砂仁對(duì)反流性食管炎大鼠食管黏膜的保護(hù)作用*

馬 瓊，閆龍騰，趙 茜，胡冬雄

1 云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650504；2 云南省高校中醫(yī)證候微觀辨證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650504

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）是臨床中常見的胃腸道疾病，其發(fā)生原因?yàn)槲?、十二指腸的內(nèi)容物反流到食管進(jìn)而引起食管黏膜損傷［1］。近年來隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，特別是高能量食物攝入的增加，本病的發(fā)生率逐年升高［2］，已經(jīng)引起了大量學(xué)者的關(guān)注。治療本病的藥物在西藥領(lǐng)域以奧美拉唑?yàn)榇恚?］，中藥在治療本病方面具有較多的優(yōu)勢，具有用藥靈活、毒副作用小等特點(diǎn)［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，砂仁藥理活性較高，對(duì)十二指腸炎、胃潰瘍、淺表性胃炎等腸胃疾病均具有很好的調(diào)節(jié)作用［5-7］。本研究采用“4.2 mm 幽門夾+胃底2/3 結(jié)扎術(shù)”法構(gòu)建了RE 大鼠模型，以觀察砂仁對(duì)其是否有調(diào)節(jié)作用，并從氧化應(yīng)激和一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase2，NOS2）方面研究其作用機(jī)制，為臨床治療RE提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)雄性SD 大鼠100 只，體質(zhì)量160～180 g，購于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滇）2015-0002。飼養(yǎng)條件：大鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房：溫度22～27 ℃，濕度40%～60%，光照/黑暗=12 h/12 h，日常自由飲水和進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南。

1.2 藥品及試劑25%砂仁水提液（昆明植分生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：120985-201406）；奧美拉唑（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20059769，規(guī)格：10 mg/粒）；超氧化物歧化酶試劑盒（superoxide dismutase，SOD）（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：S0088）；丙二醛試劑盒（malondialde-hyde，MDA）（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：MM-21303R1）；大鼠一氧化氮（nitric oxide，NO）（ELISA）試劑盒［研域（上海）化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：A013-2-1］；血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）抗體（德國Abcam 公司，批號(hào)：40077-57-4）；P 物質(zhì)（substance P，SP）（批號(hào)：S0073）、NOS2 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Santa 公司，批號(hào)：abx053065，AB-2834113）；二抗（北京中杉金橋生物科技公司，批號(hào)：A9169-2ML）；PVDF 膜（德國默克生命科學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：LM1136）；引物由上海生物生工提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器HZK-110 型電子分析天平（賽恩斯儀器設(shè)備有限公司）；725 型超低溫冰箱（美國Thermo Forma 公司）；TGL-16.5M 型低溫高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；UV-8000型紫外-可見分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）；YT-MB96 型酶標(biāo)儀（山東云唐智能科技有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra 型蛋白電泳儀（美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；CFX384Touch 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 100 只SD 大鼠，隨機(jī)選取10只作為假手術(shù)組，其余90 只構(gòu)建RE 動(dòng)物模型，模型構(gòu)建成功后，排除死亡以及造模不成功的大鼠后，隨機(jī)選取50 只，將其分為模型組，奧美拉唑組，砂仁低、中、高劑量組，每組10只。

1.4.2 造模方法 采用鄒文獻(xiàn)［6］“4.2 mm 幽門夾+胃底2/3 結(jié)扎術(shù)”構(gòu)建RE 大鼠模型，模型構(gòu)建時(shí)，采用3 mL，1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)使其胸腹部充分暴露，并用繃帶將其四肢和牙齒固定，固定后采用寬度為3.0 mm 的雙扁鐵心扎線在纏繞成一個(gè)直徑為4.2 mm 的幽門夾，后切開腹部組織，找到幽門和十二指腸交界處，給其套上幽門夾并用血管鉗夾緊，后以3/0 線系住幽門夾閉合端，另一端結(jié)扎2/3 胃底。上述完成后給予腹腔注射頭孢拉定和甲硝唑以防止其感染，完成后采用縫合線縫合腹膜和皮膚，再次用酒精消毒后即完成手術(shù)，假手術(shù)組只開腹不做其他處理，15 min 后逐層縫合腹部傷口。所有大鼠術(shù)后禁食不禁水24 h，24 h 后可自由飲食。術(shù)后2周，每組各取2只麻醉處死收集食管組織，將其采用組織固定液固定24 h 后取出，行HE 染色觀察病理學(xué)，當(dāng)顯示有明顯組織病理學(xué)改變后確認(rèn)造模成功。

1.4.3 給藥方法 假手術(shù)組和模型組給予2 mL生理鹽水灌胃，奧美拉唑組給予奧美拉唑2 mL/（kg·d）灌胃，砂仁低、中、高劑量組分別給予砂仁水提取液5、10、20 mL/（kg·d）灌胃。治療時(shí)間為4周。

1.5 標(biāo)本采集治療4 周后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，剖開大鼠腹腔，將食道取出，平均分為3 個(gè)部分，其中一部分置入組織固定液中保存用于HE 染色，另一部分取出后直接放入超低溫冰箱備用于相關(guān)蛋白和生化指標(biāo)的檢測，最后一部分浸入RNA保護(hù)液中用于相應(yīng)mRNA的檢測。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 HE 染色組織病理學(xué)觀察 從組織固定液中取出食道組織，由武漢塞維爾生物按照常規(guī)操作完成制作，采用熒光倒置顯微鏡采集大鼠食管組織病理圖片。根據(jù)《反流性食管炎診斷及治療指南（2003 年）》的ER 基本病理改變，觀察食管鱗狀上皮增生，黏膜增厚，黏膜固有層乳頭向表面凸起情況，以及上皮層內(nèi)黏膜炎細(xì)胞浸潤情況。

1.6.2 MDA、SOD 及NO 含量檢測 從超低溫冰箱中取出食道組織，稱取50 mg，加入0.5 mL 預(yù)先冷卻過的生理鹽水充分碾磨使其勻漿，完成后將其進(jìn)行離心（離心半徑：10 cm，2500 r/min，4 ℃）15 min。完成后提取上清，根據(jù)試劑盒提供的說明書檢測MDA、SOD以及NO含量即可。

1.6.3 VIP、SP和NOS2蛋白表達(dá)檢測 稱取100 mg食道組織，采用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白后，BCA法對(duì)其進(jìn)行定量并調(diào)平，再每組各取50 ug行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳，電泳完成后將其用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，完成后采用牛血清蛋白封閉2 h，后加入一抗過夜，次日加入二抗1 h，PBS 洗滌后暗室曝光洗片即完成，結(jié)果比較采用Image J計(jì)算各條帶的灰度值即可。

1.6.4 VIP、SP和NOS2 mRNA的檢測 稱取20 mg食道組織，提取總RNA后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，完成后每組各取2 μg 行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件為95 ℃ 2 min、94 ℃10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 40 s，循環(huán)次數(shù)34 次。分析比較結(jié)果采用2-ΔΔCt法。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用One-Way ANOVA 單因素方差分析，多組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)變化大鼠食管組織HE 染色可見，假手術(shù)組食管黏膜較為光滑、結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞排列整齊，沒有炎癥現(xiàn)象，而模型組則出現(xiàn)明顯的黏膜增厚，同時(shí)角質(zhì)化增厚，局部黏膜有乳頭樣凸起，各治療組相較于模型組病理學(xué)變化有明顯改善，且隨著劑量的升高，食管病理改善效果越明顯；與奧美拉唑組相比，砂仁低、中劑量組改善食管病理學(xué)情況沒有奧美拉唑組顯著，而高劑量組與奧美拉唑組療效相似。見圖1。

2.2 大鼠食管組織氧化和抗氧化指標(biāo)與假手術(shù)組相比，模型組大鼠食管黏膜組織中SOD明顯降低（P＞0.05），而NDA和NO則明顯升高（P＞0.05）；與模型組相比，各治療組SOD 明顯升高，而MDA 和NO明顯降低（P＞0.05）。隨著砂仁劑量的升高，SOD明顯升高、MDA 和NO 降低的效果越來越好。與低劑量相比，砂仁高劑量組SOD 明顯升高、MDA 和NO顯著降低（P＞0.05），而與砂仁中劑量相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過與奧美拉唑組相比，砂仁低、中劑量組SOD水平降低、MDA和NO水平升高（P＞0.05）；而SOD、MDA 和NO水平高劑量組與奧美拉唑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠食管組織中氧化和抗氧化指標(biāo)比較（±s）

表2 各組大鼠食管組織中氧化和抗氧化指標(biāo)比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*表示P＞0.05；與模型組相比，#表示P＞0.05；與奧美拉唑組相比，^表示P＞0.05；與低劑量組相比，**表示P＞0.05；與中劑量組相比，***表示P＞0.05

SOD（U/gprot）162.68±16.72 89.67±32.27*136.76±16.58#105.18±17.25#^124.62±16.21#^**134.57±15.36#**組別假手術(shù)組模型組奧美拉唑組砂仁低劑量組砂仁中劑量組砂仁高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 MDA（nmol/mgprot）4.68±1.08 10.35±2.14*6.53±1.06#8.04±1.45#^7.56±1.21#^6.68±1.04#**NO（μmol/gprot）2.01±0.52 4.58±0.65*3.06±0.41#4.20±0.43#^3.76±0.51#^3.15±0.48#**

2.3 VlP、SP和NOS2蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比，模型組大鼠VIP 蛋白表達(dá)明顯降低（P＞0.05），SP 和NOS2 蛋白表達(dá)明顯升高（P＞0.05），而各治療組相較于模型組，VIP 則明顯升高（P＞0.05），SP 和NOS2 明顯降低（P＞0.05），且隨著砂仁劑量的升高，VIP 升高、SP 和NOS2 降低水平越明顯。與低劑量相比，砂仁中、高劑量組VIP 明顯升高（P＞0.05），SP 和NOS2 明顯降低（P＞0.05），而高劑量與中劑量相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與奧美拉唑組相比，砂仁低、劑量組VIP 蛋白表達(dá)降低（P＞0.05），SP 和NOS2 蛋白表達(dá)升高（P＞0.05）；砂仁中、高劑量組改善SP 和VIP 蛋白表達(dá)情況優(yōu)于奧美拉唑組（P＞0.05），而改善NOS2蛋白表達(dá)水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2，表3。

圖2 各組大鼠食管組織VIP、SP和NOS2蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組大鼠食管組織VlP、SP和NOS2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠食管組織VlP、SP和NOS2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*表示P＞0.05；與模型組相比，#表示P＞0.05；與奧美拉唑組相比，^表示P＞0.05；與砂仁低劑量組相比，**表示P＞0.05；與砂仁中劑量組相比，***表示P＞0.05

VIP 0.82±0.06 0.48±0.12*0.56±0.09#0.53±0.12#0.68±0.07#^**0.79±0.07#^**組別假手術(shù)組模型組奧美拉唑組砂仁低劑量組砂仁中劑量組砂仁高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 NOS2 0.65±0.12 1.15±0.14*0.68±0.08#0.87±0.12#^0.76±0.11#**0.73±0.14#**SP 0.27±0.08 0.98±0.15*0.46±0.10#0.57±0.16#^0.44±0.13#^**0.35±0.11#^**

2.4 VlP、SP及NOS2 mRNA表達(dá)與假手術(shù)組相比，模型組大鼠VIP 蛋白表達(dá)明顯降低（P＞0.05），SP和NOS2 蛋白表達(dá)明顯升高（P＞0.05），而各治療組相較于模型組，VIP 則明顯升高（P＞0.05），SP和NOS2 明顯降低（P＞0.05），且隨著劑量的升高，改善效果越顯著。與砂仁低劑量相比，砂仁中、高劑量組VIP 則明顯升高（P＞0.05），SP 和NOS2 明顯降低（P＞0.05）；砂仁中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與奧美拉唑組相比，各治療組VIP 升高，SP 和NOS2 降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。砂仁高劑量組表現(xiàn)出最優(yōu)劑量。見表4。

表4 各組大鼠食管組織VlP、SP和NOS2 mRNA表達(dá)量（±s）

表4 各組大鼠食管組織VlP、SP和NOS2 mRNA表達(dá)量（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*表示P＞0.05；與模型組相比，#表示P＞0.05；與奧美拉唑組相比，^表示P＞0.05；與砂仁低劑量組相比，**表示P＞0.05；與砂仁中劑量組相比，***表示P＞0.05

VIP 1.02±0.01 0.57±0.09*0.80±0.07#0.74±0.06#0.79±0.06#0.84±0.05#**組別假手術(shù)組模型組奧美拉唑組砂仁低劑量組砂仁中劑量組砂仁高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 NOS2 1.02±0.00 1.79±0.16*1.28±0.12#1.36±0.10#1.27±0.08#**1.23±0.09#**SP 1.01±0.01 1.96±0.23*1.47±0.10#1.56±0.11#1.54±0.10#**1.45±0.12#**

3 討論

近年來RE 受到了眾多學(xué)者的關(guān)注，目前西醫(yī)治療本病的藥物有抑酸藥（奧美拉唑、蘭索拉唑等）、促進(jìn)胃腸動(dòng)力藥（潘利酮等）和胃黏膜保護(hù)劑（鉍劑、前列腺素及其衍生物等）等［8］，上述藥物在使用后見效快，但是不良反應(yīng)相對(duì)較多，且具有較高的復(fù)發(fā)率。RE 在中醫(yī)學(xué)中屬于“反胃”“嘈雜”“吞酸”“嘔吐”“梅核氣”等范疇，中醫(yī)常以辛開苦降、滋胃降逆法為主治療。中醫(yī)藥可明顯改善本病癥狀，同時(shí)減輕患者炎癥損傷，促進(jìn)食管修復(fù)［9］。

砂仁屬于藥食同源類藥物，其味辛、性溫，歸脾和胃經(jīng)，主要功效為化濕行氣、寬中止嘔、暖脾止瀉、安胎、祛痰等［10］。研究發(fā)現(xiàn)，砂仁具有較高的藥理活性，特別是在改善胃腸運(yùn)動(dòng)、保護(hù)胃黏膜、排除消化管積氣和消炎止痛等方面具有明顯的優(yōu)勢。曹羽等［11］發(fā)現(xiàn)，砂仁能夠加速患者胃部手術(shù)后的胃腸功能恢復(fù)，在臨床水平上驗(yàn)證了砂仁能夠促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)的機(jī)制，這可能與其促進(jìn)體內(nèi)胃動(dòng)素（motilin，MLT）、P 物質(zhì)（substance P，SP）的分泌釋放有關(guān)。ZHANG 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，砂仁揮發(fā)油可增加5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）誘導(dǎo)大鼠的體質(zhì)量，減輕其腹瀉癥狀，砂仁揮發(fā)油能通過抑制細(xì)胞凋亡、減輕腸胃炎和增強(qiáng)腸黏膜屏障等作用逆轉(zhuǎn)腸道和炎癥的組織病理學(xué)變化，并減少病原細(xì)菌的數(shù)量，增加益生菌的含量，有效阻止化療后腸黏膜炎的發(fā)生和發(fā)展。雖然砂仁已經(jīng)廣泛運(yùn)用于胃腸道黏膜損傷疾病的治療中并且取得較為滿意的成效，但是砂仁在RE 中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。本次研究結(jié)果表明，在給予RE 大鼠砂仁水提液低、中、高劑量及陽性藥物后，食管的病理損傷減輕，且砂仁水提液的高劑量可與陽性藥物組效果媲美。表明砂仁水提液可保護(hù)RE 大鼠食管黏膜。

關(guān)于RE 的發(fā)生機(jī)制，目前認(rèn)為，其是因各種生理因素造成的上消化道動(dòng)力障礙導(dǎo)致酸性反流性的炎癥疾?。?3］。上消化道動(dòng)力障礙可引起下食管括約肌松弛，延遲胃排空時(shí)間，引起胃內(nèi)容物反流進(jìn)入食道，食管黏膜防御能力減弱，最終引發(fā)食管發(fā)生病變［14］。在上述過程中，食管下括約?。╨ow esophageal sphincter，LES）占有關(guān)鍵地位［15］，LES 功能狀態(tài)可受到多種激素或神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)［16］，其中對(duì)神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)主要是指其功能狀態(tài)受到胃腸激素和胃腸神經(jīng)的雙重調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)胃腸神經(jīng)的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白為血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）和SP，其中SP可引起LES收縮，而VIP的作用正好相反，主要作用為抑制神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，減弱LES 的收縮能力［17-18］。除上述VIP 和SP 外，NO 也是調(diào)節(jié)收縮功能的重要因子［19-20］，NO主要受旁分泌調(diào)控，主要由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）合成，NOS 又分為3 個(gè)亞型，而與RE相關(guān)性較大的主要為NOS2。NOS2 在正常狀態(tài)下表達(dá)并不明顯，其在經(jīng)過細(xì)胞因子刺激后可過量表達(dá)，進(jìn)而釋放大量的NO，最終使得LES發(fā)生松弛，給機(jī)體帶來損失。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)砂仁水提液及陽性藥物治療后，RE 大鼠SOD 含量明顯升高，血清MDA、NO明顯降低，表明砂仁水提液可通過調(diào)節(jié)NO、SOD 及MDA 的分泌進(jìn)而提高大鼠食管的抗氧化能力，為食管黏膜組織的修復(fù)提供有利條件。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠VIP蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低，SP 和NOS2 蛋白及mRNA 表達(dá)明顯升高，而采用砂仁水提液治療后，VIP明顯升高，SP和NOS2明顯降低，這提示砂仁可以明顯改善上述3 個(gè)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制食管括約肌松弛，調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，最終保護(hù)食管。

基于上述討論提示，砂仁對(duì)RE 具有較好的療效，其可以明顯地改善食管黏膜，提高抗氧化能力，分析其作用機(jī)制，可能與砂仁可改善VIP、SP和NOS2 蛋白和mRNA 表達(dá)，進(jìn)而提高胃排空、保護(hù)食管黏膜有關(guān)。