甘木通醇提物通過miR-142-3p對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs損傷及SOD、MDA、CAT的影響

袁向科 江瑞

(1河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院周圍血管科,河南 鄭州 450003;2河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院心血管科)

周圍血管病包括動脈、靜脈及淋巴三個系統(tǒng)的疾病,其中粥樣動脈硬化斑塊及血栓造成的動脈狹窄閉塞臨床上比較常見,動脈粥樣硬化是隨著年齡增長而出現(xiàn)的血管疾病,是動脈的一種非炎癥性病變,可使動脈管壁增厚、變硬,失去彈性、管腔狹窄,包括脂質(zhì)沉積,炎癥和氧化應(yīng)激〔1,2〕。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制復(fù)雜,尚未得到充分闡明。內(nèi)皮功能障礙是與各種危險因素相關(guān)的早期促動脈粥樣硬化過程。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑,可刺激內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激和凋亡〔3〕。甘木通(Clematis filamentosa Dunn)為毛茛科絲鐵線蓮的葉,臨床常用于治療冠心病、高血壓等疾病,既往研究表明,甘木通醇提物對家兔動脈粥樣硬化的形成具有一定的防治效果〔4〕。但甘木通醇提物是否能阻止人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)免受ox-LDL誘導(dǎo)的損傷,其潛在機制尚未得到研究。微小RNA(miRNA)已被報道在包括內(nèi)皮損傷在內(nèi)的各種病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔5〕。資料顯示,miR-142-3p在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中被上調(diào),參與內(nèi)皮細胞功能障礙和動脈粥樣硬化病理進展〔6,7〕。說明miRNA參與調(diào)節(jié)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷。但是,需要進一步研究闡明miRNA是否參與介導(dǎo)甘木通醇提物對ox-LDL損傷HUVECs的保護作用。本研究通過ox-LDL處理HUVECs建立動脈粥樣硬化模型,觀察甘木通醇提物在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中的功能,并結(jié)合miR-142-3p,最終闡明甘木通醇提物的潛在保護機制。

1 材料與方法

1.1藥材、細胞與試劑 甘木通藥材購自廣東雷霆國藥有限公司,ox-LDL購自北京索萊寶公司,人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)購自美國模式培養(yǎng)物保存中心(ATCC),RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司,anti-miR-142-3p及陰性對照anti-miR-NC購自廣州銳博生物公司,Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司,細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自日本Dojindo公司,二喹啉甲酸酸(BCA)蛋白檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司,兔抗細胞核相關(guān)抗原(Ki-67)、兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自上海艾博抗公司,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2甘木通醇提物的制備 取甘木通藥材,粉碎成粉末,參照胡宗禮等〔4〕的報道,以1∶20的料液比加入70%乙醇,回流提取1 h,重復(fù)3次,收集3次提取的濾液,減壓濃縮成棕褐色浸膏,即為甘木通醇提物。甘木通醇提物利用培養(yǎng)基稀釋成10、50、100 ng/ml的濃度備用。

1.3細胞培養(yǎng) HUVECs在RPMI1640培養(yǎng)基中,其中包含10% FBS、1%青鏈霉素,并于37 ℃、5% CO2、飽和濕潤的培養(yǎng)箱中生長。每周換液2～3次。

1.4細胞分組與轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的HUVECs分為對照組(未處理HUVECs),模型組(100 mg/L ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs 24 h〔8〕),實驗1組(10 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h),實驗2組(50 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h),實驗3組(100 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h),anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 24 h后給予100 mg/L ox-LDL處理24 h),anti-miR-142-3p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-142-3p 24 h后給予100 mg/L ox-LDL處理24 h),實驗3組+anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 24 h后給予100 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL處理24 h),實驗3組+anti-miR-142-3p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-142-3p 24 h后給予100 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL處理24 h)。細胞轉(zhuǎn)染時,在6孔板中接種HUVECs,待細胞融合至70%左右時,嚴格依照Lipofectamine2000試劑的說明,將anti-miR-142-3p、anti-miR-NC轉(zhuǎn)染到HUVECs中,轉(zhuǎn)染24 h后,利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)評價轉(zhuǎn)染情況,并根據(jù)上述分組進行處理。

1.5CCK-8法檢測HUVECs增殖 在96孔板中接種HUVECs,每孔5×104個細胞。經(jīng)不同的處理后,加入CCK-8溶液10 μl,于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中孵育,1 h后于酶標(biāo)儀在450 nm下測量光密度(OD)值,分析細胞存活率(%)。

1.6流式細胞術(shù)評估HUVECs凋亡 按照細胞凋亡檢測試劑盒的規(guī)程,各組HUVECs處理結(jié)束后,加入結(jié)合緩沖液重懸,收集1×105個細胞,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻,5 μl PI工作液,混勻后遮光反應(yīng)15 min,通過流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.7Western印跡分析Ki-67、Caspase3蛋白表達 HUVECs加入放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液抽提蛋白,經(jīng)BCA蛋白檢測試劑盒定量,蛋白樣品加入5×上樣緩沖液(4∶1)并在沸水中變性。將30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。將膜用5%脫脂奶粉室溫封閉,1 h后與抗Ki-67(1∶1 000稀釋)、抗Caspase3(1∶1 000稀釋)和參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,1∶2 000稀釋)抗體4 ℃孵育過夜。次日加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h,加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.8qRT-PCR測定miR-142-3p表達 使用TRIzol試劑從各組HUVECs中提取總RNA,采用SYBR PrimeScript試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,通過SYBR Premix Ex Taq試劑盒在ABI 7300 real-time PCR 系統(tǒng)進行PCR。收集Ct值,由2-ΔΔCt方法分析miR-142-3p表達。引物序列為:miR-142-3p上游5′-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3′和下游5′-CGACGTGTAGTGTTTCCTA-3′,U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游5′-AACGCTTCA-CGAATTTGCGT-3′。

1.9比色法檢測SOD、MDA、CAT水平 HUVECs處理結(jié)束后,收集細胞上清液,分別遵循SOD、MDA、CAT檢測試劑盒說明書的操作步驟,采用比色法檢測SOD、MDA、CAT水平。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響 與對照組相比,模型組HUVECs存活率明顯降低,凋亡率顯著升高,Ki67蛋白表達量明顯減少,Caspase3蛋白表達量顯著增加(P<0.05);與模型組相比,實驗1組細胞的存活率、凋亡率、Ki67、Caspase3蛋白表達無顯著變化(P>0.05),而實驗2組、實驗3組HUVECs的存活率明顯增加,凋亡率顯著減少,Ki67蛋白表達水平明顯升高,Caspase3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),且甘木通醇提物濃度越高,作用效果越顯著。見圖1、表1、圖2。

2.2甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中SOD、MDA、CAT及miR-142-3p表達的影響 與對照組相比,模型組HUVECs內(nèi)miR-142-3p表達量明顯增加,SOD、CAT活性顯著降低,MDA含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,實驗1組HUVECs的miR-142-3p、SOD、MDA、CAT水平無明顯變化(P>0.05),但實驗2組、實驗3組HUVECs內(nèi)miR-142-3p表達量顯著減少,SOD、CAT活性明顯升高,MDA含量顯著降低(P<0.05),且甘木通醇提物濃度越高,作用效果越顯著。見表1。

圖1 甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡

表1 甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響及HUVECs中SOD、MDA、CAT及miR-142-3p表達

1～5:對照組、模型組、實驗1組、實驗2組、實驗3組圖2 各組Ki67、Caspase3蛋白表達

2.3干擾miR-142-3p的表達 anti-miR-142-3p組miR-142-3p的表達量顯著低于anti-miR-NC組(0.27±0.01 vs 1.00±0.04;t=53.115;P=0.000)。

2.4干擾miR-142-3p對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷及SOD、MDA、CAT水平的影響 與anti-miR-NC組相比,anti-miR-142-3p組細胞的存活率明顯增加,凋亡率顯著減少,Ki67蛋白表達量明顯升高,Caspase3蛋白表達量顯著降低,并且SOD和CAT活性明顯升高,MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 干擾miR-142-3p對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷及SOD、MDA、CAT水平的影響

圖3 干擾miR-142-3p對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡及 Ki67、Caspase3蛋白表達的影響

2.5干擾miR-142-3p可增強甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響 與實驗3組+anti-miR-NC組相比,實驗3組+anti-miR-142-3p組明顯增加ox-LDL損傷的HUVECs的存活率,顯著減少細胞的凋亡率,明顯提高Ki67蛋白表達水平,顯著降低Caspase3蛋白表達水平(P<0.05)。見圖4、表3。

2.6干擾miR-142-3p可增強甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中SOD、MDA、CAT的水平 與實驗3組+anti-miR-NC組相比,實驗3組+anti-miR-142-3p組明顯提高ox-LDL損傷的HUVECs中SOD和CAT活性,而顯著降低MDA含量(P<0.05)。見表3。

表3 干擾miR-142-3p可增強甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的作用及HUVECs中SOD、MDA、CAT的水平

3 討 論

對于動脈粥樣硬化引起的周圍血管動脈閉塞及由于內(nèi)壁損傷導(dǎo)致的動脈瘤臨床上常采用手術(shù)的治療方法,但動脈粥樣硬化是一種全身性炎癥性疾病〔9〕。通常認為,內(nèi)皮細胞損傷和凋亡是動脈粥樣硬化發(fā)病機理的基礎(chǔ)和初始步驟〔10〕。ox-LDL通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷和凋亡而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展,ox-LDL被認為是動脈粥樣硬化的重要診斷生物標(biāo)志物〔11〕。因此,抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷可能是抗動脈粥樣硬化的一種新型有效治療方法,從而在治療動脈硬化性周圍血管疾病方面可以起到從源頭治療的目的。

ox-LDL已被廣泛用于建立動脈粥樣硬化的體外模型,可通過多種機制參與動脈粥樣硬化的過程。如ox-LDL預(yù)處理可能誘導(dǎo)人臍帶血內(nèi)皮細胞(HUCBECs)細胞活力下降,細胞凋亡增加〔12,13〕。Caspase3蛋白是細胞凋亡的一種效應(yīng)蛋白,在兩個主要的程序性細胞死亡相關(guān)途徑(即死亡受體和細胞應(yīng)激途徑)匯合的步驟中發(fā)揮作用,ox-LDL誘導(dǎo)的Caspase3表達上調(diào)提示凋亡的發(fā)生〔14〕。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的重要因果機制。研究表明,氧化應(yīng)激是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵特征,這是由于抗氧化能力與包括活性氧在內(nèi)的物質(zhì)之間的不平衡而產(chǎn)生的〔15〕。與前述報道相符,這項研究同樣發(fā)現(xiàn),100 mg/L ox-LDL處理可以降低細胞增殖、抗氧化酶SOD、CAT活性和Ki67蛋白的表達,還可顯著增加凋亡細胞的數(shù)量、Caspase3蛋白表達和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量。

甘木通作為我國傳統(tǒng)中藥,具有降血壓、增加冠脈流量、耐缺氧等藥理活性。有學(xué)者〔16〕指出,甘木通總黃酮能夠減輕缺血再灌注導(dǎo)致的氧化應(yīng)激,通過增強SOD活性和抑制MDA的生成,產(chǎn)生抗脂質(zhì)過氧化活性〔17〕。甘木通總黃酮還可促進表柔比星所致的細胞增殖,抑制細胞凋亡和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)〔18〕。本研究證明,50、100 ng/ml濃度的甘木通醇提物可以保護ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷,一方面促進ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs增殖、Ki67蛋白表達,抑制細胞凋亡和Caspase3蛋白表達,另一方面可以減少ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,提通過減少MDA含量,并上調(diào)SOD和CAT活性來改善細胞的抗氧化防御系統(tǒng),這與前人報道〔4〕的甘木通醇提物抗動脈粥樣硬化的效果相符。

miRNA是內(nèi)源性非編碼RNA,調(diào)節(jié)基因的表達,并在各種病理和生理過程扮演重要角色,包括增殖,分化,侵襲和凋亡〔19〕。證據(jù)表明,某些miRNA可以通過靶向基因或關(guān)鍵途徑而成為動脈粥樣硬化的必要調(diào)節(jié)因子〔20〕。根據(jù)報道,miR-142-3p在腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用,它可以在不同類型的癌癥中充當(dāng)癌基因或抑癌基因〔21,22〕。miR-142-3p對脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡具有抑制作用〔23〕,在高血壓狀態(tài)下,miR-142-3p可以促進內(nèi)皮細胞的增殖并抑制其凋亡〔24〕。本研究結(jié)果說明,甘木通醇提物通過下調(diào)miR-142-3p的表達在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷中起保護作用。

綜上所述,甘木通醇提物可以保護ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷,促進細胞增殖,抑制細胞凋亡并改善氧化應(yīng)激,這種保護作用與調(diào)控miR-142-3p表達有關(guān),為甘木通醇提物預(yù)防動脈粥樣硬化及治療動脈硬化性周圍血管疾病提供了新方向。