基于UPLC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)研究淫羊藿-川芎對骨關(guān)節(jié)炎大鼠的調(diào)控作用

吳恩慧，章建華，張 琳，李清林，王 玲，尹 華*

? 藥理與臨床?

基于UPLC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)研究淫羊藿-川芎對骨關(guān)節(jié)炎大鼠的調(diào)控作用

吳恩慧1，章建華2，張 琳1，李清林1，王 玲1，尹 華1*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥標準化研究實驗室，浙江 杭州 311402 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨傷科，浙江 杭州 310006

基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）代謝組學(xué)技術(shù)探究骨關(guān)節(jié)炎大鼠的血漿代謝特征及淫羊藿-川芎配伍對骨關(guān)節(jié)炎大鼠代謝的調(diào)控作用。SD大鼠隨機分成正常組、假手術(shù)組、模型組、病理經(jīng)時評價組、淫羊藿組、川芎組、淫羊藿-川芎組（40 g/kg）、陽性藥物組（鹽酸氨基葡萄糖0.12 g/kg＋塞來昔布1.00 g/kg）。模型組、病理經(jīng)時評價組和各給藥組采用交叉韌帶-半月板損傷術(shù)建立骨關(guān)節(jié)炎模型，造模第6周各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，正常組、模型組給予等體積蒸餾水。采集0、2、4、6、8、10、12、14周大鼠血漿，通過病理組織學(xué)及血漿中基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）檢測結(jié)果評價藥效，UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析大鼠血漿代謝輪廓，并結(jié)合多元統(tǒng)計分析，檢測各組大鼠血漿代謝相關(guān)生物標志物的變化。造模4周后MMP-13水平明顯升高（＜0.01），給藥8周后顯著下降（＜0.01）。基于代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)給藥組大鼠血漿中2種潛在生物標志物發(fā)生明顯變化，分別為溶血磷脂酰膽堿（16∶0）、磷脂酰膽堿（18∶0/ 20∶4），主要涉及磷脂代謝通路。淫羊藿、川芎單用和兩者配伍均可回調(diào)差異代謝物治療骨關(guān)節(jié)炎大鼠，且配伍效果優(yōu)于單用。

淫羊藿-川芎；代謝組學(xué)；骨關(guān)節(jié)炎；藥對配伍；溶血磷脂酰膽堿（16∶0）；磷脂酰膽堿（18∶0/20∶4）；綠原酸；阿魏酸；淫羊藿苷；藁本內(nèi)酯

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要病變的慢性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)疼痛、滑膜炎癥和活動受限為主要表現(xiàn)[1]。目前化學(xué)藥治療以緩解疼痛、抗炎或改善功能狀態(tài)為主，但不良反應(yīng)明顯，不宜長期應(yīng)用，因此尚缺乏切實有效的治療手段和藥物[2]。中醫(yī)臨床多以“補腎活血”為治療準則[3]，常以出自《太平圣惠方》的補腎活血藥對淫羊藿-川芎配伍使用。淫羊藿補腎壯陽而治腎虛之根本，入肝腎祛風(fēng)濕強筋骨；川芎活血祛瘀、祛風(fēng)止痛治療血瘀氣滯[4-5]。

OA疾病發(fā)展過程及其治療與代謝密切相關(guān)，代謝組學(xué)的研究可用于發(fā)現(xiàn)疾病的發(fā)病機制及探究藥對干預(yù)下的調(diào)控機制[6-8]。研究表明，在OA發(fā)展過程中，軟骨細胞代謝發(fā)生改變，基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）參與軟骨的降解，滑膜細胞和軟骨細胞局部合成的促炎細胞因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）造成關(guān)節(jié)軟骨持續(xù)損傷[9-11]。藥理研究表明，淫羊藿可調(diào)節(jié)軟骨細胞代謝，促進軟骨基質(zhì)合成和細胞增殖[12-13]。川芎的有效成分可抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α、MMP-13的表達[14-15]。

淫羊藿-川芎對OA的作用機制尚不清楚，因此本研究基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）的代謝組學(xué)方法考察淫羊藿-川芎配伍及其單藥治療OA的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化及代謝輪廓，明確其發(fā)揮藥效的代謝調(diào)控通路。

1 材料

1.1 動物

清潔級SD大鼠66只，體質(zhì)量（190±10）g，雌雄各半，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2013-0018，使用許可證號SCXK（浙）2013-0184。溫度和相對濕度分別維持在（22±1）℃和（60±10）%。動物實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準（批準號ZSLL-2018-009）。

1.2 藥材

淫羊藿（批號141117）和川芎（批號140527）均購自華東醫(yī)藥股份有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張汝松教授分別鑒定為小檗科植物淫羊藿Maxim.的干燥葉、傘形科植物川芎Hort.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

塞來昔布膠囊（批號R55865）購自美國輝瑞制藥有限公司；鹽酸氨基葡萄糖膠囊（批號1504174）購自海南澳美華制藥有限公司；MMP-13 ELISA試劑盒（批號20151201A）購自杭州樂峰生物科技有限公司；色譜純甲醇和乙腈購自德國Merck公司；分析級乙酸（批號200903006）購自杭州化學(xué)試劑有限公司；水為超純水；青霉素（批號F4056202）購自華北制藥股份有限公司。

1.4 儀器

Waters Acquity UPLC、Waters Q-TOF-Premier（美國Waters公司）；DMI3000B型顯微鏡（德國Leica公司）；Power Wave 340型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；WH-866型渦旋震蕩器（華利達公司）；SENCOR系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；5804R型高速冷凍離心機、移液槍（德國Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 給藥溶液的制備

2.1.1 淫羊藿溶液的制備與分析 根據(jù)課題組前期研究確定最佳提取工藝進行藥液制備[16]，取淫羊藿飲片5000 g，置于多功能提取罐中，加12倍量50%乙醇，室溫浸泡1 h，加熱回流提取1 h，提取2次，合并藥液，濾過，濃縮成2 g生藥/mL的藥液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩饪s的藥液稀釋4倍，進樣檢測分析[17]。

2.1.2 川芎溶液的制備與分析 取川芎飲片5000 g，按“2.1.1”項下方法制備與分析。

2.1.3 淫羊藿-川芎溶液的制備與分析 取淫羊藿飲片和川芎飲片各2500 g，按“2.1.1”項下方法制備與分析。

2.2 動物分組、造模、給藥及取材

66只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機分為正常組（＝8）、假手術(shù)組（＝8）、模型組（＝8）、病理經(jīng)時評價組（＝10）、淫羊藿組（＝8）、川芎組（＝8）、淫羊藿-川芎組（＝8）、陽性藥物組（＝8）。除正常組和假手術(shù)組外，其余各組均采用交叉韌帶-半月板損傷術(shù)造模。假手術(shù)組切開關(guān)節(jié)囊，打開關(guān)節(jié)腔，不切斷前交叉韌帶和損傷半月板。術(shù)后所有手術(shù)大鼠im青霉素[40 000 U/(只·d)]。

造模6周后，各組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)8周。淫羊藿組、川芎組、淫羊藿-川芎組分別ig相應(yīng)給藥溶液（2 g生藥/mL），陽性藥物組ig鹽酸氨基葡萄糖（0.006 g/mL）和塞來昔布（0.05 g/mL），正常組和模型組ig等體積蒸餾水（20 mL/kg）。

病理經(jīng)時評價組于第0、2、4、6、8周隨機取2只大鼠，頸椎脫臼處死，其余各組大鼠于第14周處死。取關(guān)節(jié)軟骨，福爾馬林溶液中固定，EDTA脫鈣、脫水、石蠟固定包埋，切片，用于蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）和番紅O-固綠（safranin O/fast green staining，SO）染色。

2.3 樣品的采集與制備

于第0、2、4、6、8周，采集假手術(shù)組血液樣本，于第6、8、10、12、14周采集各給藥組血液樣本，于第0、2、4、6、8、10、12、14周正常組、模型組血液樣本置于抗凝管中，搖勻，4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離得到血漿，置?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，后續(xù)用于UPLC-Q-TOF-MS分析和ELISA檢測。

取血漿樣品，解凍至室溫，移取200 μL血漿樣品，加入600 μL乙腈。渦旋1 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液上機檢測。吸取各樣品上清液50 μL混合成質(zhì)控樣品。

2.4 色譜和質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件 Waters AcquityTMC18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為含0.1%醋酸的水溶液（A）-含0.1%醋酸的甲醇溶液（B），梯度洗脫：0～0.5 min，3% B；0.5～8 min，3%～80% B；8～16 min，80%～98% B；16～21 min，98% B；21～21.5 min，98%～100% B；21.5～24 min，100% B；24～25 min，100%～3% B；25～30 min，3% B。體積流量為300 μL/min；柱溫為35 ℃；進樣體積為5 μL；自動進樣器溫度為4 ℃。

2.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為40 V，碰撞電壓為10～60 V，離子源溫度為120 ℃，脫溶劑氣溫為350 ℃，脫溶劑氣體積流量為450 L/h，碰撞氣體為氬氣。掃描范圍/50～1000，掃描時間0.3 s，掃描間隔0.02 s。

TOF離子飛行方式采用“V”模式。使用0.5 ng/μL的亮氨酸-腦啡肽溶液進行相對分子質(zhì)量測定校正。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

2.5.1 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理 將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入MassLynx v4.1 and MarkerLynx 4.1軟件，經(jīng)過峰識別、峰對齊和歸一化等處理后，得到由保留時間、質(zhì)荷比和峰面積組成的數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA-P 12.0進行無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有監(jiān)督的正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。根據(jù)S-plot圖中的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1和獨立樣本檢驗的＜0.05，篩選差異代謝物作為潛在生物標志物。根據(jù)選取物質(zhì)精確的質(zhì)荷比，檢索HMDB（http://www.hmdb.ca/）和METLIN（http://metlin.scripps.edu）對代謝物進行匹配鑒定。將鑒定所得潛在生物標志物導(dǎo)入京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（http://www.kegg.ip），明確相關(guān)代謝途徑，并分析其調(diào)控作用。

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿、川芎及藥對的主要成分含量測定

淫羊藿有效成分綠原酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I，其質(zhì)量分數(shù)分別為0.618 0、1.480、1.968、2.283、4.494、0.840 0 mg/g。川芎有效成分綠原酸、藁本內(nèi)酯，其質(zhì)量分數(shù)分別為0.502 2、11.39 mg/g。淫羊藿-川芎中綠原酸、阿魏酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、藁本內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)分別為1.318、0.502 6、1.562、2.104、1.988、5.869、0.858 9、9.216 mg/g。

3.2 病理結(jié)果

3.2.1 OA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)經(jīng)時評價 如圖1所示，正常組及假手術(shù)組關(guān)節(jié)面光滑平整，顏色紅潤鮮艷，SO著色均勻，軟骨細胞排列整齊，四層結(jié)構(gòu)及潮線清晰可見。造模第2周模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨較正常組無明顯變化，僅在軟骨層表面有較小、淺的裂隙；第4周關(guān)節(jié)軟骨層變薄，表面粗糙，局部軟骨出現(xiàn)片狀脫落，部分軟骨基質(zhì)不著色；第6周關(guān)節(jié)軟骨層嚴重破壞，各層軟骨細胞簇集生長，排列紊亂；第8周病變加劇，可見軟骨細胞壞死，潮線更加不規(guī)則或完全消失，甚至可見軟骨下骨暴露。提示第6周OA模型建立成功。

3.2.2 淫羊藿-川芎對OA大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響 如圖2所示，正常組關(guān)節(jié)面光滑平整，顏色紅潤，軟骨細胞排列整齊，四層結(jié)構(gòu)及潮線清晰可見，SO著色均勻，顏色鮮艷。模型組關(guān)節(jié)軟骨層明顯變薄，軟骨部分脫落，軟骨細胞簇集，排列紊亂，潮線多不完整或完全消失，SO著色重度減弱，可見壞死崩解細胞，甚至可見軟骨下骨質(zhì)外露。各給藥組軟骨細胞排列有序，軟骨細胞聚集生長現(xiàn)象逐漸消失，軟骨層逐漸恢復(fù)。淫羊藿-川芎組和陽性藥物組關(guān)節(jié)軟骨層光滑，無明顯軟骨細胞聚集，SO著色均勻，但陽性藥物組軟骨細胞內(nèi)可見大量脂肪滴。淫羊藿組軟骨層表面有輕微裂縫，未見明顯軟骨脫落，軟骨細胞排列較為整齊，但存在細胞聚集；川芎組軟骨層薄且脫落明顯，淫羊藿組和川芎組均存在失染現(xiàn)象，但淫羊藿組較川芎組軟骨層厚，軟骨細胞簇集程度較弱。說明淫羊藿、川芎及其配伍、陽性藥物均對OA有治療作用。淫羊藿-川芎配伍治療效果與陽性藥物相似，較單用更佳。

圖2 給藥8周（14周）大鼠膝關(guān)節(jié)病理形態(tài)(×25)

3.3 MMP-13結(jié)果

3.3.1 OA模型大鼠血漿中MMP-13水平經(jīng)時評價 如表1所示，與正常組比較，假手術(shù)組MMP-13水平無明顯差異，模型組造模2周后MMP-13水平顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.3.2 單藥及配伍對OA大鼠血漿中MMP-13水平的影響 各給藥組于第12、14周的MMP-13水平較同時期模型組有顯著性差異（＜0.01）。淫羊藿-川芎組和陽性藥物組血漿中MMP-13水平顯著低于淫羊藿組和川芎組（＜0.05、0.01）。說明陽性藥物組、淫羊藿、川芎與淫羊藿-川芎均有治療OA的作用，且配伍使用效果較好。

3.4 代謝組學(xué)分析

3.4.1 OA大鼠模型代謝組學(xué)分析 各組大鼠0～8周血漿代謝動態(tài)反映了OA的發(fā)展，如圖3所示，第0、2周，3組血漿樣本代謝無明顯變化，第4、6、8周，3組樣本均呈現(xiàn)分離趨勢，假手術(shù)組的趨勢更接近模型組。正常組大鼠未進行任何手術(shù)，6周的代謝變化只反映了大鼠正常衰老的情況；而假手術(shù)組模仿OA模型組大鼠實施了手術(shù)，體現(xiàn)了創(chuàng)傷對機體內(nèi)源性成分的影響，其代謝變化由大鼠正常衰老和手術(shù)創(chuàng)傷共同作用產(chǎn)生。因此，在進行OA代謝組學(xué)研究時，以假手術(shù)組作為空白對照組更為合理。

表1 各組大鼠各時段血漿中MMP-13水平變化(, n = 6)

與正常組比較：*＜0.05**＜0.01；與假手術(shù)組比較：△△＜0.01；與模型組比較：▲＜0.05▲▲＜0.01；與陽性藥物（鹽酸氨基葡萄糖＋塞來昔布）組比較：#＜0.05##＜0.01；與淫羊藿-川芎組比較：^＜0.05^^＜0.01；與淫羊藿組比較：?＜0.05??＜0.01；與川芎組比較：◆＜0.05◆◆＜0.01

*< 0.05**< 0.01normal group;△△< 0.01sham group;▲< 0.05▲▲< 0.01model group;#< 0.05##＜0.01positive drug (glucosamine hydrochloride + celebrex) group;^< 0.05^^< 0.01-group;?< 0.05??< 0.01group;◆< 0.05◆◆< 0.01group

圖3 各組大鼠0～8周血漿代謝PCA得分圖

如圖4所示，正常組呈現(xiàn)一定的代謝變化趨勢，可能是大鼠正常衰老的生理變化。假手術(shù)組較正常大鼠0～2周分離趨勢較明顯，4～8周變化趨于緩和，可能與手術(shù)創(chuàng)傷及機體自身修復(fù)有關(guān)。模型組造模前后樣本分離明顯，隨著時間的推移，第4～8周呈現(xiàn)有規(guī)律的分離，OA大鼠內(nèi)源性代謝產(chǎn)物較正常組有明顯變化。第4～6周變化最明顯，第6～8周趨于穩(wěn)定，說明第6周OA模型建立成功。

為了使組間差異最大化，消除組內(nèi)變異對分類的負面影響，建立模型組和假手術(shù)組的OPLS-DA模型（圖5），模型組和假手術(shù)組能明顯分開，兩者在代謝產(chǎn)物方面具有明顯差異。在200次迭代中應(yīng)用排列檢驗，說明沒有過擬合。

A-正常組 B-假手術(shù)組 C-模型組

A-OPLS-DA得分圖 B-S-plot圖 C-模型驗證圖

3.4.2 給藥組大鼠代謝組學(xué)分析 如圖6-A～H所示，各給藥組于第10～14周與模型組達到分離，并逐漸向正常組靠攏，在第14周趨勢最為明顯。說明各給藥組均可調(diào)控其向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變，其中淫羊藿-川芎組和陽性藥物組調(diào)控作用明顯優(yōu)于單藥。各給藥組OPLS-DA圖（圖6-I、J）顯示，淫羊藿-川芎和陽性藥物組療效優(yōu)于淫羊藿和川芎單藥，進行了模型驗證，顯示2截距小于0，未過擬合，模型可靠，初步闡明“補腎活血”法治療OA的科學(xué)性。

3.5 血漿潛在生物標志物的篩選

結(jié)合OPLS-DA模型的VIP值及＜0.05篩選出OA模型中69種差異表達代謝物。通過建立第8周和第14周各給藥組樣本的S-plot圖，從淫羊藿組、川芎組、淫羊藿-川芎組和陽性藥物組中篩選出16種差異表達代謝物，鑒定出2個潛在的生物標志物（表1和圖7）。Lyso PC（16∶0）水平下調(diào)，該生物標志物僅受淫羊藿-川芎的調(diào)控，提示淫羊藿與川芎聯(lián)合用藥可能增強對OA代謝物的調(diào)控。

A、B-正常、模型和淫羊藿組的PLS-DA得分圖及其S-plot圖 C、D-正常、模型和川芎組的PLS-DA得分圖及其S-plot圖 E、F-正常、模型和淫羊藿-川芎組的PLS-DA得分圖及其S-plot圖 G、H-正常、模型和陽性藥物組的PLS-DA得分圖及其S-plot圖 I、J-給藥8周血漿代謝物OPLS-DA得分圖及其模型驗證圖

表1 差異代謝物含量變化情況

LysoPC-溶血磷脂酰膽堿 PC-磷脂酰膽堿

LysoPC-lysophosphatidyl choline PC-phosphatidyl choline

與正常組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.6 血漿的代謝通路分析

潛在的生物標志物屬于甘油磷脂，如LysoPC、PC，與磷脂代謝通路相關(guān)，代謝途徑可能為OA的發(fā)病機制及淫羊藿-川芎對OA大鼠作用機制提供依據(jù)。

4 討論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)經(jīng)時評價OA造模過程中血漿內(nèi)源性代謝物和MMP-13水平的動態(tài)變化，直觀揭示了OA大鼠模型在代謝層面的發(fā)病軌跡，有助于為OA的早期診斷提供依據(jù)。研究了淫羊藿-川芎配伍對OA大鼠代謝的調(diào)控作用，給藥后各組代謝輪廓變化及回調(diào)，其結(jié)果與組織病理學(xué)和MMP-13評價的藥效作用一致，證明了其配伍治療OA的合理性。初步獲得2個生物標志物，分別為LysoPC（16∶0）和PC（18∶0/20∶4），與磷脂代謝通路相關(guān)。

課題組前期考察淫羊藿-川芎不同配比（1∶1、1∶2、2∶1）對OA大鼠的藥效作用，病理組織學(xué)（HE、SO染色），MMP-13、IL-1β檢測結(jié)果表明淫羊藿、川芎以1:1配伍使對OA大鼠的藥效作用最佳。故選擇淫羊藿-川芎（1∶1）研究其配伍機制。

經(jīng)時評價OA造模過程中，第6周OA模型建立，第8周OA病變進一步加重。一般藥物干預(yù)主要對早期和中期OA有效。為體現(xiàn)OA早期診斷、早期治療的理念，本研究選擇造模后6周進行藥物干預(yù)研究。隨著造模時間的延長，模型組大鼠血漿中MMP-13表達水平逐步升高，提示可將MMP-13的表達水平作為評價OA模型建立的一個評價指標。給藥后，各給藥組血漿中MMP-13水平隨給藥時間的延長而逐步降低，提示MMP-13水平可用于療效評價。

本研究初步獲得2個生物標志物，分別為LysoPC（16：0）和PC（18∶0/20∶4），LysoPCs和PCs是脂質(zhì)雙分子層的組成部分，可以調(diào)節(jié)跨膜信號傳導(dǎo)[18]。OA與磷脂的結(jié)構(gòu)和濃度的變化密切相關(guān)。PCs的缺乏，特別是含有長鏈脂肪酸的不飽和PCs，可能會增加摩擦并導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷[19]。PCs可通過磷脂酶A2（PLA2）水解生成LysoPCs，而OA軟骨細胞中PLA2的高表達可促進IL-1β、TNF等炎性因子的表達[20-21]。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，LysoPCs與PCs的比率可用于預(yù)測OA，與正常人相比，OA患者血漿中LysoPCs水平較高，PCs水平較低。氧化應(yīng)激反應(yīng)也可導(dǎo)致OA，當(dāng)活性氧存在時，可以促使PCs轉(zhuǎn)化為LysoPCs[23]。OA軟骨細胞、滑膜成纖維細胞和脂肪細胞均可產(chǎn)生造成機械、生化刺激的活性氧和一氧化氮。中性粒細胞可以通過釋放蛋白水解酶混合物以結(jié)合活性氧，導(dǎo)致軟骨組織破壞[24-26]。

本研究從代謝組學(xué)層面初步揭示淫羊藿-川芎對OA大鼠的作用機制，證明其配伍合理性，動態(tài)監(jiān)測OA進展和淫羊藿-川芎治療情況的結(jié)果，為探索中醫(yī)藥治療OA代謝組學(xué)的潛在療效和機制提供了更有效的途徑。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects ofRhizoma on osteoarthritic rats based on UPLC-Q-TOF-MS metabonomics

WU En-hui1, ZHANG Jian-hua2, ZHANG Lin1, LI Qing-lin1, WANG Ling1, YIN Hua1

1. Research Laboratory for Standardization of Chinese Medicines Research Laboratory, School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311402, China 2. Department of Osteopathy and Traumatology, the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China

To investigate the plasma metabolic profile of rats with osteoarthritis (OA) and regulatory effects of Yinyanghuo ()-Chuanxiong () on metabolism of osteoarthritic rats based on ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) metabonomics technology.SD rats were randomly divided into normal group, sham group, model group, pathological evaluation group during the process of OA modeling,group,group,-group (40 g/kg), and positive drug group (glucosamine hydrochloride 0.12 g/kg + celebrex 1.00 g/kg). Osteoarthritis model was established by cruciate ligament-meniscus injury surgery in model group, pathological time evaluation group and administration groups, and corresponding drug interventions were given to each drug administration group at 6th week of modelling. Equal amount of distilled water was given to the normal and model groups. Plasma was collected from rats at 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 and 14 weeks. The drug efficacy was evaluated by pathological histology and the results of matrix metalloproteinase-13 (MMP-13) assay. The plasma metabolic profiles of rats were analyzed by UPLC-Q-TOF-MS technology, and changes in plasma metabolism-related biomarkers were detected by combining with multivariate statistical analyses in each group.The level of MMP-13 was increased after four weeks of modelling (< 0.01) and decreased significantly after eight weeks of drug administration (< 0.01). Based on metabonomics, two potential biomarkers were found to be significantly changed in the plasma of rats in administration group, namely lysophosphatidylcholine (16∶0) and phosphatidylcholine (18∶0/20∶4), which were mainly involved in phospholipid metabolic pathway.andalone and the combination can reverse the differential metabolites for the treatment of osteoarthritis in rats, and the combination is more effective than the single use.

-; metabonomics; osteoarthritis; drug pair compatibility;lysophosphatidylcholine (16∶0); phosphatidylcholine (18∶0/ 20∶4); chlorogenic acid; ferulic acid; icariin; ligustilide

R285.5

A

0253 - 2670(2023)22 - 7445 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.021

2023-07-31

國家自然科學(xué)基金面上項目（81874340）；浙江省科技廳公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目（2014C33216）

吳恩慧（1999—），女，碩士研究生，研究方向為中藥分析及新藥研發(fā)。Tel: 17326083487 E-mail: weh_grace@163.com

通信作者：尹 華，教授，從事中藥分析及新藥研發(fā)研究。Tel: (0571)61768172 E-mail: maryyinhua@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]