外源性H2S對血管性癡呆大鼠缺血再灌注后神經(jīng)元線粒體損傷及其相關(guān)信號通路的影響

劉雨霞 肖子宇 鄭菊 張文萍 齊曉嵐 吳昌學(xué) 李毅 官志忠 肖雁

(地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州醫(yī)科大學(xué),貴州 貴陽 550004)

血管性癡呆(VaD)是指各種腦血管疾病引起腦功能障礙而造成的后天性智能障礙綜合征,其作為最常見的老年期癡呆之一,患病人數(shù)占所有老年癡呆人數(shù)的15%〔1〕,屬于血管性認(rèn)知障礙(VCI)的一類,發(fā)病后嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量〔2,3〕。高血壓、動(dòng)脈硬化、冠心病和糖尿病等多種疾病均可引起腦血管不同程度的狹窄、閉塞等病理改變,使海馬等參與認(rèn)知功能的重要部位處于缺血缺氧低灌注狀態(tài),導(dǎo)致VaD的發(fā)生〔4〕。線粒體是胞內(nèi)能量產(chǎn)生的場所,常被稱為“細(xì)胞的動(dòng)力工廠”,是缺血再灌注所致神經(jīng)元損傷的靶點(diǎn)。在VaD大鼠海馬中觀察到神經(jīng)元線粒體損傷,推測線粒體損傷與缺血再灌注后學(xué)習(xí)記憶功能障礙有關(guān)〔5〕。硫化氫(H2S)可以通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡而起到腦保護(hù)作用,在缺血再灌注損傷中的作用受到關(guān)注〔6,7〕。本課題組前期用H2S供體硫氫化鈉(NaSH)處理VaD模型大鼠,發(fā)現(xiàn)外源性H2S可以通過減輕神經(jīng)元細(xì)胞凋亡改善VaD大鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力及病理變化〔8〕。本研究利用改良二血管法(2-VO)結(jié)扎SD大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈制作VaD模型,使用NaSH作為H2S供體,探討外源性H2S對VaD大鼠海馬神經(jīng)元線粒體功能與線粒體自噬及其相關(guān)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 成年健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量220～250 g,購自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,合同號:SCKY(黔)2018-0001。所有實(shí)驗(yàn)操作獲得貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的許可。

1.2主要試劑及抗體 Tris、甘氨酸、氯化鈉(NaCl)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tween-20、苯甲基磺酰氟(PMSF)、脫脂奶粉均購自北京Solarbio有限公司,二甲亞砜(DMSO)、NaSH均購自美國Sigma公司;DMEM/F12(1∶1)完全培養(yǎng)基、無糖DMEM、澳洲胎牛血清均購自美國Gibco公司;0.25%胰酶消化液、雙抗、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑、電化學(xué)發(fā)光(ECL)-Plus液購于美國Thermo Fisher Scientific公司;組織線粒體分離試劑盒、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)快速凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、一抗稀釋液、二抗稀釋液、一抗二抗去除液均購于碧云天生物技術(shù)公司;預(yù)染Marker購自愛必信生物有限公司,聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于美國Millipore公司?？贵w:Beclin1 抗體(ab217179)、SQSTM1/P62抗體(ab91526)均購自美國Abcam公司;COX Ⅳ(#4850)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR,#2983)、P-mTOR(#5536)、蛋白激酶B(Akt,#4691)、P-Akt(#4060)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔二抗(#7074)均購自美國CST公司;Anti-beta actin(abs830031)購于上海愛必信公司。

1.3動(dòng)物篩選及分組 雄性SD大鼠210只。保持室溫25 ℃,清潔環(huán)境下以純凈水、標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)30 d后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),檢測其學(xué)習(xí)記憶能力,1～4 d對大鼠的定航能力及學(xué)習(xí)能力進(jìn)行檢測:按照相同順序分別將四個(gè)象限中點(diǎn)作為大鼠入水點(diǎn),使其面向池壁放入水中,進(jìn)行自由探索,若60 s內(nèi)找到平臺即結(jié)束實(shí)驗(yàn),若未找到則引導(dǎo)其站至平臺上并停留10 s結(jié)束實(shí)驗(yàn)。第5天檢測其學(xué)習(xí)記憶能力:開始撤除平臺,仍將各象限中點(diǎn)作為其入水點(diǎn),使其自由探索,并記錄其在60 s內(nèi)第一次游經(jīng)平臺原位置所需時(shí)間(即逃避潛伏期)及60 s內(nèi)大鼠穿越平臺目標(biāo)區(qū)域次數(shù)、目標(biāo)象限內(nèi)停留時(shí)間。選取時(shí)間、記憶力相近的SD大鼠180只,按缺血進(jìn)程的急性缺血期、缺血損傷期、損傷恢復(fù)期,利用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為1、7、30 d 3個(gè)時(shí)間段,每個(gè)時(shí)間段各設(shè)置假手術(shù)(Sham)組、模型(VaD)組、陽性對照〔尼莫地平(Nimodipine)〕組、NaSH低劑量(Low-NaSH)組、NaSH高劑量(High-NaSH)組,每組12只。

1.4VaD大鼠模型制備 大鼠術(shù)前10 h禁食禁水。按照0.3 ml/100 g體質(zhì)量的劑量經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉后仰臥位固定,頸部備皮,碘伏,75%酒精常規(guī)消毒,頸前正中線切口,分離暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,Sham組僅進(jìn)行分離操作不進(jìn)行結(jié)扎,其他各組均使用手術(shù)線永久結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈,傷口噴灑使用青霉素粉預(yù)防傷口感染,縫合皮膚并作常規(guī)消毒。常規(guī)飲食清潔飼養(yǎng)。

1.5SD大鼠給藥 為保持藥物處理時(shí)間一致,1、7 d各組術(shù)前灌胃給藥30 d,30 d各組術(shù)后灌胃給藥30 d,Nimodipine組10 mg/(kg·d)Nimodipine灌胃給藥、Low-NaSH組及High-NaSH組分別灌胃30、100 μmol/kg NaSH,VaD組和Sham組用等量生理鹽水灌胃。

1.6行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 給藥結(jié)束后利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對30 d各組學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測,方法同1.3。

1.7樣本制備 水迷宮測試結(jié)束后進(jìn)行取材。稱重后腹腔注射10%水合氯醛(0.45 ml/100 g),麻醉后用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)心臟灌注取腦,冰上分離海馬組織,用組織線粒體分離試劑盒提取海馬線粒體,部分于-80 ℃凍存。

1.8Western印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) BCA蛋白定量法于570 nm波長檢測吸光度從而測定胞漿蛋白濃度,以12 μl/20 μg體系每孔上樣于12%的SDS-PAGE凝膠,30 mA恒流進(jìn)行電泳分離,200 mA轉(zhuǎn)膜75 min,一抗孵育(Akt、P-Akt、mTOR、P-mTOR、P62、Beclin1、COXⅣ用一抗稀釋液稀釋1 000倍,actin用一抗稀釋液稀釋3 000倍),兔二抗稀釋5 000倍進(jìn)行二抗孵育,化學(xué)發(fā)光成像儀成像。用ImageJ分析曝光圖片中各條帶灰度值,計(jì)算結(jié)果時(shí),以COXⅣ條帶灰度值作為內(nèi)參,計(jì)算P62、Beclin1蛋白條帶灰度值與COXⅣ條帶灰度值的比值表示P62、Beclin1蛋白表達(dá)量相對水平;以actin作為參照,計(jì)算P-Akt、P-mTOR蛋白條帶灰度值與Akt、mTOR條帶灰度值的比值表示P-Akt、P-mTOR蛋白表達(dá)量相對水平

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20軟件進(jìn)行單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)結(jié)果 Sham組逃避潛伏期隨時(shí)間增加而縮短;VaD組逃避潛伏期較Sham組長且隨時(shí)間變化不明顯;第三天后,Nimodipine、Low-NaSH、High-NaSH組逃避潛伏期較VaD組短,但Low-NaSH組逃避潛伏期比Nimodipine組和High-NaSH組更長。在第五天空間探索實(shí)驗(yàn)中,與Sham組比較,VaD組逃避潛伏期延長、穿越平臺次數(shù)減少、目標(biāo)區(qū)域時(shí)間降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),表明大鼠2-VO術(shù)后30 d學(xué)習(xí)記憶能力及定航能力受到損傷;與VaD組比較,Nimodipine組及NaSH不同劑量組逃避潛伏期降低、穿越平臺次數(shù)增加、目標(biāo)區(qū)域時(shí)間延長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);與Low-NaSH組比較,High-NaSH組逃避潛伏期較短、穿越平臺次數(shù)較多、目標(biāo)區(qū)域時(shí)間較長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見表1。

表1 各組Morris水迷宮不同時(shí)間逃避潛伏期及Morris水迷宮第五天學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.2各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白Beclin1表達(dá) 術(shù)后1 d,與Sham組比較,VaD組Beclin1表達(dá)顯著降低;與VaD組比較,不同劑量NaSH組Beclin1表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。術(shù)后7、30 d,與Sham組比較,VaD組Beclin1表達(dá)顯著升高;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組Beclin1表達(dá)顯著降低;與Low-NaSH組比較,High-NaSH組Beclin1表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見圖1、表2。

1～5:Sham組、VaD組、Nimodipine組、Low-NaSH組、High-NaSH組;下圖同圖1 Western印跡檢測各組Beclin1、P62表達(dá)水平

2.3各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白P62表達(dá) 術(shù)后1 d,各組P62蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后7 d,與Sham組比較,VaD組P62表達(dá)顯著降低;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組P62表達(dá)顯著升高(均P<0.01)。術(shù)后30 d,與Sham組比較,VaD組P62表達(dá)顯著升高;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組P62表達(dá)顯著降低;與Low-NaSH組比較,High-NaSH組P62表達(dá)顯著降低(均P<0.01)。見表2、圖2。

2.4各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)自噬通路蛋白P-Akt表達(dá) 術(shù)后1 d,與Sham組比較,VaD組P-Akt表達(dá)顯著降低;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組P-Akt表達(dá)顯著降低;與Low-NaSH組比較,High-NaSH組P-Akt表達(dá)顯著降低(均P<0.01)。術(shù)后7 d,與Sham組比較,VaD組P-Akt表達(dá)顯著降低;與VaD組比較,不同劑量NaSH組P-Akt表達(dá)顯著升高(均P<0.01)。術(shù)后30 d,與Sham組比較,VaD組P-Akt表達(dá)顯著降低;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組P-Akt表達(dá)顯著升高;與Low-NaSH組比較,High-NaSH組P-Akt表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表2、圖2。

2.5各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)自噬通路蛋白P-mTOR表達(dá) 術(shù)后1 d,與Sham組比較,VaD組P-mTOR表達(dá)顯著降低;與VaD組及Low-NaSH組比較,High-NaSH組P-mTOR表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01)。術(shù)后7 d,與Sham組比較,VaD組P-mTOR表達(dá)顯著降低;與VaD組比較,High-NaSH組P-mTOR表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01)。術(shù)后30 d,與Sham組比較,VaD組P-mTOR表達(dá)顯著降低;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組P-mTOR表達(dá)顯著升高;與Low-NaSH組比較,High-NaSH組P-mTOR表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表2、圖2。

表2 各組海馬神經(jīng)元線粒體中Beclin1、P62及胞質(zhì)中P-Akt、P-mTOR表達(dá)水平比較

圖2 Western印跡檢測各組P-Akt、P-mTOR表達(dá)水平

3 討 論

VaD被廣泛認(rèn)為是除阿爾茨海默病(AD)后第二種最常見的癡呆類型,其臨床表現(xiàn)主要有神經(jīng)認(rèn)知障礙,還包括行為癥狀,運(yùn)動(dòng)異常等。缺血后慢性低灌注也是VaD的常見誘因之一,腦卒中后慢性低灌注導(dǎo)致腦血流量(CBF)降低,缺氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激并且引發(fā)炎癥反應(yīng),氧化應(yīng)激使血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞受損從而導(dǎo)致CBF進(jìn)一步降低,這些病理變化發(fā)生在大腦并導(dǎo)致VaD〔9〕。2-VO法可導(dǎo)致大鼠皮質(zhì)區(qū)域整個(gè)CBF突然減少至35%～45%,并導(dǎo)致海馬中CBF減少至60%〔10～12〕,能很好模擬人類衰老和癡呆中發(fā)生的全腦慢性低灌注。

線粒體是一種重要的細(xì)胞器,在活細(xì)胞中主要負(fù)責(zé)能量代謝和氧自由基(ROS)生成,同時(shí)也是缺血再灌注損傷的靶細(xì)胞器〔13〕,腦卒中后慢性低灌注可引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)線粒體發(fā)生功能障礙〔14〕。自噬是介導(dǎo)功能障礙線粒體去除的關(guān)鍵細(xì)胞機(jī)制之一。本研究結(jié)果說明,在急性缺血期線粒體發(fā)生功能障礙,可能是線粒體自噬還未被激活,術(shù)后7 d及30 d線粒體自噬程度隨術(shù)后時(shí)間延長而增加,且術(shù)后7 d時(shí)P62表達(dá)量降低,可能是因?yàn)榇藭r(shí)已經(jīng)過了急性缺血期(1 d),并且在缺血損傷期線粒體自噬處于穩(wěn)定狀態(tài),P62募集水平小于其降解水平。而術(shù)后30 d時(shí)P62表達(dá)量與Beclin1同步升高,可能是因?yàn)樵趽p傷修復(fù)期線粒體自噬程度升高,也可能與損傷后自我修復(fù)過程中線粒體自噬流受到抑制有關(guān)。推測在某一時(shí)間段內(nèi),神經(jīng)細(xì)胞中線粒體自噬程度隨缺血再灌注時(shí)間延長而加深,而缺血時(shí)間超過機(jī)體限度時(shí)再灌注會(huì)誘發(fā)細(xì)胞死亡。其中具體機(jī)制可能與缺血再灌注過程中線粒體功能、線粒體自噬及細(xì)胞存活之間的調(diào)控有關(guān)。

研究表明,H2S是一種新型氣體遞質(zhì),類似于一氧化氮和一氧化碳,通過抗炎癥〔15〕和抗氧化應(yīng)激對心腦血管起保護(hù)作用〔16〕。有研究指出,H2S對腦缺血小鼠的血腦屏障完整性起著重要的保護(hù)作用〔17〕。此外,有研究證明H2S對氧糖剝奪再灌注(OGD/R)誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中線粒體功能起到保護(hù)作用〔18〕。同時(shí)有研究表明,H2S與自噬有關(guān),H2S通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt1通路抑制心肌纖維化的自噬〔19〕。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)VaD大鼠血漿H2S含量降低、學(xué)習(xí)記憶能力受損,NaSH處理后血漿H2S含量升高且學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)〔8〕,而H2S改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制目前尚不明確。同時(shí),H2S對于腦缺血再灌注損傷中線粒體自噬的作用尚無定論,但有研究認(rèn)為當(dāng)自噬在疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮正面作用時(shí),外源性H2S處理可使自噬上調(diào),當(dāng)自噬發(fā)揮負(fù)面作用時(shí),外源性H2S通過下調(diào)自噬發(fā)揮保護(hù)作用〔20〕。本研究結(jié)果說明,外源性H2S作為預(yù)防藥處理后大鼠海馬神經(jīng)元線粒體自噬程度降低,并且缺血再灌注7 d大鼠海馬神經(jīng)元線粒體自噬流被抑制:而作為治療藥物處理,同樣能使缺血再灌注30 d VaD大鼠海馬神經(jīng)元線粒體自噬程度降低。此前有研究通過抑制人神經(jīng)元細(xì)胞母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)細(xì)胞內(nèi)線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白降低了OGD/R后的線粒體自噬,并且改善了線粒體形態(tài)及功能,提高了細(xì)胞活力〔21〕。推測在VaD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中,缺血再灌注導(dǎo)致的線粒體自噬過量,在VaD發(fā)病中起負(fù)面作用,而H2S通過降低海馬神經(jīng)元中線粒體自噬水平起到神經(jīng)元保護(hù)作用。本研究說明,高劑量NaSH能更好降低缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞線粒體自噬程度,能較好改善VaD大鼠腦組織中神經(jīng)元線粒體功能障礙,從而對VaD大鼠發(fā)揮更強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是一種重要的信號傳導(dǎo)介質(zhì),對損傷后神經(jīng)元存活產(chǎn)生顯著影響。通常被視為關(guān)鍵神經(jīng)保護(hù)信號通路之一〔22〕。PI3K是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,通過調(diào)節(jié)其下游信號通路在腦缺氧缺血性損傷中發(fā)揮核心作用,而Akt作為關(guān)鍵信息分子,是PI3K 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要下游靶點(diǎn)?？纱碳ぜ?xì)胞存活、增殖、抑制細(xì)胞凋亡,維持正常功能。同時(shí),作為Akt重要底物之一,mTOR是細(xì)胞存活、增殖、分化和代謝的主要調(diào)節(jié)因子,并且P-mTOR活性升高可抑制自噬〔23〕。研究證實(shí),經(jīng)過缺血再灌注損傷后的神經(jīng)細(xì)胞中P-PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達(dá)受到抑制。同時(shí),Akt/mTOR通路與線粒體自噬呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。外源性H2S可通過PI3K/Akt/mTOR途徑抑制自噬從而改善脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷〔24〕。本研究發(fā)現(xiàn),外源性H2S可減輕腦缺血再灌注損傷后的線粒體自噬,術(shù)后7 d及30 d模型組Akt/mTOR通路均受到抑制,但NaSH處理后Akt/mTOR通路被激活且線粒體自噬受到抑制,同時(shí)30 d NaSH高劑量處理組P-mTOR、P-Akt表達(dá)量較NaSH低劑量明顯升高,與30 d組線粒體自噬程度呈負(fù)相關(guān),推測外源性H2S可通過上調(diào)Akt/mTOR通路抑制神經(jīng)元線粒體自噬并改善其線粒體形態(tài)及功能,從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受缺血再灌注損傷。此前Xu等〔25〕發(fā)現(xiàn),NaSH可通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制線粒體自噬改善線粒體功能,并起到改善腦應(yīng)激性損傷后的功能恢復(fù)作用。本研究結(jié)果提示,OGD/R在1 d后Akt/mTOR通路受到抑制,用陽性藥物及NaSH處理后P-Akt與P-mTOR表達(dá)量與模型組比較均降低,說明NaSH處理后Akt/mTOR通路進(jìn)一步受到抑制,但是觀察到線粒體自噬程度卻也降低,說明Akt/mTOR通路與線粒體自噬調(diào)節(jié)不是一個(gè)專一性調(diào)控,可能還有其他通路參與外源性H2S對腦缺血再灌注過程中的線粒體自噬的調(diào)控。

綜上,缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體功能受損并激活胞內(nèi)線粒體自噬,在缺血急性期線粒體損傷嚴(yán)重但無明顯線粒體自噬發(fā)生,同時(shí)在一定時(shí)間段內(nèi)隨著缺血時(shí)間增加,線粒體自噬程度增強(qiáng)。外源性H2S可保護(hù)缺血再灌注所致神經(jīng)元線粒體功能受損,降低VaD大鼠海馬神經(jīng)元的線粒體自噬程度,從而對神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用,Akt/mTOR通路在其中起到調(diào)控作用。且高劑量NaSH處理比低劑量 NaSH處理能更好改善VaD大鼠腦組織中神經(jīng)元線粒體功能障礙、降低神經(jīng)元線粒體自噬程度,對學(xué)習(xí)、記憶及定航能力有更好的改善作用。