基于調(diào)控NF-κB信號通路探討白藜蘆醇影響DCs成熟對恢復(fù)COPD小鼠Th17/Treg平衡的作用及機(jī)制

唐斌 李秋根 李凡 尹祖安 陳婷 凌友亮 黃丹

(江西省人民醫(yī)院(南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院) 1呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,江西 南昌 330006;2急診科;3南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,T淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DCs)等都參與了COPD的發(fā)病過程。其中輔助T細(xì)胞(Th)17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一種相關(guān)聯(lián)的淋巴細(xì)胞亞群,二者均來源于CD4+T細(xì)胞,但功能上是相互拮抗的。Th17/Treg失衡是COPD發(fā)展的關(guān)鍵點之一,Th17/Treg比值失衡向Th17方向偏移,促進(jìn)COPD進(jìn)展〔1,2〕。DCs成熟與Th17/Treg平衡有關(guān),成熟DCs(mDCs)可以造成CD4+T細(xì)胞向Th17分化,而未成熟的DCs(iDCs)則可誘導(dǎo)Treg分化。在COPD中,iDCs水平下調(diào),mDCs水平上升。iDCs介導(dǎo)免疫耐受,導(dǎo)致Treg升高,Th17降低〔3〕。研究揭示白藜蘆醇通過抑制核因子(NF)-κB活性,減少NF-κB亞基RelA/P65表達(dá)或減少P65核移位而發(fā)揮抗炎作用〔4〕。然而,尚不清楚白藜蘆醇在調(diào)控NF-κB信號通路而影響DCs功能狀態(tài)中的作用及其與COPD中Th17/Treg平衡的可能關(guān)系,本研究旨在探討白藜蘆醇影響DCs成熟對恢復(fù)COPD小鼠Th17/Treg平衡的作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及其分組 36只SPF C57BL/6雌性野生型小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量20～25 g,從南昌大學(xué)實驗動物科學(xué)中心采購。飼養(yǎng)溫度25～26 ℃,60%～70%相對濕度,投喂塊狀食物,小鼠飲水自由,墊料每周更換2次。采用隨機(jī)數(shù)字表法分成健康對照組、COPD組和白藜蘆醇干預(yù)組各12只。本研究取得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有動物飼養(yǎng)及實驗操作符合相關(guān)管理要求準(zhǔn)則及實驗動物倫理要求。

1.2動物模型制備 COPD小鼠模型制作方法:采用香煙煙霧刺激和氣道注射脂多糖(LPS)制備COPD模型,分別于第1、15天氣道內(nèi)注射LPS溶液(200 μg/200 μl);第2～28天(除第15天外)在造模箱(玻璃制成,25 cm×35 cm×80 cm,盒子頂部有一個直徑約2 cm的通氣孔,盒子中間有兩排從下往上的鐵網(wǎng),鐵網(wǎng)之間放置并點燃香煙中被動吸煙(2次/d,12支/次),同一天兩次被動吸煙的間隔時間為2 h,COPD 組注射LPS當(dāng)日呼吸新鮮空氣,不給予上述煙霧刺激處理。健康對照組:正常飼養(yǎng),不予上述處理。白藜蘆醇干預(yù)組:造模方法同COPD組,同時給予25 mg/kg白藜蘆醇灌胃。其余兩組與白藜蘆醇同等劑量生理鹽水灌胃。

1.3動物處理及外周血、支氣管肺泡灌洗液(BALF)、肺組織標(biāo)本收集及骨髓源性DCs的提取 (1)外周血:在實驗的第28天,小鼠清醒時采集內(nèi)眥靜脈叢1 ml血液,采集的外周血樣本立即放入肝素抗凝管中,待用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。(2)BALF及肺組織:各組小鼠末次激發(fā)24 h后,10%水合氯醛400 mg/kg ip麻醉,分離氣管,用0.3 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗右肺3次,收集BALF, 4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,將上清液置于-80 ℃冰箱中保存以備檢測,用1 ml PBS重懸細(xì)胞。取重懸液10 μl進(jìn)行涂片染色、炎癥細(xì)胞計數(shù)、分類。切取左肺門附近肺組織,厚度2～3 mm,滅菌后用0.9%氯化鈉注射液消毒清洗血漬,用10%甲醛固定。此外,取一些新鮮的肺組織,在液氮中速凍后,置于滅菌的PE管中,置于-80 ℃冰箱冷凍備用。(3)骨髓源性DCs:采用脫頸法對小鼠實施處死,分離并去除股骨、脛骨骨骺端。用PBS沖洗骨髓,用離心機(jī)1 000 r/min離心5 min,丟棄上清,將PBS再次混勻底部的細(xì)胞沉淀,以混勻的細(xì)胞液與淋巴細(xì)胞分離液一起以2 000 r/min離心20 min。提取骨髓基底細(xì)胞層,PBS洗滌3次,留取備用。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血、BALF中DCs成熟標(biāo)志物及Th17/Treg比值 采用直接標(biāo)記的流式抗體,采用雙色熒光標(biāo)記法測定外周血、BALF中DCs成熟標(biāo)志物〔人類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-Ⅱ、CD80、CD86水平〕及Th17/Treg比值,詳細(xì)步驟見試劑盒說明書。檢測是在相同的儀器參數(shù)下進(jìn)行的,激發(fā)波長488 nm,每個樣本收集20 000個細(xì)胞,Cell Quest Plot軟件分析數(shù)據(jù),包括外周血檢測單個核細(xì)胞中CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)量,有細(xì)胞中CD80、CD86、及MHC-Ⅱ表達(dá)量均以百分率(%)表示,比較DCs各因子測定管減去陰性對照管的百分率。用CD4+CD25+Foxp3+標(biāo)志物鑒定Treg細(xì)胞,用CD3+CD8-白細(xì)胞介素(IL)-17A+標(biāo)志物鑒定Th17細(xì)胞。用FSCAN流式細(xì)胞儀測定Th17/Treg比值,并用BD-FACS-Diva 軟件進(jìn)行分析。

1.5病理標(biāo)本的制備及染色 用10%甲醛固定的新鮮肺組織,進(jìn)行常規(guī)的脫水,透明,用蠟浸漬,制備蠟塊,染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測 DCs中 NF-κB 的表達(dá) 先用Trizol試劑提取3組 DCs的總RNA,(根據(jù)試劑盒說明書操作);然后應(yīng)用TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后對其進(jìn)行進(jìn)一步檢測。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理結(jié)構(gòu) 健康對照組支氣管壁光滑完整,肺組織、氣道及血管周圍未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤。COPD組氣道壁被炎性細(xì)胞浸潤,細(xì)支氣管顯示出纖毛倒伏、縮短、粘連,其上皮黏液杯狀細(xì)胞增生,明顯出現(xiàn)肺氣腫,可見形成的肺大泡。白藜蘆醇干預(yù)組與COPD組相比有所改善,炎癥細(xì)胞浸潤減少,肺氣腫和肺大泡也有所改善。見圖1。

2.2外周血、BALF中DCs成熟標(biāo)志物及Th17/Treg比值 3組外周血及BALF中CD80、CD86、TH17/Treg水平比較:COPD組>白藜蘆醇干預(yù)組>健康對照組(均P<0.05);3組外周血及BALF中MHC-Ⅱ水平比較:健康對照組>白藜蘆醇干預(yù)組>COPD組(均P<0.05)。見表1。

圖1 各組氣道炎癥的病理改變(HE染色,×20)

表1 各組外周血和BALF中CD80、CD86、MHC-Ⅱ水平及Th17/Treg比較

3 討 論

COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,自身免疫機(jī)制也在一定程度上參與了COPD的發(fā)生發(fā)展,T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫在COPD發(fā)病中發(fā)揮重要作用,特別是Th17和Treg及其比值〔5,6〕。DCs是體內(nèi)最重要的抗原遞呈細(xì)胞(APCs),DCs在誘導(dǎo)Th17/Treg細(xì)胞軸的免疫平衡中起關(guān)鍵作用,從而在COPD的炎癥過程中起關(guān)鍵作用。不同的刺激可以誘導(dǎo)不同的DCs成熟狀態(tài),從而刺激T細(xì)胞不同的功能狀態(tài),有研究報道,髓iDCs表面缺乏CD40、B7等黏附輔助分子,導(dǎo)致T細(xì)胞失活和低反應(yīng),并可誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生,呈現(xiàn)顯著的免疫耐受〔7〕。NF-κB是決定DCs功能狀態(tài)的關(guān)鍵因素〔8〕。相關(guān)研究表明,NF-κB參與細(xì)胞增殖和分化、衰老、死亡、黏附和遷移〔9〕。Yu等〔10〕報道細(xì)胞外腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)激活P2x7R-NF-κB通路促進(jìn)小鼠髓源性DCs成熟。韓旭〔11〕研究表明,阻斷 LPS-TLR4/NF-κB 信號傳導(dǎo)通路,可抑制DCs成熟,繼而增加其耐受性。白藜蘆醇是一種多酚類植物抗毒素,它廣泛分布在自然界,具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗炎、自由基清除、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等功能〔12〕。對COPD、支氣管哮喘、肺纖維化、肺動脈高壓等有抗炎、抗氧化作用〔13〕。白藜蘆醇可負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB、轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1等信號通路,它可減輕COPD炎癥細(xì)胞的激活和炎癥因子如IL-8和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的釋放〔14〕。本研究結(jié)果提示,白藜蘆醇可抑制NF-κB信號通路而阻斷DCs成熟,從而恢復(fù)COPD小鼠Th17/Treg的平衡,繼而延緩COPD小鼠氣道炎癥的進(jìn)展。有文獻(xiàn)報道,白藜蘆醇可以通過負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)來調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性〔15〕。Mohammadpou等〔16〕研究表明,呼吸道合胞病毒(RSV)可能通過RelA和c-Jun基因調(diào)控降低NF-κB和轉(zhuǎn)錄激活因子(AP)-1活性。Buttari等〔17〕報道,白藜蘆醇體外預(yù)處理人單核細(xì)胞衍生的DCs可防止DCs成熟,其通過免疫化學(xué)和細(xì)胞熒光分析發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對DCs表面成熟標(biāo)志物上調(diào)有抑制作用,還抑制DCs中的促炎細(xì)胞因子表達(dá)、同種異體刺激能力上調(diào)、絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB活化。本研究說明,白藜蘆醇能夠通過抑制NF-κB信號通路而阻斷DCs成熟從而恢復(fù)COPD小鼠Th17/Treg的平衡,在延緩COPD小鼠氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。