• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    羅漢果皂苷提取物通過(guò)調(diào)控miR-199a-3p對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響

    2023-11-27 11:57:10鄒方鵬孟昭慧黃雯靜吳俊榮
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2023年22期
    關(guān)鍵詞:羅漢果高糖腎小管

    鄒方鵬 孟昭慧 黃雯靜 吳俊榮

    (1濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎病風(fēng)濕科,山東 濟(jì)南 271100;2濟(jì)南市萊蕪醫(yī)院藥劑科)

    糖尿病腎病是由腎小球硬化引起的糖尿病微血管病變的常見(jiàn)并發(fā)癥,通常導(dǎo)致終末期腎病,這是糖尿病患者的常見(jiàn)死亡原因〔1,2〕。眾所周知,腎小管細(xì)胞損傷是糖尿病腎病的主要特征之一,且證據(jù)表明在腎小管細(xì)胞損傷過(guò)程中涉及炎癥和細(xì)胞凋亡〔3〕。異常炎癥會(huì)直接破壞腎臟結(jié)構(gòu),并增加炎癥細(xì)胞因子的水平,如白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α等〔4〕。因此,迫切需要抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥的治療策略。羅漢果皂苷是羅漢果的主要活性成分,羅漢果是我國(guó)首批批準(zhǔn)的藥食兩用的材料,其具有多種藥理學(xué)功能,如潤(rùn)肺止咳、降血糖、抗炎等〔5〕。近期研究顯示,羅漢果皂苷提取物能夠有效降血糖,在抗糖尿病中起一定的作用〔6〕。但是,尚不清楚羅漢果皂苷提取物是否對(duì)糖尿病腎病中腎臟具有保護(hù)作用。本研究建立了高葡萄糖引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷模型,探討羅漢果皂苷提取物在預(yù)防高糖引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1材料 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(中國(guó)細(xì)胞資源庫(kù));羅漢果皂苷提取物,總皂苷含量≥80%(桂林萊茵生物科技);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS,美國(guó)Gibco);miR-199a-3p inhibitors和inhibitors control、miR-199a-3p mimics和mimics control(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogeng);CCK-8檢測(cè)試劑(日本同仁化學(xué)研究所);RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾);TNF-α、IL-6和IL-8酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技);膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(日本TaKaRa);B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體(美國(guó)Abcam);辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物);RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL,美國(guó)Sigma)。

    1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,并在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞呈單層融合時(shí),使用胰蛋白酶消化并傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期的HK-2細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為:正常對(duì)照(NG)組:DMEM培養(yǎng)基+5 mmol/L葡萄糖;高糖干預(yù)(HG)組:DMEM培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖;低、中、高劑量組:DMEM培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10、20、40 μg/ml羅漢果皂苷提取物。

    1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對(duì)數(shù)期的HK-2細(xì)胞種植于6孔板中,待細(xì)胞達(dá)60%融合時(shí)行轉(zhuǎn)染,按照說(shuō)明書采用無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋LipofectamineTM2000脂質(zhì)體和miR-199a-3p inhibitors和inhibitors control、miR-199a-3p mimics、mimics control,將稀釋的脂質(zhì)體和質(zhì)粒等體積混合,孵育20 min后滴加至6孔板HK-2細(xì)胞中,孵育6 h更換成完全培養(yǎng)液,48 h后收集細(xì)胞。HK-2細(xì)胞按上述方法轉(zhuǎn)染mimics control和miR-199a-3p mimics后用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),記為HG+miR-NC組和HG+miR-199a-3p組;HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitors control和miR-199a-3p inhibitors后用含30 mmol/L葡萄糖和20 μg/ml羅漢果皂苷提取物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),記為anti-miR-NC+中劑量組和anti-miR-199a-3p+中劑量組。

    1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)技術(shù) 使用RNA提取試劑盒從HK-2細(xì)胞中提取總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA。使用SYBR Green試劑盒在CFX96 Manager系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR。通過(guò)2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá),并以U6將其標(biāo)準(zhǔn)化。引物:miR-199a-3p上游5′-GCCCAGTGTTCAGACTACCTG-3′,下游5′-GTGCAGGGT-CCGAGGTATTC-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

    1.5CCK-8檢測(cè) 將HK-2細(xì)胞(1×104細(xì)胞/孔)接種到96孔板中,培養(yǎng)24 h,然后將100 μl CCK-8添加到每個(gè)孔中,并在37 ℃下孵育2 h,最后使用酶標(biāo)儀在570 nm的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度(A)值。細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

    1.6ELISA檢測(cè) 分別收集各組處理后HK-2細(xì)胞上清液,按照TNF-α、IL-6和IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定含量,操作參照試劑盒使用說(shuō)明。

    1.7流式細(xì)胞術(shù) 收集經(jīng)處理的各組HK-2細(xì)胞,并使用AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色,在黑暗中孵育30 min后,使用FACScan流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞凋亡率。

    1.8Western印跡檢測(cè) 使用裂解緩沖液提取各組HK-2細(xì)胞中的蛋白質(zhì),BCA法測(cè)定濃度后在沸水中變性,取等量蛋白通過(guò)12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,并用5%的脫脂牛奶在TBST緩沖液中封閉1 h。將膜與抗Bax和Bcl-2的一抗(稀釋度1∶500)在4 ℃孵育過(guò)夜。然后,將膜與辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗(稀釋度1∶2 000)在37 ℃孵育2 h。最后,使用ECL試劑顯影,凝膠系統(tǒng)采集圖像,采用ImageJ軟件分析條帶灰度值,計(jì)算Bax和Bcl-2的相對(duì)表達(dá)水平。

    1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NG組比較,HG組HK-2細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05);與HG組相比,低、中、高劑量組細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05),中劑量組與高劑量組細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因而選用羅漢果皂苷提取物20 μg/ml進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。

    2.2羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NG組比較,HG組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05);與HG組相比,低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05);Western印跡檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NG組比較,HG組HK-2細(xì)胞中Bax的表達(dá)明顯上升(P<0.05),而Bcl-2的表達(dá)明顯下降(P<0.05);與HG組相比,低、中、高劑量組中Bax的表達(dá)明顯下降(P<0.05),而Bcl-2的表達(dá)明顯上升(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1、圖2。

    2.3羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8分泌的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NG組比較,HG組中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)明顯增多(P<0.05);與HG組相比,低、中、高劑量組TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 各組HK-2細(xì)胞活力、凋亡率、Bax、Bcl-2、miR-199a-3p及炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的含量表達(dá)比較

    圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HK-2細(xì)胞凋亡

    圖2 Western印跡檢測(cè)各組Bax和Bcl-2的表達(dá)

    2.4羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)的影響 qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NG組比較,HG組HK-2細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05);與HG組相比,低、中、高劑量組miR-199a-3p的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    2.5過(guò)表達(dá)miR-199a-3p抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,與HG+miR-NC組比較,HG+miR-199a-3p組HK-2細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05),凋亡率顯著降低(P<0.05),TNF-α、IL-6和IL-8的含量及Bax、Bcl-2表達(dá)顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3、圖4、表2。

    1~4:HG+miR-NC組、HG+miR-199a-3p組、anti-miR-NC+中劑量組、anti-miR-199a-3p+中劑量組圖3 miR-199a-3p對(duì)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

    圖4 miR-199a-3p對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響

    表2 過(guò)表達(dá)miR-199a-3p對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力、凋亡率、TNF-α、IL-6和IL-8的含量的影響

    2.6下調(diào)miR-199a-3p逆轉(zhuǎn)羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的作用 與anti-miR-NC+中劑量組比較,anti-miR-199a-3p+中劑量組HK-2細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05),凋亡率顯著升高(P<0.05),TNF-α、IL-6和IL-8的含量及Bax、Bcl-2表達(dá)顯著增多(P<0.05)。見(jiàn)圖3、圖4、表3。

    表3 抑制miR-199a-3p對(duì)羅漢果皂苷提取物干預(yù)的高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力、凋亡率、TNF-α、IL-6和IL-8的含量、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

    3 討 論

    葡萄糖水平升高是糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一。高血糖可能導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物的形成,從而導(dǎo)致腎臟炎癥并促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展〔7〕。腎近端腎小管上皮細(xì)胞是慢性高血糖不良反應(yīng)的重要靶標(biāo)。腎小球?yàn)V過(guò)液中的葡萄糖過(guò)多會(huì)促使近端小管中的葡萄糖重吸收增加,并激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的一系列適應(yīng)不良的途徑,從而促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生〔8〕。因此,高濃度的葡萄糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞通常用于建立糖尿病腎病的體外模型〔9,10〕。先前的研究表明,高葡萄糖干預(yù)可顯著降低HK-2細(xì)胞的細(xì)胞活力并誘發(fā)腎小管上皮損傷〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn),高葡萄糖(30 mmol/L)抑制了HK-2細(xì)胞的活力。有研究顯示,羅漢果皂苷提取物能夠有效改善高糖高脂誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷,進(jìn)而發(fā)揮抗糖尿病的作用〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,羅漢果皂苷提取物能夠有效提高高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的活性。糖尿病腎病的發(fā)展與多種因素有關(guān),但是腎小管上皮細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子和凋亡可能在該疾病中起關(guān)鍵作用〔13〕。高血糖會(huì)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子增加,這些炎性細(xì)胞因子可以直接損害腎小管上皮細(xì)胞〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,30 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞構(gòu)建糖尿病腎病的體外模型成功,羅漢果皂苷提取物能夠減少高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡,并減少炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌,提示羅漢果皂苷提取物能夠減輕高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。

    研究表明,微小RNA(miRNA)與腎小管細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)〔15~17〕。如miR-140-5p通過(guò)抑制Toll樣受體(TLR)4/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路改善高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)〔18〕。miR-125b通過(guò)阻止活性氧(ROS)的形成和凋亡改善了高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷〔19〕。以往研究使用微陣列測(cè)定法分析了糖尿病腎病患者外周血中的miRNA表達(dá)譜,提示miR-199a-3p可能參與糖尿病腎病的發(fā)展,此外該研究顯示高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)顯著下調(diào)〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往研究一致,高糖刺激的HK-2細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)受到抑制。此外,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示,羅漢果皂苷提取物可能通過(guò)調(diào)控miR-199a-3p的表達(dá)參與糖尿病腎病的進(jìn)展,過(guò)表達(dá)miR-199a-3p可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷,抑制miR-199a-3p可逆轉(zhuǎn)羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷保護(hù)作用。

    綜上,羅漢果皂苷提取物能上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。

    猜你喜歡
    羅漢果高糖腎小管
    吃羅漢果能升糖還是降糖
    家庭百事通(2023年1期)2023-05-30 10:48:04
    HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定羅漢果不同部位中4種皂苷
    中成藥(2018年11期)2018-11-24 02:57:10
    葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:04
    丹紅注射液對(duì)高糖引起腹膜間皮細(xì)胞損傷的作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:21
    依帕司他對(duì)早期糖尿病腎病腎小管功能的影響初探
    IgA腎病患者血清胱抑素C對(duì)早期腎小管間質(zhì)損害的預(yù)測(cè)作用
    細(xì)胞因子在慢性腎缺血與腎小管-間質(zhì)纖維化過(guò)程中的作用
    張掖市甜菜高產(chǎn)高糖栽培技術(shù)
    羅漢果產(chǎn)區(qū)巖石-土-羅漢果微量元素分布與遷聚特征研究
    活性維生素D3對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用
    国产黄色免费在线视频| 七月丁香在线播放| av天堂久久9| 久久青草综合色| 两个人看的免费小视频| 国产成人91sexporn| 一区在线观看完整版| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 两性夫妻黄色片| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 成人漫画全彩无遮挡| 婷婷色综合www| av在线播放精品| 观看美女的网站| 欧美精品av麻豆av| 日本爱情动作片www.在线观看| 一级黄片播放器| 一个人免费看片子| 天堂中文最新版在线下载| 99久国产av精品国产电影| 在线观看免费高清a一片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 天天操日日干夜夜撸| 搡女人真爽免费视频火全软件| 大片电影免费在线观看免费| 性少妇av在线| 免费在线观看黄色视频的| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲熟女精品中文字幕| 中文字幕最新亚洲高清| 免费黄色在线免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| av片东京热男人的天堂| 日韩av免费高清视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 成人国语在线视频| 成人漫画全彩无遮挡| 麻豆乱淫一区二区| 国产av一区二区精品久久| 电影成人av| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产又爽黄色视频| 美女中出高潮动态图| 精品一品国产午夜福利视频| 精品福利永久在线观看| av福利片在线| 男男h啪啪无遮挡| 啦啦啦啦在线视频资源| 在线观看www视频免费| 天堂俺去俺来也www色官网| 下体分泌物呈黄色| 黄色视频在线播放观看不卡| 波多野结衣av一区二区av| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲国产av影院在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲av综合色区一区| 另类亚洲欧美激情| 欧美+日韩+精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲视频免费观看视频| 精品人妻偷拍中文字幕| √禁漫天堂资源中文www| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲久久久国产精品| 青草久久国产| √禁漫天堂资源中文www| 在线观看国产h片| 日日撸夜夜添| 成人国语在线视频| 国产视频首页在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产成人精品在线电影| 日日撸夜夜添| 久久久久精品性色| 99re6热这里在线精品视频| 国产黄色免费在线视频| 少妇人妻久久综合中文| 国产麻豆69| 亚洲美女视频黄频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜激情av网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 青草久久国产| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产色婷婷99| 视频在线观看一区二区三区| 中国三级夫妇交换| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 男女高潮啪啪啪动态图| 一本久久精品| 久热这里只有精品99| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 激情五月婷婷亚洲| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 在线天堂最新版资源| 中文字幕色久视频| 午夜91福利影院| 亚洲精品日本国产第一区| 一本大道久久a久久精品| 亚洲精品成人av观看孕妇| 考比视频在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 精品久久久精品久久久| 蜜桃在线观看..| 丝袜人妻中文字幕| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久久精品区二区三区| 国产xxxxx性猛交| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美最新免费一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产有黄有色有爽视频| 国产成人精品婷婷| 99热全是精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲av男天堂| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产欧美亚洲国产| 国产极品天堂在线| 国产精品一国产av| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产亚洲最大av| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲中文av在线| 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产成人91sexporn| 一区二区三区乱码不卡18| 国产精品久久久久久久久免| 色视频在线一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲天堂av无毛| xxxhd国产人妻xxx| 国产日韩欧美视频二区| 午夜福利乱码中文字幕| 成年美女黄网站色视频大全免费| 亚洲av男天堂| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 丁香六月天网| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 久热久热在线精品观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一二三四在线观看免费中文在| 美女中出高潮动态图| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久久久久久久久久免费av| 国产黄频视频在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 久久久久久人妻| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 在线观看美女被高潮喷水网站| 18禁观看日本| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久97久久精品| 国产精品久久久久久久久免| 午夜影院在线不卡| 九草在线视频观看| 交换朋友夫妻互换小说| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲成人一二三区av| 欧美97在线视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 一区二区三区精品91| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费少妇av软件| 久久99精品国语久久久| 精品国产国语对白av| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲中文av在线| 中文欧美无线码| 一区二区av电影网| 制服人妻中文乱码| 亚洲国产色片| 美女高潮到喷水免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 哪个播放器可以免费观看大片| 久久久国产欧美日韩av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 在线精品无人区一区二区三| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人aa在线观看| 久久这里有精品视频免费| 2022亚洲国产成人精品| 啦啦啦在线免费观看视频4| 男人舔女人的私密视频| 91精品三级在线观看| 日本色播在线视频| 91精品国产国语对白视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲精品乱久久久久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 一区二区三区激情视频| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩av不卡免费在线播放| 观看美女的网站| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产在线一区二区三区精| 女人久久www免费人成看片| 亚洲欧洲日产国产| 十八禁高潮呻吟视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 高清不卡的av网站| 亚洲人成网站在线观看播放| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品久久久久久精品古装| 国产成人精品久久久久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩电影二区| 亚洲伊人久久精品综合| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产精品av久久久久免费| 国产高清国产精品国产三级| 99久久人妻综合| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 1024香蕉在线观看| www.精华液| 自线自在国产av| 最新的欧美精品一区二区| 婷婷色综合www| 久久久久精品人妻al黑| 中国国产av一级| 欧美av亚洲av综合av国产av | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 性色av一级| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 精品少妇久久久久久888优播| 精品一区二区三卡| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 一区二区三区四区激情视频| kizo精华| 免费av中文字幕在线| 精品亚洲成a人片在线观看| 一区二区三区精品91| 免费日韩欧美在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 男女国产视频网站| av在线老鸭窝| 日本wwww免费看| 一级黄片播放器| 制服丝袜香蕉在线| videossex国产| 国产精品不卡视频一区二区| 男女边吃奶边做爰视频| 美女午夜性视频免费| 视频区图区小说| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 亚洲精华国产精华液的使用体验| 大码成人一级视频| 久久精品国产亚洲av天美| 一区二区三区精品91| 久久久久人妻精品一区果冻| 男女无遮挡免费网站观看| 久久这里只有精品19| 日韩一区二区三区影片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美激情极品国产一区二区三区| 观看美女的网站| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲成国产人片在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 欧美精品一区二区大全| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 日韩不卡一区二区三区视频在线| 99热全是精品| 精品福利永久在线观看| 99久国产av精品国产电影| 亚洲成色77777| www.熟女人妻精品国产| 精品一区二区三卡| 亚洲av福利一区| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | av一本久久久久| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲国产av新网站| 99久久人妻综合| av免费观看日本| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美日韩综合久久久久久| 国产成人av激情在线播放| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲欧洲日产国产| 两个人免费观看高清视频| 精品午夜福利在线看| 国产深夜福利视频在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 看非洲黑人一级黄片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久精品夜色国产| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| www日本在线高清视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久 成人 亚洲| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久综合国产亚洲精品| 1024香蕉在线观看| 国产一区二区 视频在线| av视频免费观看在线观看| 高清av免费在线| 一级爰片在线观看| 精品午夜福利在线看| 老女人水多毛片| 亚洲欧洲国产日韩| 成年av动漫网址| 成人黄色视频免费在线看| 天堂俺去俺来也www色官网| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 色哟哟·www| 美女中出高潮动态图| 少妇的丰满在线观看| 伊人久久国产一区二区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 自线自在国产av| 久久精品国产自在天天线| 亚洲成人一二三区av| 国产精品偷伦视频观看了| 三级国产精品片| 一级,二级,三级黄色视频| a 毛片基地| 国产福利在线免费观看视频| 久久 成人 亚洲| 久久久精品免费免费高清| 国产在线免费精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 最近手机中文字幕大全| 亚洲视频免费观看视频| 又大又黄又爽视频免费| 男人爽女人下面视频在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜福利一区二区在线看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 婷婷成人精品国产| 久久人妻熟女aⅴ| 天堂8中文在线网| 韩国精品一区二区三区| a级毛片在线看网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 1024视频免费在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 久久久久久人妻| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 免费观看无遮挡的男女| 精品人妻在线不人妻| 777米奇影视久久| 精品亚洲成国产av| 26uuu在线亚洲综合色| 免费看av在线观看网站| freevideosex欧美| 五月天丁香电影| 精品酒店卫生间| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 丝瓜视频免费看黄片| 国产成人精品久久久久久| 国产免费视频播放在线视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 免费高清在线观看日韩| 久久 成人 亚洲| 欧美日本中文国产一区发布| √禁漫天堂资源中文www| 熟妇人妻不卡中文字幕| 黄片无遮挡物在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 永久免费av网站大全| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 一区二区av电影网| 如何舔出高潮| 亚洲一区二区三区欧美精品| av不卡在线播放| 亚洲av电影在线进入| 国产精品欧美亚洲77777| 久久人人爽人人片av| 美女大奶头黄色视频| 老司机亚洲免费影院| 黄片小视频在线播放| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲成人一二三区av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 97精品久久久久久久久久精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产精品久久久久久av不卡| 国产探花极品一区二区| 久久综合国产亚洲精品| 高清视频免费观看一区二区| 欧美精品av麻豆av| 蜜桃在线观看..| 国产精品三级大全| 天天影视国产精品| 少妇人妻久久综合中文| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 丝袜人妻中文字幕| 九色亚洲精品在线播放| 九草在线视频观看| 亚洲综合色网址| 国产日韩欧美亚洲二区| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩视频在线欧美| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美日韩综合久久久久久| 免费观看性生交大片5| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩av免费高清视频| 亚洲图色成人| 国产精品无大码| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产精品国产av在线观看| 高清欧美精品videossex| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | a级毛片黄视频| 丝袜人妻中文字幕| 999久久久国产精品视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 在线观看免费视频网站a站| 两个人看的免费小视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 三上悠亚av全集在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 精品一品国产午夜福利视频| 黄色怎么调成土黄色| 欧美最新免费一区二区三区| a 毛片基地| 国产一区二区三区av在线| 亚洲图色成人| 有码 亚洲区| 尾随美女入室| 午夜91福利影院| av网站免费在线观看视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 人人妻人人澡人人看| 免费少妇av软件| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品一区二区在线观看99| 老司机影院成人| av在线观看视频网站免费| 自线自在国产av| 午夜激情久久久久久久| 国产伦理片在线播放av一区| 午夜日韩欧美国产| 一级片免费观看大全| 妹子高潮喷水视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品视频人人做人人爽| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 在线观看一区二区三区激情| 精品午夜福利在线看| 亚洲第一青青草原| 高清不卡的av网站| 久久久国产精品麻豆| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日本免费在线观看一区| 一区二区三区激情视频| 七月丁香在线播放| 蜜桃在线观看..| 精品少妇内射三级| 国产精品 国内视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美精品国产亚洲| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲四区av| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 丝瓜视频免费看黄片| 国产激情久久老熟女| 日本黄色日本黄色录像| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲天堂av无毛| 国产一区有黄有色的免费视频| 中国国产av一级| 免费高清在线观看日韩| 少妇熟女欧美另类| 国产成人91sexporn| 国产精品国产av在线观看| 美女福利国产在线| 日韩一本色道免费dvd| 999久久久国产精品视频| 国产成人精品婷婷| 免费大片黄手机在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 成人手机av| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产高清不卡午夜福利| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日本wwww免费看| 少妇的逼水好多| 国产1区2区3区精品| 精品福利永久在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产激情久久老熟女| 精品酒店卫生间| a 毛片基地| 久久久久精品久久久久真实原创| 日韩一区二区视频免费看| 久久青草综合色| 男女下面插进去视频免费观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 大香蕉久久网| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产一区二区在线观看av| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩欧美精品免费久久| 91国产中文字幕| videos熟女内射| 黄片播放在线免费| 男女免费视频国产| 丝袜在线中文字幕| 国产男人的电影天堂91| 久久久久国产网址| av女优亚洲男人天堂| 最新中文字幕久久久久| 另类亚洲欧美激情| 亚洲综合精品二区| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产亚洲精品第一综合不卡| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 久久97久久精品| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲精品在线美女| 搡女人真爽免费视频火全软件| 一个人免费看片子| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲av电影在线进入| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产成人一区二区在线| 国产精品久久久久成人av| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 男女下面插进去视频免费观看| 久久久久久久国产电影| 国产亚洲最大av| 国产高清不卡午夜福利| 妹子高潮喷水视频| 日韩av免费高清视频| 亚洲成色77777| 国产精品一二三区在线看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 黄色配什么色好看| 免费黄色在线免费观看| 日韩大片免费观看网站| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品99久久99久久久不卡 | 高清欧美精品videossex| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 久久久久久久久久久久大奶| 高清在线视频一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 日日啪夜夜爽| 天美传媒精品一区二区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 高清在线视频一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 满18在线观看网站| 乱人伦中国视频| 综合色丁香网| 午夜福利网站1000一区二区三区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美另类一区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美成人精品欧美一级黄| 有码 亚洲区| 国产精品av久久久久免费| 如何舔出高潮| 国产人伦9x9x在线观看 | 久久精品久久久久久久性| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 五月开心婷婷网| 久久久精品区二区三区| 午夜久久久在线观看| 在线天堂最新版资源| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久久精品94久久精品| 成年美女黄网站色视频大全免费| 自线自在国产av|