盒染色，在顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)變化。

1.9 大鼠血清SOD 和MDA 測(cè)定 造模24 h 后，每組大鼠麻醉后快速打開(kāi)腹腔，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，分離血清，SOD 和MDA 水平嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差進(jìn)行分析；組間兩兩比較，若方差齊，則采用t 檢驗(yàn)，若方差不齊，則采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分比較 腦缺血再灌注損傷后，模型組、白附子組和尼莫地平組神經(jīng)功能缺失評(píng)分均有所升高（P＜0.05）；術(shù)前給予白附子和尼莫地平治療后，兩組神經(jīng)功能評(píng)分均大幅降低（P＜0.05）；白附子組與尼莫地平組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分及腦梗死率比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分及腦梗死率比較（±s）

注：假手術(shù)組、模型組均予等量生理鹽水灌胃；白附子組予10 g/kg 白附子灌胃；尼莫地平組予10 mg/kg 尼莫地平灌胃；Longa 為神經(jīng)功能缺失評(píng)分；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別假手術(shù)組模型組白附子組尼莫地平組鼠數(shù)6666 Longa 評(píng)分（分）0.00±0.00 2.83±0.41a 1.67±0.52b 1.33±0.52b腦梗死率（%）0.00±0.00 24.97±7.16a 14.96±7.54b 8.20±7.17b

2.2 各組大鼠腦梗死率比較 TTC 染色顯示，除假手術(shù)組外，其余各組均有明顯白色梗死灶。術(shù)前給予白附子和尼莫地平治療后，兩組梗死率顯著減少（P＜0.05）；尼莫地平組比白附子組梗死率小，但兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組大鼠的TTC 染色結(jié)果

2.3 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組動(dòng)物皮層結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元細(xì)胞分布均勻，形態(tài)正常；模型組動(dòng)物皮層結(jié)構(gòu)疏松，組織間隙水腫，神經(jīng)元大量減少，細(xì)胞核固縮，排列不規(guī)則；與模型組相比，白附子組和尼莫地平組的神經(jīng)元明顯增加，組織水腫、核固縮等現(xiàn)象明顯減輕。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)比較（HE 染色，×100）

2.4 各組大鼠氧化應(yīng)激因子水平比較 大鼠腦缺血再灌注發(fā)生后，血清MDA 大量產(chǎn)生，SOD 減少（P＜0.05），發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)；經(jīng)白附子及尼莫地平治療后，兩組均能使MDA 水平下降，SOD 水平升高（P＜0.05）；尼莫地平組與白附子組MDA、SOD 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激因子水平比較（±s）

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激因子水平比較（±s）

注：假手術(shù)組、模型組均予等量生理鹽水灌胃；白附子組予10 g/kg 白附子灌胃；尼莫地平組予10 mg/kg 尼莫地平灌胃；SOD 為超氧化物歧化酶；MDA 為丙二醛；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別假手術(shù)組模型組白附子組尼莫地平組鼠數(shù)6666 MDA（μmol/L）2.21±0.35 3.91±1.09a 1.26±1.02b 1.67±0.54b SOD（U/mL）16.13±4.77 8.08±3.93a 12.53±2.56b 13.81±1.75b

3 討 論

引起腦缺血再灌注損傷的機(jī)制很復(fù)雜，包括氨基酸過(guò)度釋放、自由基損傷及細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等[8]。腦缺血后血流恢復(fù)，會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，加重一系列的生理病理變化，造成神經(jīng)細(xì)胞的進(jìn)一步損害[9]。作為氧自由基發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化后的產(chǎn)物，MDA 的含量高低可間接反映機(jī)體的氧化損傷程度。而SOD 作為抗氧化相關(guān)酶，其含量往往與MDA 負(fù)相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組神經(jīng)細(xì)胞大量減少，細(xì)胞腫脹，同時(shí)伴有SOD 水平降低，MDA水平升高，可能與大量氧自由基反應(yīng)引起的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。

白附子主要成分包括苷類(lèi)、酚類(lèi)、脂類(lèi)和揮發(fā)油等[11]，其中酚類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物占比較高，可有效清除氧自由基[12]。有研究表明，其腦苷成分對(duì)于大鼠腦缺血再灌注后引起的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)激活鉀離子通道，然而其他成分的作用機(jī)制尚不明確[11]。本研究結(jié)果表明，白附子可以縮小腦梗死體積，使神經(jīng)功能評(píng)分降低，證實(shí)其對(duì)于腦缺血再灌注有一定的保護(hù)作用，且效果不劣于尼莫地平。氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。腦缺血再灌注發(fā)生后，活性氧迅速產(chǎn)生，破壞氧化還原平衡，導(dǎo)致大量的MDA 產(chǎn)生。白附子可以通過(guò)抑制MDA 產(chǎn)生，增加抗氧化酶的活性來(lái)減少氧化應(yīng)激的刺激，分析其原因可能與酚類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物清除氧自由基相關(guān)。

對(duì)于白附子的劑量選擇，本研究通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物與人體間的等效劑量換算，并參考文獻(xiàn)[13]，選擇了10 g/kg，結(jié)果表明該劑量安全有效。

綜上所述，通過(guò)減少缺血事件后活性氧的產(chǎn)生，白附子可以減輕氧化應(yīng)激和腦缺血后的神經(jīng)元損傷，但對(duì)其他方面的作用機(jī)理，仍需進(jìn)一步探討。