蠲痹湯“異病同治”法治療類風濕關節(jié)炎和強直性脊柱炎的網(wǎng)絡藥理學作用機制研究*

劉 寧，徐展望，王明喜，譚國慶△

1 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250035； 2 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250035

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節(jié)侵襲性炎癥為特征的全身免疫性疾病，可造成關節(jié)對稱性骨組織破壞，甚至導致關節(jié)畸形及功能障礙，嚴重影響患者生活質量［1］，但是目前RA的確切發(fā)病機制尚不清楚［2］。強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）同樣屬于慢性炎癥性風濕免疫疾病，常累及骶髂及中軸關節(jié)，后期出現(xiàn)“竹節(jié)樣”改變、活動障礙、慢性疼痛等癥狀，同樣存在軟骨變形、骨破壞等表現(xiàn)，具有較高致殘率［3］。RA 與AS 是臨床最常見的慢性風濕骨科疾病，給患者及社會帶來深重負擔，但免疫抑制劑、糖皮質激素、生物制劑等臨床常用藥物均存在不同程度不良反應［4］，因此尋找安全有效的治療方法迫在眉睫。而近年來隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，中藥組方在治療RA 及AS 方面取得良好療效，并且安全性得到廣泛認可。

《素問·痹論篇》指出：“風、寒、濕三氣雜至，合而為痹?！憋L寒濕等邪氣痹阻經(jīng)絡關節(jié)，影響氣血運行，導致筋骨慢性疼痛，RA 及AS 均可歸為中醫(yī)“痹證”范疇。蠲痹湯出自《醫(yī)學心悟》，由羌活、獨活、肉桂、秦艽、當歸、川芎、甘草、海風藤、桑枝、乳香、木香等藥物組成。方中羌活、獨活、秦艽、海風藤、桑枝祛風除濕，肉桂溫通經(jīng)脈、散寒止痛，當歸、乳香、川芎、木香養(yǎng)血活血、行氣止痛，甘草調和諸藥。全方祛風除濕，蠲痹止痛。近年來，蠲痹湯隨證加減在臨床治療“痹證”過程中取得顯著療效［5］。

網(wǎng)絡藥理學整體、系統(tǒng)的特點符合中醫(yī)整體觀及辨證論治理論，為進一步挖掘中藥藥理作用機制提供了科學方法［6］。RA 及AS 在發(fā)生發(fā)展過程中具有共同的病因病機。本研究基于中醫(yī)“異病同治”理論，依托網(wǎng)絡藥理學相關技術方法探討蠲痹湯干預RA及AS的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 RA 與AS 靶基因預測以“rheumatoid arthritis”“ankylosing spondylitis”作為 關鍵詞，在疾病基因數(shù)據(jù)庫（DisGeNET），人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards），人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫（OMIM），綜合型藥物數(shù)據(jù)庫（DrugBank）以及治療靶標數(shù)據(jù)庫（TTD）等5 個數(shù)據(jù)庫中，對RA 及AS 已知靶基因進行檢索與篩選，合并各數(shù)據(jù)庫的疾病靶基因，可獲得已明確的疾病靶點。

1.2 蠲痹湯有效成分篩選及靶點預測在中藥系統(tǒng)藥理學技術平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database platform，TCMSP）上，以蠲痹湯11 味中藥檢索其化學成分、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18、藥物對小腸上皮細胞的穿透性（caco-2）≥-0.4、180≤分子量（MW）≤500、脫水分配系數(shù)（AlogP）＜5 作為活性化合物的篩選條件［7］，對具有較高活性的化合物進行篩選提取，將得到的活性成分通過有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem）獲得相對應的SMILES 及2D 結構，并將2D 結構保存為sdf 格式。后將結構導入Swiss Target Prediction 及DrugBank 數(shù)據(jù)庫中對靶點進行預測，相似性閾值取為0.85，并把人類基因型作為條件篩查。導入蛋白質數(shù)據(jù)庫（Unitprot）進行基因的標準化處理。利用Cytoscape 3.7.2 軟件，構建其有效成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.3 蠲痹湯治療RA與AS的關鍵靶基因篩選將篩選出的蠲痹湯潛在靶基因與“1.1”項獲取的疾病靶基因交叉生成Venny 圖，得出蠲痹湯治療RA與AS 的映射靶基因，并借助Cytoscape 3.7.2 軟件構建關鍵靶點PPI 網(wǎng)絡圖，根據(jù)節(jié)點連接度（degree）值的大小進行篩選，得到蠲痹湯治療RA與AS 的核心靶基因，所獲取的靶基因則是同時對RA與AS起到調控作用的核心靶點，揭示出蠲痹湯干預RA及AS的可能作用機制。

1.4 生物通路及富集分析將“1.3”項篩選出的核心靶基因導入基因功能注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID），進行基因和基因組的京都百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析及基因本體論（gene ontology，GO）生物過程的富集分析。以P≤0.05 為篩選標準，分別將篩選出的前20 個GO 條目與KEGG 條目借助OmicShare 云平臺繪制富集分析氣泡圖。

2 結果

經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出153個活性成分，其中大于平均自由度的活性成分76 個，見表1。具有137 個靶點，活性物質-靶點關系網(wǎng)絡，見圖1。經(jīng)相關疾病數(shù)據(jù)庫搜索查重后，共選出RA與AS已知靶基因分別為729個、188個。映射出關鍵靶點23個，生成韋恩圖，見圖2。依托Cytoscape 3.7.2軟件構建相互作用PPI 網(wǎng)絡，見圖3，平均節(jié)點連接度（degree）為10.3，以degree≥11 篩選到核心靶點10個。經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫獲得119項GO富集結果及32 條KEGG 信號通路，通路下所含靶點見表2。以P值升序排列，分別篩選出符合條件的20個生物過程和信號通路，并將其以氣泡圖的形式展現(xiàn)出來，見圖4—5。

圖1 活性物質-靶點網(wǎng)絡圖

圖2 映射靶點韋恩圖

圖3 關鍵靶點相互作用PPI網(wǎng)絡

圖4 GO富集分析氣泡圖（前20條）

圖5 KEGG通路分析氣泡圖（前20條）

表1 活性成分表

表2 KEGG通路下所含靶基因（前20條）

3 討論

TCMSP 數(shù)據(jù)庫能夠充分挖掘中藥潛在活性成分，通過相關參數(shù)篩選認為槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素等是蠲痹湯的主要活性成分，基于“異病同治”理論，以上活性物質均可有效作用于RA 與AS的發(fā)生發(fā)展過程。槲皮素（quercetin）是具有抗氧化、抗炎作用的天然黃酮類物質，在各種骨關節(jié)炎癥中具有顯著作用。研究發(fā)現(xiàn)，誘導性關節(jié)炎大鼠模型關節(jié)腔液及軟骨中IL-1β、MMP-13 等炎癥相關因子水平表達升高，誘導了軟骨細胞凋亡，而槲皮素抑制NF-κB 激活后會改善相關炎癥環(huán)境，減少細胞凋亡，起到保護軟骨的作用［8］。此外滑膜成纖維細胞的異常增殖也會造成炎癥介質釋放及浸潤，降解細胞外基質，造成軟骨和骨質的損害。PAN等［9］研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過上調長鏈非編碼RNA MALAT1 表達，誘導滑膜成纖維細胞的凋亡過程，達到改善RA 癥狀保護關節(jié)軟骨的目的。AS同樣是一種長期慢性炎性疾病，各種免疫因子、炎癥細胞在AS 發(fā)病過程中具有重要作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)AS 患者骶髂關節(jié)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）呈高度表達，長期炎癥刺激引起椎板間小關節(jié)融合，同時韌帶炎癥復合物堆積引起腰背痛及晨僵［11］。研究顯示，槲皮素同樣能夠下調RAFLS 的活性，抑制其增殖及遷移，進而降低T 細胞所介導的炎性因子釋放，有效改善關節(jié)炎癥狀［12］。山柰酚的抗炎作用同樣明顯，通過調節(jié)炎癥基因轉錄及促炎酶活性，抑制轉錄因子、黏附分子表達調節(jié)炎癥水平［13］。動物實驗表明，山柰酚可通過上調叉頭框蛋白P3（forkhead box protein P3，F(xiàn)OXP3）表達水平改善膠原誘導關節(jié)炎癥狀，同時山柰酚減少FOXP3磷酸化，可能是山柰酚在預防和治療RA與AS等炎癥性疾病中的基礎［14］。

通過PP網(wǎng)絡可以看出靶點間具有復雜協(xié)同作用，干預RA與AS的發(fā)生發(fā)展過程，TNF、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF）、白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素1B（Interleukin-1B，IL-1B）等核心靶點具有較高自由度，可能起到關鍵作用。IL-6 拮抗劑在類風濕關節(jié)炎臨床應用中的良好療效說明了IL-6 在RA 中的重要地位。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6 在RA關節(jié)液中檢測到極高活性，其一方面促進RAFLS增殖，發(fā)生炎性浸潤及軟骨損傷；另一方面能夠增強白細胞介素1（Interleukin-1，IL-1）在RA 中的相關生物活性［15］。IL-1 主要由滑膜細胞產(chǎn)生，能夠誘導滑膜、軟骨細胞合成前列腺素E2和膠原酶，引發(fā)軟骨破壞。相關研究發(fā)現(xiàn)，IL-1是AS的易感基因，AS 患者體內IL-1 水平明顯高于對照組，同時IL-1B 因為能夠分泌于細胞外部，遠距離作用于靶細胞，所以在AS 炎癥中具有重要作用［16］。而IL-6 是T 細胞亞群分化的關鍵細胞因子，能夠持續(xù)誘導Th17細胞產(chǎn)生，參與AS免疫調節(jié)及免疫病理過程［17］。TNF-α 在炎癥反應中重要的促炎及免疫調節(jié)因子，TNF-α 的表達與IL-1、IL-6 呈正相關，當TNF-α 表達受抑制時，IL-1、IL-6 的產(chǎn)生也會相對減少［18］。TNF-α也能發(fā)揮類似IL-1生理作用，通過影響COX 對前列腺素的合成來抑制RA。TNF-α 也被認為是AS 的關鍵因子，因為在AS 患者骶髂關節(jié)部位存在明顯炎性浸潤及TNF-α 水平升高［19］。除上述討論外，血管生成構建也伴隨兩種疾病的發(fā)生發(fā)展。

AS 的早期病理變化是小關節(jié)滑膜炎，而此期間的滑膜翳生成、滑膜細胞增生均與血管通透性增加、血管過度增生有關［20］，VEGFA 的表達能夠調控血管生成與通透性。馬莉等［21］研究發(fā)現(xiàn)，VEGF主要參與滑膜翳生成，血管通透性增加在滑膜細胞增生方面其重要調控作用?；枭赏瑯悠毡榇嬖谟赗A 患者，并且其微環(huán)境主要特征是缺氧，血管構建及通透性增加能夠從一定程度上改善缺氧狀態(tài)。綜上所述，蠲痹湯通過多靶點“異病同治”RA 與AS，并且眾多炎癥因子協(xié)同作用調控體內炎癥氧化水平是治療的關鍵。

靶點間相互聯(lián)系進而調控體內多種生物過程，并且通過通路產(chǎn)生聯(lián)級反應干預疾病過程。富集分析發(fā)現(xiàn)蠲痹湯“異病同治”RA 與AS 還涉及一氧化氮生物合成過程的正調控、細胞因子活性、細胞對脂多糖的反應、降鈣素1-單加氧酶活性的正調控等多個生物過程。KEGG 通路分析也發(fā)現(xiàn)除非特異性通路外TNF 信號通路、NOD 樣受體通路、Toll 樣受體通路、HIF-1 信號通路等多條通路在RA 與AS 中具有重要作用。TNF 信號通路是典型的炎癥通路，IL-6、IL-1B、TNF 等多種炎性因子均是其通路下游靶點，并通過相互協(xié)同作用調控體內氧化應激水平及炎癥反應，干預RA與AS發(fā)生發(fā)展過程。先天性免疫應答是機體抗炎癥免疫的首要防線，NOD 樣受體及TOLL 樣受體是其兩種非特異性的模式識別受體。NOD 樣受體主要存在于細胞質內調控炎癥反應，動物實驗發(fā)現(xiàn)通過NOD1/NOD2 能夠增強NOD 樣受體激動劑所有誘導的白細胞介素分泌，進一步調節(jié)Th1、Th2 和Th17細胞的炎癥免疫［22］。此外NOD 樣受體通路還能夠轉導NF-κB 通路、MAPK 通路誘導CCL2 的分泌，調節(jié)T細胞應答［23］。Toll樣受體主要集中于細胞膜表面，同樣能夠激活NF-κB 通路、MAPK 通路分泌IL-1、IL-6、TNF-α等多種炎性因子，同時激活T細胞參與滑膜炎性反應及骨破壞［24］。因此下調NOD樣受體通路、Toll樣受體通路可能成為治療RA與AS的關鍵。缺氧是RA典型的微環(huán)境，而低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）能夠調節(jié)低氧環(huán)境適應性，進而調控RA 患者滑膜炎癥以及軟骨破壞等生物過程［25］。HIF-1α 不僅能夠通過調控一系列趨化因子促進纖維滑膜細胞遷移增殖，同時還能夠增強Toll 樣受體先天免疫功能發(fā)揮作用，促進炎癥因子的表達［26］。在強直性脊柱炎的發(fā)展過程中，炎性反應浸潤導致局部缺氧，從而導致血管新生，改善缺氧又促進炎性因子遷移浸潤。HIF-1在AS病程中主要調控以下方面：關節(jié)滑膜新生、調節(jié)炎癥反應、參與局部病變等。綜上所述，蠲痹湯通過多條炎癥相關通路能夠同時治療RA 與AS 兩種疾病，起到“異病同治”的治療作用。

從中醫(yī)角度來看，不同疾病在發(fā)展的不同階段會產(chǎn)生相同或相近的病理變化，根據(jù)辨證論治的原則，治法也就相同，稱為“異病同治”。炎癥反應及體內氧化應激普遍存在于RA 與AS 的發(fā)生發(fā)展過程，而本文通過網(wǎng)絡藥理學較為科學的發(fā)現(xiàn)蠲痹湯眾多活性物質均是通過誘導相關炎癥靶點作用于多條特異性通路來調節(jié)體內炎癥水平，達到改善RA與AS臨床癥狀的治療目的。