基于16S rRNA 基因測序的四妙散加減方治療痛風性關(guān)節(jié)炎作用機制研究

孫 益 朱學鑫 陳增超 張 宇 滕建康

痛風性關(guān)節(jié)炎是因體內(nèi)嘌呤代謝出現(xiàn)紊亂導致血中尿酸含量升高，尿酸鹽結(jié)晶體沉著在各關(guān)節(jié)滑膜或軟骨組織中，從而繼發(fā)關(guān)節(jié)周圍炎癥反應[1]，對痛風患者的身心健康和生活質(zhì)量造成影響[2]。全球痛風患病率為0.1%～10%[3]，2019 年的一項研究顯示，我國痛風患病率為0.03%～10.47%[4]，且呈逐年上升趨勢。痛風性關(guān)節(jié)炎的具體發(fā)病機制除了遺傳、生活方式、藥物、疾病等主流因素外仍不完全明確。有研究發(fā)現(xiàn)，嘌呤代謝的各個環(huán)節(jié)以及機體的免疫狀態(tài)和痛風發(fā)病的進程與腸道內(nèi)的特定菌群具有密切的相關(guān)性[5-6]。本研究將結(jié)合前期臨床基礎(chǔ)，探討痛風性關(guān)節(jié)炎患者治療前后腸道菌群多樣性的改變，為以腸道菌群為靶向進行預防和治療痛風性關(guān)節(jié)炎提供新的臨床思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020 年5 月至2022 年5 月于浙江省余姚市中醫(yī)醫(yī)院就診的痛風性關(guān)節(jié)炎患者15例。本研究經(jīng)余姚市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準（倫理編號：MR-202015）。

1.2 診斷標準 西醫(yī)診斷參考2010 年《原發(fā)性痛風治療與診斷標準》[7]，中醫(yī)證候分型參考《中醫(yī)病證診斷療效標準》[8]屬于濕熱蘊結(jié)證。

1.3 納入標準 （1）符合西醫(yī)診斷標準，中醫(yī)診斷及辨證標準；（2）性別與年齡不限；（3）體溫＜38.0 ℃；（4）自愿簽署知情同意書。

1.4 排除標準 （1）入組前3 個月內(nèi)使用過相關(guān)的抗生素、益生元或益生菌等微生態(tài)制劑者；（2）存在腸道感染或腹痛腹脹、消化不良等消化道癥狀者；（3）患有心血管疾病、高血壓、高脂血癥、糖尿病等慢性疾病無法配合者；（4）因收集的標本在cDNA 文庫構(gòu)建失敗無法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計者。

1.5 治療方法 對納入的痛風性關(guān)節(jié)炎患者進行個體特征收集，主要以訪談加記錄的方式進行調(diào)研，收集研究對象基本信息、職業(yè)、飲食習慣、既往病史等個人特征。進行嚴格的飲食控制，限制高嘌呤食物攝入，制動休息。采用四妙散加減方進行中醫(yī)辨證治療，擬方：黃柏、牛膝、蒼術(shù)各10 g，薏苡仁30 g，桂枝6 g，土茯苓15 g，威靈仙、秦艽、忍冬藤各10 g，山慈菇6 g，延胡索15 g，治療2 周，每日1 劑，分2 次服用。

1.6 糞便樣本收集與檢測 在清潔環(huán)境下采集研究對象治療前后的新鮮糞便（不少于6 g），置于無菌的標本采樣管中送至本院生物實驗室，在-80 ℃環(huán)境下保存待檢。將治療前的標本歸為A 組，治療后的標本歸為B 組。

1.7 DNA 提取與文庫構(gòu)建 采用E.Z.N.A.DNA 提取試劑盒（批號20221001，美國Omega Bio-Tek）提取糞便標本DNA，并用NanoDrop2000（美國Thermo）檢測DNA 濃度及其純度，進一步檢測DNA 完整性。使用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對大便樣本的16S rRNA V3-V4 區(qū)域進行相應的PCR 擴增（引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成）。建立20 μL PCR 反應體系：DNA 10 ng，5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，正反向引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu 高保真聚合酶0.4 μL，牛血清白蛋白0.2 μL，補入雙蒸水至20 μL。設(shè)定PCR 擴增的條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，一共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 的產(chǎn)物在-20 ℃儲存。凝膠電泳檢測擴增后的PCR 產(chǎn)物進行純化，然后溶于洗脫緩沖液中，文庫構(gòu)建完成。

1.8 測序與生物信息學分析 交由深圳微生太科技有限公司，采用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺對所有樣本進行測序。所得到的測序數(shù)據(jù)經(jīng)過barcode 接頭序列拆分獲得有效序列，再通過使用Qiime2 軟件中的DADA2 插件對原始序列進行操作，其中包含序列的聚類去噪、拼接、去嵌合，最終生成擴增特征序列（operational taxonomic units，OTU）。獲得的具有代表性的序列與核糖體RNA 的數(shù)據(jù)庫（Greengenes Database）進行對比，按99%序列相似性來獲取獲得物種的注釋信息。其中的α 多樣性及β多樣性分析主要用Qiime2 插件完成。

1.9 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s） 表示，兩組間菌群α 多樣性指數(shù)采用Kruskal-Wallis 方法，兩組菌群β 多樣性指數(shù)采用Permanova分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 共收集痛風性關(guān)節(jié)炎患者15 例，均為男性，年齡22～80（50.13±15.80）歲，所有患者經(jīng)治療后諸痛風癥狀較治療前明顯緩解。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 數(shù)據(jù)深度評估 兩組15 例患者，治療前后樣本共計30 個，共獲得原始序列2563932 條，最終可用于后期有效分析的效序列1991676 條，根據(jù)統(tǒng)計平均每個樣本可以得到66389 條相對高質(zhì)量的序列。最終評估顯示，所有樣本的序列數(shù)以及序列的質(zhì)量良好，滿足后期所需的分析要求。依據(jù)OTU（可操作分類單元）[9]設(shè)定的方法，確定特征序列。以99%相似度聚類，獲得6465 個OUT。其中，A 組、B 組分別共獲得3843 個、3618 個OUT。兩組共有996 個OUT。見圖1。

2.2.2 腸道菌群的α 多樣性指數(shù)分析 采用α 多樣性指數(shù)分析來確定物種組成的均勻度和豐富度，兩組比較，Kruskal-Wallis 方法結(jié)果顯示，A 組與B 組的Observed OTU（H=3.562，P=0.059）、Faith's PD（H=0.795，P=0.372）和chao1 指數(shù)（H=3.562，P=0.059）比較，差異無統(tǒng)計學意義，而Shannon 指數(shù)（H=4.563，P=0.033）比較，差異有統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 Observed OTU、Shannon、Faith's PD 及chao1 指數(shù)的箱型圖

2.2.3 腸道菌群的β 多樣性指數(shù)分析 通過PCoA分析表明，第1 主成分的貢獻度為12.5%，第2 主成分的貢獻度為8.5%，雖然兩組中有個別樣本距離較近，但大部分A 組樣本聚集在一起且與B 組樣本之間距離較大。Permanova 分析顯示T=1.764，P=0.005，說明兩組具有差異性。見圖3。

圖3 β 多樣性分析

2.3 兩組樣本腸道菌群差異分析 根據(jù)不同分類水平的物種注釋測序得出各自有效序列，共獲得了43個門，108 個綱，168 個目，213 個科，328 個屬，183 個種。通過從門、綱、目、科、屬這五個分類進行分析，并將前10 名的物種情況進行展示。

2.3.1 五種分類門、綱、目、科、屬水平的菌群結(jié)構(gòu)分析 門分類水平物種分析結(jié)果表明，兩組樣本腸道菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）5 個門的微生物組成。與A 組相比，B 組含有厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和梭桿菌門的比例減少，而放線菌門增多。

綱分類水平物種分析結(jié)果表明，兩組樣本腸道菌群主要由梭菌綱（Clostridia）、放線菌綱（Actinobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、丹毒絲菌綱（Erysipelotrichi）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、梭桿菌綱（Fusobacteriia）和紅蝽菌綱（Coriobacteriia）8 個綱的微生物組成。與A 組比較，B組含有梭菌綱、γ-變形菌綱、芽孢桿菌綱、擬桿菌綱、梭桿菌綱的比例減少，而放線菌綱、丹毒絲菌綱、紅蝽菌綱增多。

目分類水平物種分析結(jié)果表明，兩組樣本腸道菌群主要由梭菌目（Clostridiales）、雙歧桿菌目（Bifidobacteriales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、乳桿菌目（Lactobacillales）、擬桿菌目（Bacteroidales）、丹毒絲菌目（Erysipelotrichales）、紅蝽桿菌目（Coriobacteriales）、梭桿菌目（Fusobacteriales）8 個目的微生物組成。與A 組比較，B 組含有梭菌目、腸桿菌目、擬桿菌目、乳桿菌目、梭桿菌目的比例減少，而雙歧桿菌目、丹毒絲菌目、紅蝽桿菌目增多。

科分類水平物種分析結(jié)果表明，兩組樣本腸道菌群主要由毛螺菌科（Lachnospiraceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）和梭菌科（Clostridiaceae）7 個科的微生物組成。與A 組比較，B 組含有毛螺菌科、瘤胃球菌科、腸桿菌科、擬桿菌科、梭菌科的比例減少，而雙歧桿菌科、丹毒絲菌科增多。

屬分類水平物種分析結(jié)果表明，兩組樣本腸道菌群主要由布勞特氏菌屬（Blautia）、瘤胃球菌（Ruminococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）5 個屬的微生物組成。與A 組比較，B 組含有瘤胃球菌科、擬桿菌屬的比例減少，而雙歧桿菌屬、布勞特氏菌屬增多。見圖4。

圖4 各個分組在門、綱、目、科、屬水平上的相對分布情況柱形圖（相對豐度前20 的物種）

2.3.2 LEfSe 差異貢獻分析 根據(jù)樣本分析后可得出，在A 組中，含量較高的微生物依次是擬桿菌門擬桿菌綱擬桿菌目擬桿菌科、厚壁菌門梭菌綱梭菌目梭菌科、厚壁菌門芽孢桿菌綱乳桿菌目乳桿菌科乳桿菌屬（Lactobacillus）。在B 組中放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門γ-變形菌綱假單胞菌目莫拉氏菌科不動桿菌屬約氏不動桿菌（johnsonii）、厚壁菌門梭菌綱梭菌目毛螺菌科梭菌屬（Clostridium）、變形菌門α-變形菌綱紅桿菌目紅桿菌科速生桿菌屬（Celeribacter）、厚壁菌門梭菌綱梭菌目毛螺菌科梭菌屬（hathewayi）、變形菌門α-變形菌綱紅桿菌目紅桿菌科（Rhodobacteraceae）。其中的擬桿菌門擬桿菌綱擬桿菌目擬桿菌科和放線菌門的差異最顯著，可能是四妙散加減方治療痛風性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵菌群。見圖5。

圖5 LEfSe 分析LDA 柱形圖和cladogram 圖

2.4 腸道菌群的變化情況對機體的代謝影響 使用KEGG 數(shù)據(jù)庫進行預測，其中包含6 個大類的代謝通路：代謝、細胞進程、遺傳信息處理、人類疾病、生物體系統(tǒng)和環(huán)境信息處理，每一類的代謝通路又可以分成多個等級。運用KEGG 數(shù)據(jù)庫菌群對代謝的功能預測結(jié)果表明，與碳水化合物的代謝最相關(guān)，其次是氨基酸代謝；進一步對氨基酸代謝的功能預測結(jié)果表明，與纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸生物合成）最相關(guān)，其次是D-丙氨酸代謝，再次是D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝。見圖6。

圖6 預測得到的KEGG.L1-L3 的百分比組成柱形圖

3 討 論

中醫(yī)藥在治療痛風性關(guān)節(jié)炎中具有一定優(yōu)勢，特別是以四妙散為代表的中藥方劑被廣泛應用于臨床[10]。雖然當前對該藥方的治療機制研究比較豐富，但是僅局限在降尿酸、控制炎癥反應等途徑，所以前期的研究均不能完美闡釋其機制，而腸道菌群的微生態(tài)平衡與人體宿主之間存在著某種復雜的動態(tài)平衡，已被證實為人體的第二隱藏器官，另有研究證實痛風性關(guān)節(jié)患者與正常人群相比，痛風患者的腸道菌群顯著失調(diào)，主要表現(xiàn)為保護性微生物群落缺乏，專性厭氧菌、革蘭氏陽性球菌和不同種類的念珠菌水平升高[11]。

本研究采用16S rRNA 基因測序技術(shù)的分析方法，將痛風患者治療前后的腸道菌群特點進行比較分析，通過α 多樣性和β 多樣性評估痛風患者治療前后菌群變化的特點，治療前與治療后的α 多樣性中的Observed OTU、Faith's PD 和chao1 指數(shù)無統(tǒng)計學差異，而Shannon 指數(shù)有統(tǒng)計學差異，β 多樣性評估中的PCoA 分析表明兩組具有差異性，說明痛風患者治療前后的腸道微生物結(jié)構(gòu)存在一定的差異性，這種差異性可提示四妙散加減方的作用機制可能與腸道菌群的改變有關(guān)，同時綜合該方劑前期相關(guān)的研究結(jié)論可認為，四妙散加減方治療痛風性關(guān)節(jié)炎可能通過一種綜合化的干預機制來實現(xiàn)。

進一步從LDA 差異貢獻分析中可以發(fā)現(xiàn)，四妙散加減方對于痛風治療前后擬桿菌科和放線菌門的差異最顯著，相關(guān)研究表明，擬桿菌科影響人體營養(yǎng)吸收及代謝，參與蛋白質(zhì)分解過程中有毒產(chǎn)物的釋放，其也是促進炎癥發(fā)生的機會病原體，某些菌種更是人和動物的重要致病菌[12]，如celatum、fragilis、Enterobacteriaceae 等，該類菌群在治療前的比例相對較高，這可能與痛風的發(fā)生具有一定相關(guān)性。而治療后放線菌門比例最高，該門類細菌中含有益生菌最多，是人體的優(yōu)勢腸道菌群，各種代謝性疾病的發(fā)生與該類細菌量減少具有一定的相關(guān)性。有研究證實該類菌有助于改善消化功能、控制血糖、降低血脂、提高免疫力等，并且被認為具有巨大的藥理學潛力，對于抗氧化、調(diào)節(jié)代謝等方面具有重要作用[13]。本研究中采用四妙散加減方后該菌群的比例提升，進一步提示四妙散加減方能提高體內(nèi)益生菌（distasonis、aldenense）的比例；其他的相關(guān)報道也證實這一假設(shè)，如四妙散組成中的牛膝可改變斷奶仔豬腸段中的大腸桿菌、乳酸菌、腸球菌等數(shù)量[14]；薏苡仁對于腸道內(nèi)雙歧桿菌及乳桿菌的數(shù)量具有上調(diào)作用，同時可明顯改善腸胃微生態(tài)[15]；黃柏能增加腸球菌及雙歧桿菌的含量，降低腸道內(nèi)白細胞介素-6、白細胞介素-8、腫瘤壞死因子-α 等炎癥因子的表達[16]；蒼術(shù)對小鼠腸道內(nèi)的放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門都具有調(diào)節(jié)作用[17]。由此可見四妙散加減方對于腸道菌群的調(diào)節(jié)具有一定的靶向作用。

本研究也存在一定局限性，樣本量相對較少，采用的16S rRNA 基因測序高通量分析技術(shù)在分析腸道菌群方面也存在一定的不足，不能在細菌種水平分析治療前后腸道菌群差異。后續(xù)需更大樣本量、多中心、更先進的手段如全基因組測序研究來進一步明確痛風患者治療前后人腸道菌群的差異，從而揭示中醫(yī)藥基于腸道菌群治療痛風的作用機制。