基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討苗藥黑骨藤治療阿爾茨海默病的作用機(jī)制

舒燕霞 郭江濤 徐文芬 張永萍,2,3 孫開芬 石興雨 曾令琴

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心;3貴州中藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心)

阿爾茨海默病(AD),又稱老年癡呆,是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病,其以廣泛性大腦皮質(zhì)萎縮引起的認(rèn)知功能減退、行為及人格變化為特征,也是導(dǎo)致老年人死亡的4大疾病之一〔1～3〕。調(diào)查結(jié)果顯示,全球約有5 000萬人患有AD,我國(guó)目前有近600萬的AD患者,65歲以上的老年人群中AD患病率高達(dá)3.21%,預(yù)計(jì)2040年將達(dá)到2 200萬人〔4～6〕。各國(guó)學(xué)者雖開展其相關(guān)新藥的研究,但大多以失敗告終。目前被批準(zhǔn)用于治療的藥物,只針對(duì)AD的某個(gè)單一致病靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)防或治療,雖在一定程度上改善患者癥狀,但不足以阻斷或逆轉(zhuǎn)其病理發(fā)展,且具有錐體外系癥狀、遲發(fā)型運(yùn)動(dòng)障礙等副作用〔7～10〕。

近年來,中藥以其多組分、多靶點(diǎn)、協(xié)同效果及毒副作用小等特點(diǎn),已引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。黑骨藤是貴州著名的十大苗藥之一,系蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨的干燥根或全株,有祛風(fēng)除濕、舒筋活血、止痛之效,主治風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、骨折骨痛及各種神經(jīng)性疼痛等癥〔11～13〕。黑骨藤中含有黃酮類、甾體類、三萜類、蒽醌類等化學(xué)成分,具有抗類風(fēng)濕、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化及神經(jīng)修復(fù)等藥理活性〔14～17〕,研究發(fā)現(xiàn)該藥材的抗氧化和神經(jīng)修復(fù)作用能有效降低神經(jīng)退化性疾病AD的發(fā)生〔16,18,19〕,揭示黑骨藤在治療AD方面具有很好的潛力,但目前關(guān)于黑骨藤治療AD的活性成分和作用機(jī)制尚未明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從多成分、多靶點(diǎn)及多通路的角度出發(fā),揭示藥物成分、靶點(diǎn)、疾病之間復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,分析、預(yù)測(cè)藥物作用機(jī)制的研究方法〔20〕。分子對(duì)接技術(shù)則對(duì)于給定的蛋白質(zhì)和配體,均可通過預(yù)測(cè)它們的結(jié)合模式及結(jié)合自由能,對(duì)其功能及作用機(jī)制進(jìn)行研究〔21〕。因此,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,從分子水平分析苗藥黑骨藤的有效成分,預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路,并采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)其核心靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行對(duì)接,初步探討該藥材治療AD的作用機(jī)制,以期為黑骨藤治療AD的藥理研究和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1苗藥黑骨藤活性成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建 通過中國(guó)知網(wǎng)(CNKI,https://www.cnki.net/)、萬方(https://www.wanfangdata.com.cn/index.html)、PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)等數(shù)據(jù)庫(kù)收集黑骨藤的化學(xué)成分。借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP,http://tcm-spw.com/tcmsp.php),以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18及分子量(MW)<500為限定條件對(duì)所收集到的化學(xué)成分進(jìn)行篩選;尚未在TCMSP中收錄的成分則用Swiss ADME數(shù)據(jù)庫(kù),以胃腸道吸收(GI absorption)的設(shè)置為“High”、DL滿足“Yes”為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,即可獲取兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)整合的活性成分庫(kù)。

在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取潛在活性成分的SMILES式,將SMILES式導(dǎo)入Swiss Target Prediction(http:swisstar-getprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫(kù),以Probability>0為篩選條件,預(yù)測(cè)出與活性成分相關(guān)的作用靶點(diǎn);在SEA Search Server(https://sea.bkslab.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中,以人源基因?yàn)楹Y選標(biāo)準(zhǔn)獲取Swiss Target Prediction中尚未收錄的成分的相關(guān)靶點(diǎn)。整合Swiss Target Prediction、SEA Search Server數(shù)據(jù)庫(kù)活性成分相關(guān)靶點(diǎn)信息,篩除重復(fù)靶點(diǎn),建立黑骨藤潛在活性成分的作用靶點(diǎn)庫(kù)。

1.2AD疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建 利用GeneCards(https://genealacart.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM(https://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),以“Alzheimer′s disease”“AD”“mild cognitive impairment”“MCI”“dementia”為關(guān)鍵詞,進(jìn)行人類基因檢索。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中,由于疾病靶點(diǎn)數(shù)目龐大,則根據(jù)relevance score值進(jìn)行中位數(shù)篩選,以獲得更相關(guān)的靶點(diǎn)。合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)AD疾病靶點(diǎn),刪除重復(fù)項(xiàng),建立AD疾病靶點(diǎn)庫(kù)。

1.3藥物-疾病交集靶點(diǎn)的獲取 將黑骨藤活性成分靶點(diǎn)和AD疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1.0(https:// bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中,獲得交集靶點(diǎn)的韋恩圖,所得交集靶點(diǎn)即為黑骨藤活性成分可能作用于疾病的潛在靶點(diǎn)。

1.4“藥物-成分-成分靶點(diǎn)”“成分-疾病-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.1和1.3中的苗藥黑骨藤活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)、成分與疾病的交集靶點(diǎn)分別建立網(wǎng)絡(luò)文件,并編輯其屬性文件。將兩個(gè)文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件中,構(gòu)建“藥物-成分-成分靶點(diǎn)”和“成分-疾病-交集靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)分別為藥物、疾病、成分、靶點(diǎn),各節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系以邊表示。

1.5蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選 將1.3中得到的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org),選擇“Multiple proteins”,設(shè)定物種條件為“Homo sapiens”,修改默認(rèn)參數(shù),選擇中等置信度為“0.400”,即獲得PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。在“Exports”中下載tsv.格式文件,將其導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件,根據(jù)degree值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺,繪制PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。在PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中,以大于度值(degree)、中介性和緊密性的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn),且根據(jù)度值排序,篩選其核心靶點(diǎn),繪制核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.6基因本體(GO)富集分析和基因組百科全書(KEGG)信號(hào)通路分析 通過HIPLOT(https://hiplot.com.cn/advance)數(shù)據(jù)庫(kù),選擇GO/KEGG富集分析模塊,將1.3中的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)表中,數(shù)據(jù)庫(kù)選擇“public/db/kegg/hsa_kegg_20210326.rds”、物種選擇“org.Hs.eg.db”,特殊參數(shù)設(shè)置P<0.05、Q<0.05。利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平臺(tái),將前10條功能注釋目錄和前20條信號(hào)通路目錄,以柱狀圖和氣泡圖的形式可視化。其中,GO富集包括生物過程(BP),分子功能(MF)和細(xì)胞組分(CC)。

1.7“活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.6中KEGG分析的前20條信號(hào)通路所富集的靶點(diǎn)分別與1.1中苗藥黑骨藤各活性成分的靶點(diǎn)進(jìn)行交集,各交集靶點(diǎn)合并,刪除重復(fù)項(xiàng),建立網(wǎng)絡(luò)文件,并編輯其屬性文件。將兩個(gè)文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件中,構(gòu)建“活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”的可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.8活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 將黑骨藤的24個(gè)活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前5(degree>75)的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。在Zinc(http://zinc.docking.org/substances/home/)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取配體活性成分3D結(jié)構(gòu)的mol 2或sdf.格式文件;通過Open Babel3.1.1軟件將小分子的sdf.格式轉(zhuǎn)化為mol 2格式。同時(shí)在PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載靶蛋白3D結(jié)構(gòu)的pdb.格式,通過PyMOL2.4.1軟件將蛋白質(zhì)中水分子和多余的非活性配體移除,并將結(jié)果導(dǎo)入到AutoDock Tools1.5.6軟件進(jìn)行加氫、加電荷處理,輸出為pdbqt.格式。在Grid模塊設(shè)置對(duì)接搜索空間,通過Autodock vina運(yùn)行分子對(duì)接過程,結(jié)合能Affinity<0表明受體和配體具有自發(fā)結(jié)合潛力,Affinity≤-5.0 kcal/mol說明化學(xué)成分與靶點(diǎn)對(duì)接效果較好〔22〕,最后利用PyMOL2.4.1軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1活性成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建 將黑骨藤所含化學(xué)成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出潛在活性成分15個(gè),見表1;TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中未收載的成分,通過Swiss ADME數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到9個(gè)活性成分:Periforgenin C(HGT15)、3β,5β-dihydroxy-14-en-card-20(22)-enolide(HGT16)、臭矢菜素A(HGT17)、臭矢菜素B(HGT18)、(-)-丁香樹脂醇〔(-)-Syringaresinol,HGT19〕、(E)-1-(2,4-dihydroxy-phenyl)-Ethyl acrylate(HGT20)、鄰苯二甲酸二丁酯(HGT21)、滇杠柳苷元A(HGT22)、(+)-1-羥基松脂酚(HGT24)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的活性成分合并,最終得到24個(gè)活性化合物。在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中,以Probability>0篩選得到各活性成分的作用靶點(diǎn)1 521個(gè),并利用SEA Search Server數(shù)據(jù)庫(kù),以人源基因靶點(diǎn)為篩選標(biāo)準(zhǔn)獲取Swiss Target Prediction中尚未收錄的活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)70個(gè)。對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)所收集的活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行整合,并剔除重復(fù)靶點(diǎn),共得到黑骨藤活性成分潛在作用靶點(diǎn)574個(gè)。

2.2AD疾病靶點(diǎn)與交集靶點(diǎn)的獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取AD疾病靶點(diǎn),其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)AD疾病靶點(diǎn)1 505個(gè)(relevance score≥13.15),OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)525個(gè),所有靶點(diǎn)合并剔除重復(fù)值后,得到1 513個(gè)AD疾病靶點(diǎn)。將1 513個(gè)疾病靶點(diǎn)與574個(gè)藥物靶點(diǎn)通過Venny 2.1.0網(wǎng)站在線分析,即可獲得159個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.3“藥物-成分-靶點(diǎn)”“成分-疾病-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 選擇黑骨藤的24個(gè)活性成分和106個(gè)潛在作用靶點(diǎn)(degree≥5)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),并以degree值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小,該值越大則節(jié)點(diǎn)越大,見圖1;圖中共131個(gè)節(jié)點(diǎn),740條邊代表該藥材化學(xué)成分與靶點(diǎn)之間的相互作用,活性成分節(jié)點(diǎn)越大,表明該成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)越多、靶點(diǎn)與成分之間的相互作用越強(qiáng)、成分越核心,體現(xiàn)了黑骨藤多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。另將黑骨藤活性成分和交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0構(gòu)建“成分-疾病-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),見圖2;圖中184個(gè)節(jié)點(diǎn)、519條邊代表交集靶點(diǎn)與活性成分之間的作用關(guān)系。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的黑骨藤活性成分信息

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選 將159個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置中等置信度為“0.400”,獲得蛋白相互作用關(guān)系,將其tsv.文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò),見圖3;網(wǎng)絡(luò)包含159個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 981條邊、平均節(jié)點(diǎn)度值為24.9,節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn),邊代表蛋白間相互作用關(guān)系,線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大。根據(jù)degree值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺,degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深,依據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)可知,有較多節(jié)點(diǎn)的化合物或疾病靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中可能起到核心作用。

在PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中,以大于degree、中介性和緊密性的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn),綜合篩選得78個(gè)靶點(diǎn),根據(jù)degree排序,選擇前20個(gè)(degree>45)靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn),包括絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)1、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)3、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)A、類固醇受體輔助活化因子(SRC)、半胱氨酸蛋白酶(CASP)3等靶點(diǎn),見表2、圖4;網(wǎng)絡(luò)包含20個(gè)節(jié)點(diǎn)、183條邊,根據(jù)degree值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺,degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深,說明其參與生物功能越多,作用越強(qiáng)。

黃色“V”字形:AD;紫色菱形:活性成分;藍(lán)色圓形:交集靶點(diǎn)圖2 “成分-疾病-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

2.5GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析 將159個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入HIPLOT數(shù)據(jù)庫(kù)中,設(shè)置P<0.05、Q<0.05進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析。其中,GO富集分析得2 661條BP,涉及蛋白AKT活性的正調(diào)控、蛋白質(zhì)的自磷酸化、神經(jīng)細(xì)胞死亡等;587條MF條目,包括蛋白AKT活性、內(nèi)肽酶活性、磷酸酶結(jié)合等;311條CC,涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等,根據(jù)基因數(shù)目排序,利用微生信平臺(tái)繪制3個(gè)聚類分析的前10條功能目錄的柱狀圖,見圖5。柱狀圖越高,表示在該通路上所富集的靶點(diǎn)越多,該通路越重要。KEGG信號(hào)通路分析得218個(gè)條目,結(jié)果表明基因主要富集于AD、神經(jīng)退行性疾病的途徑-多發(fā)性疾病、炎癥和免疫(如卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染)、癌癥中的蛋白多糖、人類巨細(xì)胞病毒感染、內(nèi)分泌阻力、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)通路。利用微生信繪制前20條信號(hào)通路的氣泡圖,見圖6。圖中橫坐標(biāo)代表基因比率,縱坐標(biāo)代表通路;氣泡越大表示在該通路上富集的基因數(shù)量越多,顏色越紅表示P值越小、富集的顯著性越高。

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)(前20)

圖4 核心靶點(diǎn)(前20)

橫坐標(biāo):基因比率;縱坐標(biāo):通路圖5 苗藥黑骨藤抗AD潛在靶點(diǎn)的GO富集分析

橫坐標(biāo):基因比率;縱坐標(biāo):通路圖6 苗藥黑骨藤抗AD潛在靶點(diǎn)的KEGG信號(hào)通路

2.6“活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”圖的構(gòu)建 利用Cytoscape3.8.0繪制“活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”,根據(jù)degree值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小,degree值越大節(jié)點(diǎn)越大,說明其相互作用越強(qiáng)、對(duì)AD的影響越大,共有132個(gè)節(jié)點(diǎn)、720條邊,由圖7可知,苗藥黑骨藤治療AD是通過該藥中的24個(gè)活性成分作用于20個(gè)主要通路和88個(gè)靶點(diǎn)基因的結(jié)果。

2.7分子對(duì)接驗(yàn)證 將24個(gè)活性化合物與5個(gè)核心靶點(diǎn)AKT1(PBD,ID:3OS5)、MAPK3(PBD,ID:6GES)、VEGFA(PBD,ID:6Z13)、SRC(PBD,ID:2PFH)、CASP3(PBD,ID:4QUJ)進(jìn)行分子對(duì)接,最終得到120組受體-配體對(duì)接結(jié)果,見圖8。

成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能及形成氫鍵數(shù)量是評(píng)價(jià)分子對(duì)接結(jié)果的重要依據(jù)〔23〕。一般認(rèn)為結(jié)合能Affinity<0,化合物與蛋白可自發(fā)結(jié)合,結(jié)合能越低、氫鍵數(shù)量越多,結(jié)合就越穩(wěn)定,靶點(diǎn)與分子作用的可能性就越大。分子對(duì)接結(jié)果顯示,120組受體-配體對(duì)接結(jié)合能Affinity均≤-5.0 kcal/mol,其中≤-9.0 kcal/mol的有33組,占27.5%,表明本研究中所預(yù)測(cè)的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間均具有較強(qiáng)的結(jié)合能力,證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。將以上對(duì)接結(jié)果以PyMol2.4.1軟件進(jìn)行可視化,部分結(jié)果見圖9。如圖所示,活性成分山柰酚、槲皮素、漢黃芩素等與關(guān)鍵靶點(diǎn)SRC、MAPK3、VEGFA等結(jié)合能均≤-9.0 kcal/mol,且氫鍵數(shù)量均≥3,表明其結(jié)合構(gòu)象較穩(wěn)定、結(jié)合能力較強(qiáng)。

圖9 “核心成分-核心靶點(diǎn)”對(duì)接結(jié)果

3 討 論

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)苗藥黑骨藤的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)生物信號(hào)通路及其抗AD的作用機(jī)制等進(jìn)行了探討,并對(duì)其活性成分與相關(guān)核心靶點(diǎn)進(jìn)行了分子對(duì)接。根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18及符合類藥性五原則篩選獲得山柰酚、槲皮素、漢黃芩素、丹參酮ⅡA、杠柳苷元等24個(gè)潛在的活性成分。其中,槲皮素可提高體外培養(yǎng)神經(jīng)元活性,改善氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng),抑制AD動(dòng)物腦內(nèi)毒性片段β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～42聚集、延緩Aβ的沉積速度,以改善AD大鼠記憶功能而達(dá)到治療AD的目的〔24,25〕。山柰酚可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、改善膽堿能系統(tǒng)認(rèn)知功能、抑制腦內(nèi)Aβ的形成產(chǎn)生抗AD效應(yīng)〔26～28〕。丹參酮ⅡA可通過抑制AD誘導(dǎo)的一氧化氮合酶(iNOS)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2蛋白的表達(dá),減少氧化性毒害自由基的產(chǎn)生來緩解AD癥狀〔29〕。漢黃芩素可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移率、減少趨化因子單核細(xì)胞趨化因子(MCP)-1和正常T-細(xì)胞表達(dá)分泌因子(RANTES)的分泌減緩AD進(jìn)程〔30〕。杠柳苷元是黑骨藤中具有抗增殖作用的成分,可通過改變死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,特異性地殺傷脂肪肉瘤細(xì)胞,進(jìn)而治療AD〔31〕。

本研究共獲得黑骨藤活性成分作用靶點(diǎn)與AD疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)159個(gè),這159個(gè)靶點(diǎn)可能是該藥材抗AD潛在靶點(diǎn)。結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)與分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn),AKT1、MAPK3、SRC、CASP3及VEGFA等核心靶點(diǎn)與黑骨藤活性成分具有較好的結(jié)合性能。相關(guān)研究表明,AKT1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中是一個(gè)用于神經(jīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)控因子,其氧化修飾作用可導(dǎo)致突觸功能障礙,致使AD患者產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙〔32〕。MAPK能夠參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的整個(gè)生命過程,激活MAPK可使神經(jīng)元中tau蛋白磷酸化水平增加;而抑制海馬區(qū)MAPK表達(dá)可明顯改善記憶、認(rèn)知功能和突觸可塑性,證明MAPK可能是治療AD的一個(gè)潛在靶點(diǎn)〔33,34〕。SRC是生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路中重要組成部分,而CASP3、VEGFA等均與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔35,36〕。因此,以上靶點(diǎn)可能在苗藥黑骨藤治療AD中發(fā)揮重要作用。

本文結(jié)果提示,黑骨藤治療AD呈現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)。本文KEGG代謝通路富集結(jié)果顯示,黑骨藤抗AD涉及的信號(hào)通路。排名最前的即為AD相關(guān)的信號(hào)通路,體現(xiàn)出苗藥黑骨藤治療AD具有較強(qiáng)的靶向性。炎癥在AD的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用〔37〕,Aβ的聚集會(huì)引起小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活,促炎細(xì)胞因子增多,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞,會(huì)產(chǎn)生更多的Aβ,進(jìn)而導(dǎo)致額外的神經(jīng)元損傷〔38〕。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)通路通過連接多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié),對(duì)于神經(jīng)發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶起著重要作用〔39〕。因此,結(jié)合分子對(duì)接和KEGG代謝通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),黑骨藤活性成分可能通過減少炎性因子分泌、激活神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白因子含量,發(fā)揮抗AD作用。

綜上,預(yù)測(cè)苗藥黑骨藤治療AD的活性成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路及發(fā)現(xiàn)黑骨藤可能是通過抗炎、激活神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路及增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白因子含量等方面治療AD,為黑骨藤抗AD藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的深入研究奠定了研究基礎(chǔ),后續(xù)尚需進(jìn)行體內(nèi)外藥效實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,為黑骨藤在臨床治療AD的應(yīng)用提供理論支撐。