地黃配伍玄參對(duì)糖尿病腎病大鼠微循環(huán)障礙的影響*

張 璇，姜睿斌，張曉菊，董曉靜，薛松妍，李 鋒△

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 714000； 2 空軍（第四）軍醫(yī)大學(xué)第一附屬西京醫(yī)院，陜西 西安 710032

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是由糖、脂代謝紊亂引起的以腎小球血管損傷為主要病變的疾病，是終末性腎病的主要原因，也是糖尿病最常見(jiàn)和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。高血糖是致使DN 進(jìn)展的始發(fā)因素，糖代謝異常引起的腎小球硬化是造成DN的重要原因［1］。糖類、脂質(zhì)代謝紊亂是引起血液微循環(huán)障礙（microcirculation disorder，MiC）的首要因素，因此糾正糖類、脂質(zhì)代謝紊亂，等同于從源頭上阻止DN 疾病的進(jìn)展，對(duì)于治療疾病意義重大。但單純使用西藥治療不能截?cái)嗵悄虿∧I損害的自然進(jìn)程，而中醫(yī)藥可以從多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多層次作用于疾病，有效防治并發(fā)癥的發(fā)生。

高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）是以血漿中一種或多種脂質(zhì)成分［主要指甘油三酯（triglyceride，TG）和膽固醇（cholesterol，TC）］異常增高為特征的代謝紊亂綜合病癥［2］。高糖環(huán)境下，大量脂質(zhì)異常增高，堆積阻塞血管，改變血液流變性，使機(jī)體出現(xiàn)MiC。MiC 是指微循環(huán)結(jié)構(gòu)及功能的異常導(dǎo)致其不能與組織和器官代謝水平相適應(yīng)，影響組織的物質(zhì)交換和器官功能狀態(tài)，其與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的“血瘀證”類似。生地黃、玄參作為養(yǎng)陰清熱活血的代表藥物，均有抗氧化、降血脂、降血糖及保護(hù)胰島功能等藥理作用［3-6］，可通過(guò)糾正血液代謝紊亂從而緩解MiC。生地黃性寒，味甘，具有清熱涼血，養(yǎng)陰生津的功效，常用于治療熱入營(yíng)血、津傷便秘、溫毒發(fā)斑、舌絳煩渴、陰虛發(fā)熱、熱病傷陰等。玄參性味咸、甘、苦，微寒，歸肺、胃、腎經(jīng)，可清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)，主要用于治療治溫毒發(fā)斑、熱入營(yíng)血等。地黃玄參為經(jīng)典藥對(duì)，相須為用時(shí)，可增強(qiáng)清熱涼血，養(yǎng)陰生津之效。本研究考察了地黃配伍玄參對(duì)DN大鼠糖、脂代謝紊亂的影響，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)SD大鼠40只，雄性，8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g。由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（陜）2019-001。飼養(yǎng)于西京醫(yī)院中醫(yī)科實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物房室溫24 ℃，相對(duì)濕度60%，給予12 h 光/暗周期，自由飲水、攝食，實(shí)驗(yàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物地黃、玄參顆粒劑（陜西華氏醫(yī)藥有限公司）均由空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房所提供；二甲雙胍（海源葉生物科技有限公司，純度=98%）。

1.3 試劑及儀器鏈脲佐菌素（STZ）（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：S0130-1G）；檸檬酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸三鈉，One Touch豪穩(wěn)型血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）；One Touch 豪穩(wěn)型血糖試紙（美國(guó)強(qiáng)生公司）；Chemray420 型全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；Epoch 型酶標(biāo)檢測(cè)儀（BioTeK）。

1.4 模型制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將40 只大鼠隨機(jī)分為兩組，空白對(duì)照組7只，造模組33只?？瞻讓?duì)照組喂養(yǎng)從第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)入的普通飼料，造模組喂養(yǎng)由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心加工的高糖高脂飼料（1%膽固醇、0.2%豬膽鹽、15%蛋黃粉、22%蔗糖、22%豬油）。喂養(yǎng)4周后，造模組大鼠禁食12 h，然后腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）45 mg/kg（實(shí)驗(yàn)時(shí)STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，pH=4.5，配制成2%溶液），建立DN病模型。造模成功表現(xiàn)：72 h后尾靜脈采血測(cè)定血糖，高于16.7 mmol/L定為糖尿病模型［7］。

1.5 給藥方法將造模成功的22 只大鼠隨機(jī)分為模型組（10 只），地黃玄參組（6 只）、二甲雙胍組（6只）?？瞻讓?duì)照組及模型組給予蒸餾水2 mL/d，地黃玄參組4.5 g/（kg·d）（單日成人劑量地黃30 g、玄參20 g），二甲雙胍組200 mg/（kg·d），每日灌胃1次，持續(xù)給藥8周。藥物干預(yù)期間除空白對(duì)照組大鼠外，其余各組均有死亡，其中模型組5只、地黃玄參組1只、二甲雙胍組1只。

1.6 標(biāo)本采集

1.6.1 一般狀態(tài) 分別于0、2、4、6、8 周測(cè)定大鼠體質(zhì)量1 次，并觀察其精神狀況、毛發(fā)狀況、排便、排尿及飼料和水?dāng)z入情況。

1.6.2 血糖 采用尾靜脈采血法測(cè)定其空腹血糖。

1.6.3 腎功能及血脂 給藥8 周后，所有大鼠禁食12 h，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血8～10 mL，30 min 內(nèi)分離血清，采用全自動(dòng)生化測(cè)定儀測(cè)定血清肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）水平。

1.6.4 腎臟指數(shù)及腎臟病理觀察 處死大鼠并切取腎臟，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱重，部分腎組織多聚甲醛溶液固定后行常規(guī)病理檢測(cè)。腎臟指數(shù)=雙側(cè)腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)空白對(duì)照組健康狀況良好，毛發(fā)光澤，反應(yīng)靈敏，飲食正常，體形明顯增長(zhǎng)。模型組大鼠飲水量增多、攝食量增多、尿量增多，蜷臥畏寒聳背，精神萎靡，行動(dòng)遲緩，雙耳及尾巴毛色蒼白，體毛枯燥無(wú)光澤，體型消瘦。給藥組經(jīng)治療后，諸癥較模型組有所減輕且各治療組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 大鼠體質(zhì)量實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。造模1 周后，模型組及給藥組的體質(zhì)量均低于空白對(duì)照組（P＜0.001）；給藥組體質(zhì)量高于模型組（P＜0.05），給藥組間體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較（±s） g

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較（±s） g

注：▲表示與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05；※表示與二甲雙胍組比較，P＞0.05

組別空白對(duì)照組模型組地黃玄參組二甲雙胍組鼠數(shù)7 5 5 5 0周447.8±7.9 458.2±7.9 450.4±7.2 451.4±10.9 1周485.8±16.9 436.8±10.8▲429.4±14.0▲*※422.2±10.7▲*2周505.6±19.5 428.0±10.2▲415.6±22.7▲*408.0±16.9▲*3周536.0±11.9 413.6±4.3▲410.4±22.5▲*393.4±13.7▲*4周552.8±9.6 408.2±9.2▲410.8±16.1▲*382.0±12.3▲*組別空白對(duì)照組模型組地黃玄參組二甲雙胍組鼠數(shù)5周7 5 5 5 577.4±9.5 395.6±9.9▲416.8±14.3▲*6周589.2±12.9 380.2±14.8▲7周606.0±9.9 365.0±19.8▲8周616.0±10.7 337.2±12.6▲426.8±11.7▲*337.2±11.0▲*417.4±10.6▲*424.0±9.4▲*376.6±9.5▲*370.8±14.1▲*355.0±11.2▲*

2.3 大鼠血糖水平造模后，模型組及治療組大鼠與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給藥組血糖低于模型組（P＜0.05）；給藥組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖比較（±s） mmol/L

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖比較（±s） mmol/L

注：▲表示與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05；※表示與二甲雙胍組比較，P＞0.05

組別空白對(duì)照組模型組地黃玄參組二甲雙胍組8 周5.97±0.39 24.74±3.90▲19.46±6.20*※19.05±7.90*鼠數(shù)7 5 5 5 0周5.74±0.85 29.76±5.64▲25.62±4.34*※25.62±5.35*2 周7.01±0.80 25.36±2.64▲18.52±6.20*※23.30±8.62*6周5.93±0.63 24.12±1.61▲19.12±7.05*※20.37±7.50*

2.4 大鼠血脂、BUN 及Scr 水平TG、TC、BUN 及Scr水平，模型組及給藥組均明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01）；給藥組均明顯低于模型組（P＜0.01）；地黃玄參組均低于二甲雙胍組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠給藥8周后Scr、BUN、TG、TC及腎臟指數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠給藥8周后Scr、BUN、TG、TC及腎臟指數(shù)比較（±s）

注：▲表示與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05；※表示與二甲雙胍組比較，P＞0.05

組別空白對(duì)照組模型組地黃玄參組二甲雙胍組腎臟指數(shù)6.16±0.39 12.69±1.25▲9.17±1.97*※10.06±1.76▲鼠數(shù)Scr（μmol/L）7 5 5 5 BUN（mg/DL）23.64±2.53 42.25±3.23▲28.09±2.21▲*※28.76±1.23*▲37.14±6.67 774.41±42.92▲80.37±37.73▲*123.77±34.19▲*TG（mmol/L）0.68±0.14 9.30±2.91▲1.87±1.44*※2.40±1.23*TC（mmol/L）1.84±0.17 2.75±0.53▲2.09±0.34*※2.23±0.19*

2.5 大鼠腎臟指數(shù)與空白對(duì)照組比較，注射STZ顯著性的增加了大鼠腎臟指數(shù)值。給藥后各組大鼠的腎臟指數(shù)在第8周內(nèi)仍然顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。與模型組相比，給藥組腎臟指數(shù)在給藥后8周內(nèi)明顯降低（P＜0.05），二甲雙胍組與地黃玄參組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

2.6 腎組織形態(tài)病理觀察空白對(duì)照組大鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，紋理清楚，無(wú)明顯病理性結(jié)構(gòu)改變。與空白對(duì)照組相比，模型組出現(xiàn)腎小管中重度水腫，以及腎小球基底膜遭到破壞，球囊壁增厚，腎間質(zhì)中重度纖維化，腎小球結(jié)構(gòu)不清晰。與模型組相比，地黃玄參組腎小管輕度水腫，基底膜較模型組完整，球囊壁增厚不明顯，腎間質(zhì)輕度纖維化；二甲雙胍組基底膜出現(xiàn)輕度受損，腎小管中度水腫，間質(zhì)輕中度纖維化。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)觀察（HE，×400）

3 討論

腎臟是一個(gè)血管富集且容易損傷的器官，而DN 發(fā)病的病理基礎(chǔ)為血液高糖環(huán)境及脂代謝紊亂造成腎臟血流動(dòng)力學(xué)的改變，破壞腎臟微血管，引起局部MiC［8-9］。機(jī)體處于糖代謝及脂代謝異常的狀態(tài)下，持續(xù)高血糖狀態(tài)引起胰島素的抗脂解作用減弱及脂蛋白脂肪酶的活性降低，使得游離脂肪酸大量進(jìn)入血和肝臟中，使TC、TG 水平升高，過(guò)多的脂質(zhì)經(jīng)過(guò)代謝沉積于血管內(nèi)皮組織，會(huì)增加血漿黏度、減慢血流速度及損傷血管內(nèi)皮［10-12］。其中TC 含量過(guò)高會(huì)使紅細(xì)胞的變形能力下降，造成紅細(xì)胞的聚集，進(jìn)而使血小板的聚集性增高，TG水平的增高促進(jìn)血漿內(nèi)皮素的分泌，過(guò)高的內(nèi)皮素會(huì)損傷血管內(nèi)皮，引發(fā)MiC，促進(jìn)腎小球硬化的發(fā)生和發(fā)展［13-14］。血糖與血脂的紊亂為DN的首發(fā)因素，長(zhǎng)期高血糖使血液高濃、高黏、高聚，中醫(yī)辨證常示血瘀之證，而血瘀證的基本病理表現(xiàn)是MiC［15］?！端貑?wèn)·調(diào)經(jīng)論篇》云：“病在脈、調(diào)之血，病在血、調(diào)之絡(luò)?！彼约m正血液代謝紊亂成為目前治療DN的當(dāng)務(wù)之急。

地黃為玄參科植物地黃的干燥塊莖，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津之效。研究發(fā)現(xiàn)地黃寡糖可以明顯降低大鼠肝糖原的含量，降低血糖，在一定程度上逆轉(zhuǎn)脂代謝紊亂［16］。地黃梓醇能明顯降低四氧嘧啶導(dǎo)致的糖尿病小鼠的血糖水平、改善糖耐量和血脂水平，且療效與劑量呈依賴關(guān)系［3］。玄參性甘、苦、咸，微寒；歸肺、胃、腎經(jīng)。可清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)?！侗静菡x》載：“玄參療胸膈心肺熱邪，清膀胱肝腎熱結(jié)，故直走血分而通血瘀?！毙⒍嗵悄苋婊卣{(diào)糖代謝及脂代謝功能，促進(jìn)胰島素分泌量并升高C-肽水平，藥效接近于陽(yáng)性藥二甲雙胍［5］。地黃、玄參單味藥理研究均可以對(duì)DN 大鼠的血糖及血脂進(jìn)行調(diào)節(jié)，但是其配伍之后的藥理研究或缺。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料聯(lián)合STZ 腹腔注射誘導(dǎo)建立DN 模型，并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟給治療組進(jìn)行灌胃給藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：地黃配伍玄參可以有效維持DN 大鼠的體質(zhì)量，降低血糖及血清中TC、TG 含量，并有效糾正糖、脂代謝紊亂，減少BUN、Scr 的含量，保護(hù)腎功能，防治DN。

綜上所述，糖、脂代謝紊亂存在于DN初期，是誘發(fā)疾病進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵因素，也是始動(dòng)因素。地黃配伍玄參可以明顯改善DN大鼠的糖代謝、脂代謝紊亂，減輕腎臟損傷，從而保護(hù)腎臟功能，起到治療DN的作用。但是其通過(guò)何種效應(yīng)機(jī)制及何種通路對(duì)DN起到治療作用，還需要進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。