• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甘木通醇提物通過miR-142-3p對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs損傷及SOD、MDA、CAT的影響

    2023-11-27 13:04:58袁向科江瑞
    中國老年學(xué)雜志 2023年22期
    關(guān)鍵詞:木通提物氧化應(yīng)激

    袁向科 江瑞

    (1河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院周圍血管科,河南 鄭州 450003;2河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院心血管科)

    周圍血管病包括動脈、靜脈及淋巴三個系統(tǒng)的疾病,其中粥樣動脈硬化斑塊及血栓造成的動脈狹窄閉塞臨床上比較常見,動脈粥樣硬化是隨著年齡增長而出現(xiàn)的血管疾病,是動脈的一種非炎癥性病變,可使動脈管壁增厚、變硬,失去彈性、管腔狹窄,包括脂質(zhì)沉積,炎癥和氧化應(yīng)激〔1,2〕。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制復(fù)雜,尚未得到充分闡明。內(nèi)皮功能障礙是與各種危險因素相關(guān)的早期促動脈粥樣硬化過程。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑,可刺激內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激和凋亡〔3〕。甘木通(Clematis filamentosa Dunn)為毛茛科絲鐵線蓮的葉,臨床常用于治療冠心病、高血壓等疾病,既往研究表明,甘木通醇提物對家兔動脈粥樣硬化的形成具有一定的防治效果〔4〕。但甘木通醇提物是否能阻止人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)免受ox-LDL誘導(dǎo)的損傷,其潛在機制尚未得到研究。微小RNA(miRNA)已被報道在包括內(nèi)皮損傷在內(nèi)的各種病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔5〕。資料顯示,miR-142-3p在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中被上調(diào),參與內(nèi)皮細胞功能障礙和動脈粥樣硬化病理進展〔6,7〕。說明miRNA參與調(diào)節(jié)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷。但是,需要進一步研究闡明miRNA是否參與介導(dǎo)甘木通醇提物對ox-LDL損傷HUVECs的保護作用。本研究通過ox-LDL處理HUVECs建立動脈粥樣硬化模型,觀察甘木通醇提物在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中的功能,并結(jié)合miR-142-3p,最終闡明甘木通醇提物的潛在保護機制。

    1 材料與方法

    1.1藥材、細胞與試劑 甘木通藥材購自廣東雷霆國藥有限公司,ox-LDL購自北京索萊寶公司,人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)購自美國模式培養(yǎng)物保存中心(ATCC),RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司,anti-miR-142-3p及陰性對照anti-miR-NC購自廣州銳博生物公司,Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司,細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自日本Dojindo公司,二喹啉甲酸酸(BCA)蛋白檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司,兔抗細胞核相關(guān)抗原(Ki-67)、兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自上海艾博抗公司,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

    1.2甘木通醇提物的制備 取甘木通藥材,粉碎成粉末,參照胡宗禮等〔4〕的報道,以1∶20的料液比加入70%乙醇,回流提取1 h,重復(fù)3次,收集3次提取的濾液,減壓濃縮成棕褐色浸膏,即為甘木通醇提物。甘木通醇提物利用培養(yǎng)基稀釋成10、50、100 ng/ml的濃度備用。

    1.3細胞培養(yǎng) HUVECs在RPMI1640培養(yǎng)基中,其中包含10% FBS、1%青鏈霉素,并于37 ℃、5% CO2、飽和濕潤的培養(yǎng)箱中生長。每周換液2~3次。

    1.4細胞分組與轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的HUVECs分為對照組(未處理HUVECs),模型組(100 mg/L ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs 24 h〔8〕),實驗1組(10 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h),實驗2組(50 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h),實驗3組(100 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h),anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 24 h后給予100 mg/L ox-LDL處理24 h),anti-miR-142-3p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-142-3p 24 h后給予100 mg/L ox-LDL處理24 h),實驗3組+anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 24 h后給予100 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL處理24 h),實驗3組+anti-miR-142-3p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-142-3p 24 h后給予100 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL處理24 h)。細胞轉(zhuǎn)染時,在6孔板中接種HUVECs,待細胞融合至70%左右時,嚴格依照Lipofectamine2000試劑的說明,將anti-miR-142-3p、anti-miR-NC轉(zhuǎn)染到HUVECs中,轉(zhuǎn)染24 h后,利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)評價轉(zhuǎn)染情況,并根據(jù)上述分組進行處理。

    1.5CCK-8法檢測HUVECs增殖 在96孔板中接種HUVECs,每孔5×104個細胞。經(jīng)不同的處理后,加入CCK-8溶液10 μl,于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中孵育,1 h后于酶標(biāo)儀在450 nm下測量光密度(OD)值,分析細胞存活率(%)。

    1.6流式細胞術(shù)評估HUVECs凋亡 按照細胞凋亡檢測試劑盒的規(guī)程,各組HUVECs處理結(jié)束后,加入結(jié)合緩沖液重懸,收集1×105個細胞,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻,5 μl PI工作液,混勻后遮光反應(yīng)15 min,通過流式細胞儀分析細胞凋亡。

    1.7Western印跡分析Ki-67、Caspase3蛋白表達 HUVECs加入放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液抽提蛋白,經(jīng)BCA蛋白檢測試劑盒定量,蛋白樣品加入5×上樣緩沖液(4∶1)并在沸水中變性。將30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。將膜用5%脫脂奶粉室溫封閉,1 h后與抗Ki-67(1∶1 000稀釋)、抗Caspase3(1∶1 000稀釋)和參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,1∶2 000稀釋)抗體4 ℃孵育過夜。次日加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h,加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

    1.8qRT-PCR測定miR-142-3p表達 使用TRIzol試劑從各組HUVECs中提取總RNA,采用SYBR PrimeScript試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,通過SYBR Premix Ex Taq試劑盒在ABI 7300 real-time PCR 系統(tǒng)進行PCR。收集Ct值,由2-ΔΔCt方法分析miR-142-3p表達。引物序列為:miR-142-3p上游5′-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3′和下游5′-CGACGTGTAGTGTTTCCTA-3′,U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游5′-AACGCTTCA-CGAATTTGCGT-3′。

    1.9比色法檢測SOD、MDA、CAT水平 HUVECs處理結(jié)束后,收集細胞上清液,分別遵循SOD、MDA、CAT檢測試劑盒說明書的操作步驟,采用比色法檢測SOD、MDA、CAT水平。

    1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗單因素方差分析、SNK-q檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響 與對照組相比,模型組HUVECs存活率明顯降低,凋亡率顯著升高,Ki67蛋白表達量明顯減少,Caspase3蛋白表達量顯著增加(P<0.05);與模型組相比,實驗1組細胞的存活率、凋亡率、Ki67、Caspase3蛋白表達無顯著變化(P>0.05),而實驗2組、實驗3組HUVECs的存活率明顯增加,凋亡率顯著減少,Ki67蛋白表達水平明顯升高,Caspase3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),且甘木通醇提物濃度越高,作用效果越顯著。見圖1、表1、圖2。

    2.2甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中SOD、MDA、CAT及miR-142-3p表達的影響 與對照組相比,模型組HUVECs內(nèi)miR-142-3p表達量明顯增加,SOD、CAT活性顯著降低,MDA含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,實驗1組HUVECs的miR-142-3p、SOD、MDA、CAT水平無明顯變化(P>0.05),但實驗2組、實驗3組HUVECs內(nèi)miR-142-3p表達量顯著減少,SOD、CAT活性明顯升高,MDA含量顯著降低(P<0.05),且甘木通醇提物濃度越高,作用效果越顯著。見表1。

    圖1 甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡

    表1 甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響及HUVECs中SOD、MDA、CAT及miR-142-3p表達

    1~5:對照組、模型組、實驗1組、實驗2組、實驗3組圖2 各組Ki67、Caspase3蛋白表達

    2.3干擾miR-142-3p的表達 anti-miR-142-3p組miR-142-3p的表達量顯著低于anti-miR-NC組(0.27±0.01 vs 1.00±0.04;t=53.115;P=0.000)。

    2.4干擾miR-142-3p對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷及SOD、MDA、CAT水平的影響 與anti-miR-NC組相比,anti-miR-142-3p組細胞的存活率明顯增加,凋亡率顯著減少,Ki67蛋白表達量明顯升高,Caspase3蛋白表達量顯著降低,并且SOD和CAT活性明顯升高,MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表2、圖3。

    表2 干擾miR-142-3p對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷及SOD、MDA、CAT水平的影響

    圖3 干擾miR-142-3p對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡及 Ki67、Caspase3蛋白表達的影響

    2.5干擾miR-142-3p可增強甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的影響 與實驗3組+anti-miR-NC組相比,實驗3組+anti-miR-142-3p組明顯增加ox-LDL損傷的HUVECs的存活率,顯著減少細胞的凋亡率,明顯提高Ki67蛋白表達水平,顯著降低Caspase3蛋白表達水平(P<0.05)。見圖4、表3。

    2.6干擾miR-142-3p可增強甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中SOD、MDA、CAT的水平 與實驗3組+anti-miR-NC組相比,實驗3組+anti-miR-142-3p組明顯提高ox-LDL損傷的HUVECs中SOD和CAT活性,而顯著降低MDA含量(P<0.05)。見表3。

    表3 干擾miR-142-3p可增強甘木通醇提物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的作用及HUVECs中SOD、MDA、CAT的水平

    3 討 論

    對于動脈粥樣硬化引起的周圍血管動脈閉塞及由于內(nèi)壁損傷導(dǎo)致的動脈瘤臨床上常采用手術(shù)的治療方法,但動脈粥樣硬化是一種全身性炎癥性疾病〔9〕。通常認為,內(nèi)皮細胞損傷和凋亡是動脈粥樣硬化發(fā)病機理的基礎(chǔ)和初始步驟〔10〕。ox-LDL通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷和凋亡而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展,ox-LDL被認為是動脈粥樣硬化的重要診斷生物標(biāo)志物〔11〕。因此,抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷可能是抗動脈粥樣硬化的一種新型有效治療方法,從而在治療動脈硬化性周圍血管疾病方面可以起到從源頭治療的目的。

    ox-LDL已被廣泛用于建立動脈粥樣硬化的體外模型,可通過多種機制參與動脈粥樣硬化的過程。如ox-LDL預(yù)處理可能誘導(dǎo)人臍帶血內(nèi)皮細胞(HUCBECs)細胞活力下降,細胞凋亡增加〔12,13〕。Caspase3蛋白是細胞凋亡的一種效應(yīng)蛋白,在兩個主要的程序性細胞死亡相關(guān)途徑(即死亡受體和細胞應(yīng)激途徑)匯合的步驟中發(fā)揮作用,ox-LDL誘導(dǎo)的Caspase3表達上調(diào)提示凋亡的發(fā)生〔14〕。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的重要因果機制。研究表明,氧化應(yīng)激是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵特征,這是由于抗氧化能力與包括活性氧在內(nèi)的物質(zhì)之間的不平衡而產(chǎn)生的〔15〕。與前述報道相符,這項研究同樣發(fā)現(xiàn),100 mg/L ox-LDL處理可以降低細胞增殖、抗氧化酶SOD、CAT活性和Ki67蛋白的表達,還可顯著增加凋亡細胞的數(shù)量、Caspase3蛋白表達和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量。

    甘木通作為我國傳統(tǒng)中藥,具有降血壓、增加冠脈流量、耐缺氧等藥理活性。有學(xué)者〔16〕指出,甘木通總黃酮能夠減輕缺血再灌注導(dǎo)致的氧化應(yīng)激,通過增強SOD活性和抑制MDA的生成,產(chǎn)生抗脂質(zhì)過氧化活性〔17〕。甘木通總黃酮還可促進表柔比星所致的細胞增殖,抑制細胞凋亡和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)〔18〕。本研究證明,50、100 ng/ml濃度的甘木通醇提物可以保護ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷,一方面促進ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs增殖、Ki67蛋白表達,抑制細胞凋亡和Caspase3蛋白表達,另一方面可以減少ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,提通過減少MDA含量,并上調(diào)SOD和CAT活性來改善細胞的抗氧化防御系統(tǒng),這與前人報道〔4〕的甘木通醇提物抗動脈粥樣硬化的效果相符。

    miRNA是內(nèi)源性非編碼RNA,調(diào)節(jié)基因的表達,并在各種病理和生理過程扮演重要角色,包括增殖,分化,侵襲和凋亡〔19〕。證據(jù)表明,某些miRNA可以通過靶向基因或關(guān)鍵途徑而成為動脈粥樣硬化的必要調(diào)節(jié)因子〔20〕。根據(jù)報道,miR-142-3p在腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用,它可以在不同類型的癌癥中充當(dāng)癌基因或抑癌基因〔21,22〕。miR-142-3p對脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡具有抑制作用〔23〕,在高血壓狀態(tài)下,miR-142-3p可以促進內(nèi)皮細胞的增殖并抑制其凋亡〔24〕。本研究結(jié)果說明,甘木通醇提物通過下調(diào)miR-142-3p的表達在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷中起保護作用。

    綜上所述,甘木通醇提物可以保護ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷,促進細胞增殖,抑制細胞凋亡并改善氧化應(yīng)激,這種保護作用與調(diào)控miR-142-3p表達有關(guān),為甘木通醇提物預(yù)防動脈粥樣硬化及治療動脈硬化性周圍血管疾病提供了新方向。

    猜你喜歡
    木通提物氧化應(yīng)激
    嶺南山竹子醇提物對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的作用
    基于炎癥-氧化應(yīng)激角度探討中藥對新型冠狀病毒肺炎的干預(yù)作用
    木通的新生
    飛龍掌血醇提物的抗炎鎮(zhèn)痛作用
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:19:44
    葫蘆鉆水提物的抗炎鎮(zhèn)痛作用及其急性毒性
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變
    氧化應(yīng)激與結(jié)直腸癌的關(guān)系
    白木通醇提取物體外抗腫瘤活性研究
    白木通籽油的精煉工藝優(yōu)化及脂肪酸組成分析
    槲皮素及其代謝物抑制氧化應(yīng)激與炎癥
    18禁动态无遮挡网站| 国产片内射在线| 色网站视频免费| 一个人免费看片子| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久精品人人爽人人爽视色| 飞空精品影院首页| 又黄又粗又硬又大视频| 大片电影免费在线观看免费| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 午夜精品国产一区二区电影| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩制服骚丝袜av| 色网站视频免费| av视频免费观看在线观看| 婷婷色av中文字幕| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲成色77777| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日韩成人av中文字幕在线观看| 大香蕉久久成人网| 日韩在线高清观看一区二区三区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲国产最新在线播放| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲精品一区蜜桃| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 波多野结衣一区麻豆| videosex国产| 亚洲视频免费观看视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 午夜老司机福利剧场| 亚洲欧洲日产国产| 制服诱惑二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 考比视频在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 9色porny在线观看| 一区二区av电影网| 国产成人精品久久二区二区91 | 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品美女久久av网站| 老女人水多毛片| 欧美日韩精品网址| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 成人免费观看视频高清| 成人午夜精彩视频在线观看| 免费看av在线观看网站| 亚洲,一卡二卡三卡| 观看av在线不卡| 亚洲成色77777| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成人国产av品久久久| 999久久久国产精品视频| videossex国产| 久久久精品94久久精品| 2022亚洲国产成人精品| 在线天堂最新版资源| 国产午夜精品一二区理论片| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品三级大全| 成人手机av| 看十八女毛片水多多多| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国精品久久久久久国模美| 国产97色在线日韩免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品一区二区在线观看99| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 免费在线观看完整版高清| 精品人妻一区二区三区麻豆| 97在线视频观看| 色吧在线观看| 日本午夜av视频| 人成视频在线观看免费观看| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 啦啦啦啦在线视频资源| 成年人午夜在线观看视频| av国产精品久久久久影院| 多毛熟女@视频| 成人国产av品久久久| 午夜老司机福利剧场| 久久午夜综合久久蜜桃| 中国三级夫妇交换| 欧美日韩一级在线毛片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 性高湖久久久久久久久免费观看| 考比视频在线观看| 日本欧美视频一区| 久久精品国产亚洲av天美| 在线观看www视频免费| 久久久久精品性色| 热re99久久国产66热| 精品一区在线观看国产| 少妇人妻久久综合中文| 香蕉国产在线看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲三级黄色毛片| 九九爱精品视频在线观看| 欧美日韩av久久| 春色校园在线视频观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲av在线观看美女高潮| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一本大道久久a久久精品| av卡一久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品人妻久久久影院| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲男人天堂网一区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲少妇的诱惑av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 婷婷成人精品国产| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产综合精华液| 免费av中文字幕在线| 中国三级夫妇交换| 最新中文字幕久久久久| 国产极品天堂在线| 男女免费视频国产| 久久久久久久久久人人人人人人| 99re6热这里在线精品视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 午夜影院在线不卡| 热99国产精品久久久久久7| 99九九在线精品视频| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品一区二区免费观看| 成人国产麻豆网| 国产 一区精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 欧美精品国产亚洲| 99久国产av精品国产电影| 国产精品国产三级国产专区5o| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 9191精品国产免费久久| 亚洲情色 制服丝袜| 中文字幕最新亚洲高清| 男女边吃奶边做爰视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品久久久久成人av| 黄色毛片三级朝国网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 多毛熟女@视频| 国产片内射在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费av中文字幕在线| 国产片内射在线| av天堂久久9| av天堂久久9| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 日本午夜av视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 精品国产露脸久久av麻豆| 色网站视频免费| 国产成人精品无人区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 99国产综合亚洲精品| 国产成人精品在线电影| 大香蕉久久网| 美女高潮到喷水免费观看| 国产男女超爽视频在线观看| 老司机影院毛片| 黄色一级大片看看| 亚洲久久久国产精品| 1024香蕉在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 精品人妻在线不人妻| 国产精品欧美亚洲77777| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久99蜜桃精品久久| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久免费观看电影| 亚洲精品自拍成人| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜福利网站1000一区二区三区| 电影成人av| 1024视频免费在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 日韩制服骚丝袜av| 国产男人的电影天堂91| 男女高潮啪啪啪动态图| 中国国产av一级| 最近中文字幕高清免费大全6| 午夜福利视频精品| 亚洲精品日本国产第一区| 黄色视频在线播放观看不卡| 三级国产精品片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 高清在线视频一区二区三区| 一个人免费看片子| 午夜免费男女啪啪视频观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲第一青青草原| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲在久久综合| 波野结衣二区三区在线| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品 国内视频| 国产精品成人在线| 成人国产麻豆网| 免费观看av网站的网址| 看免费成人av毛片| 国产av码专区亚洲av| 18在线观看网站| 最新中文字幕久久久久| 精品久久蜜臀av无| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 一边摸一边做爽爽视频免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品一品国产午夜福利视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 午夜福利在线免费观看网站| av网站免费在线观看视频| 日韩伦理黄色片| 亚洲内射少妇av| 亚洲色图综合在线观看| 99久国产av精品国产电影| 久久久精品区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲精品一二三| 欧美激情高清一区二区三区 | 国产精品.久久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品久久蜜臀av无| 一二三四中文在线观看免费高清| 日韩欧美精品免费久久| 一级黄片播放器| 老汉色∧v一级毛片| 国产又爽黄色视频| 国产毛片在线视频| 国产av码专区亚洲av| av在线观看视频网站免费| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产乱人偷精品视频| 日韩一区二区视频免费看| 精品酒店卫生间| 亚洲一区二区三区欧美精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品国产av成人精品| 三级国产精品片| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日韩精品有码人妻一区| 男女国产视频网站| 亚洲国产最新在线播放| 成人二区视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 五月开心婷婷网| 国产极品天堂在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| av国产久精品久网站免费入址| 欧美日韩精品网址| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲在久久综合| 人成视频在线观看免费观看| 最黄视频免费看| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩欧美精品免费久久| 999精品在线视频| 一区福利在线观看| www.av在线官网国产| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲av成人精品一二三区| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲国产精品国产精品| 99国产精品免费福利视频| 国产成人精品无人区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一级毛片电影观看| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲 欧美一区二区三区| 一级黄片播放器| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 十八禁网站网址无遮挡| 丝袜人妻中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 好男人视频免费观看在线| 免费看av在线观看网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 青春草国产在线视频| 国产xxxxx性猛交| 丝袜美腿诱惑在线| 国产麻豆69| 国精品久久久久久国模美| 另类精品久久| 亚洲国产精品999| 一级,二级,三级黄色视频| 精品午夜福利在线看| 最近手机中文字幕大全| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产精品久久久久成人av| 久久久久久人妻| 九草在线视频观看| 欧美精品一区二区免费开放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久人人爽人人片av| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 高清黄色对白视频在线免费看| 各种免费的搞黄视频| 欧美成人午夜精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 捣出白浆h1v1| 26uuu在线亚洲综合色| 高清不卡的av网站| 另类精品久久| 亚洲久久久国产精品| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品一区在线观看国产| 日韩 亚洲 欧美在线| 男女无遮挡免费网站观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩中文字幕视频在线看片| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 波多野结衣av一区二区av| 国产精品av久久久久免费| 成人国产av品久久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 成人免费观看视频高清| 成人国产麻豆网| 99九九在线精品视频| 国产乱人偷精品视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产97色在线日韩免费| 午夜日韩欧美国产| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 中文字幕人妻丝袜制服| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 国产在线一区二区三区精| 国产伦理片在线播放av一区| 精品一品国产午夜福利视频| 天天操日日干夜夜撸| 九色亚洲精品在线播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产成人精品在线电影| 最近中文字幕2019免费版| 日本午夜av视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产又色又爽无遮挡免| 美女大奶头黄色视频| 日韩精品有码人妻一区| 精品国产国语对白av| 国产精品一二三区在线看| 国产乱人偷精品视频| 黄频高清免费视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美精品亚洲一区二区| 精品一品国产午夜福利视频| 国产在线免费精品| 女性生殖器流出的白浆| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久久精品性色| 亚洲一码二码三码区别大吗| 男男h啪啪无遮挡| 青草久久国产| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲人成77777在线视频| 看非洲黑人一级黄片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 激情视频va一区二区三区| av在线老鸭窝| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 婷婷色综合大香蕉| 一区二区三区四区激情视频| 97人妻天天添夜夜摸| 久久久久久久大尺度免费视频| 美女高潮到喷水免费观看| 视频在线观看一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 美国免费a级毛片| 97在线人人人人妻| kizo精华| 午夜福利网站1000一区二区三区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久综合国产亚洲精品| 久久久精品区二区三区| 欧美av亚洲av综合av国产av | 国产精品亚洲av一区麻豆 | 亚洲精品自拍成人| 欧美日韩一级在线毛片| 一级毛片我不卡| 少妇精品久久久久久久| 成人免费观看视频高清| 色吧在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩视频在线欧美| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 永久网站在线| 久久ye,这里只有精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品一二三| 国产免费福利视频在线观看| 一区二区av电影网| 春色校园在线视频观看| av在线app专区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 天天影视国产精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 激情五月婷婷亚洲| 中文字幕制服av| 久热这里只有精品99| 国产精品偷伦视频观看了| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 最近手机中文字幕大全| 欧美日韩精品网址| 成人二区视频| 青春草视频在线免费观看| 国产精品.久久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品国产国语对白av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品国产露脸久久av麻豆| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 丝袜美足系列| 日韩欧美精品免费久久| 午夜福利乱码中文字幕| 午夜福利网站1000一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品99久久99久久久不卡 | 大片免费播放器 马上看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产午夜精品一二区理论片| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久 成人 亚洲| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美激情极品国产一区二区三区| 电影成人av| 国产免费视频播放在线视频| 午夜精品国产一区二区电影| 男女免费视频国产| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久久久久人人人人人| 国产一区二区三区综合在线观看| 大码成人一级视频| 人妻少妇偷人精品九色| 久久精品人人爽人人爽视色| 99热国产这里只有精品6| 欧美精品亚洲一区二区| 18禁国产床啪视频网站| 国产成人免费观看mmmm| 色婷婷久久久亚洲欧美| 十八禁网站网址无遮挡| 最新中文字幕久久久久| a级毛片黄视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日本av免费视频播放| 人人澡人人妻人| 欧美97在线视频| 亚洲av日韩在线播放| 激情五月婷婷亚洲| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美日韩成人在线一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲第一青青草原| 黑人猛操日本美女一级片| 一区二区三区激情视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 在线观看三级黄色| 亚洲av免费高清在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 久久久精品94久久精品| 欧美日韩精品网址| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜福利视频精品| 久久毛片免费看一区二区三区| 婷婷色麻豆天堂久久| av天堂久久9| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 男的添女的下面高潮视频| 9191精品国产免费久久| 国产精品二区激情视频| 极品人妻少妇av视频| 妹子高潮喷水视频| 国产欧美亚洲国产| www.熟女人妻精品国产| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 波野结衣二区三区在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 哪个播放器可以免费观看大片| 两个人看的免费小视频| av视频免费观看在线观看| av福利片在线| 性色av一级| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品第一国产精品| 男女午夜视频在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 最近手机中文字幕大全| 亚洲av电影在线进入| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 午夜福利视频精品| 十八禁网站网址无遮挡| 在线观看国产h片| 91成人精品电影| 精品国产一区二区久久| 国产在视频线精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产成人精品婷婷| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 人妻人人澡人人爽人人| 男女无遮挡免费网站观看| 黄片无遮挡物在线观看| 人妻系列 视频| 国产成人精品在线电影| 久久久久久久精品精品| 自线自在国产av| 26uuu在线亚洲综合色| 国产成人aa在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看 | 亚洲av福利一区| 日韩视频在线欧美| 日韩av免费高清视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 午夜激情久久久久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一区在线观看完整版| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 免费观看av网站的网址| 日本欧美国产在线视频| 国产成人精品久久二区二区91 | 国产精品.久久久| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲精品一二三| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久精品国产亚洲av天美| 最黄视频免费看| 国产成人aa在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 成人国产av品久久久| 另类精品久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 人妻人人澡人人爽人人| 国产毛片在线视频| 制服人妻中文乱码| 美女午夜性视频免费| 欧美另类一区| 国产精品久久久久久久久免| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品久久久久成人av| 美女高潮到喷水免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 一个人免费看片子| 午夜激情久久久久久久| 精品一品国产午夜福利视频|