絲沉香中2個(gè)α-葡萄糖苷酶抑制活性的2-(2-苯乙基)色酮二聚體

韋 媛，董文化，李 薇，曾 軍，陳惠琴，袁靖喆，梅文莉，戴好富，王 昊*，郭志勇

絲沉香中2個(gè)α-葡萄糖苷酶抑制活性的2-(2-苯乙基)色酮二聚體

韋 媛1, 2，董文化2，李 薇2，曾 軍2，陳惠琴2，袁靖喆2，梅文莉2，戴好富2，王 昊2*，郭志勇1*

1. 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002 2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省沉香工程技術(shù)研究中心，沉香國(guó)際聯(lián)合研究中心，海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101

研究菲律賓產(chǎn)絲沉香的化學(xué)成分。采用硅膠、凝膠、半制備高效液相色譜等多種色譜技術(shù)分離絲沉香的化學(xué)成分，通過高分辨質(zhì)譜、核磁共振等波譜學(xué)方法鑒定化合物結(jié)構(gòu)，采用改進(jìn)后的4-硝基苯基-β--吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β--glucopyranoside，pNPG）法測(cè)試化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。從菲律賓產(chǎn)絲沉香中分離鑒定了2個(gè)2-(2-苯乙基)色酮二聚體，分別為aquifilarone N（1）和diaquilariachrome B（2）?；衔?和2均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值分別為（14.33±0.38）μmol/L和（39.53±2.09）μmol/L?；衔?為新化合物，化合物2為首次從絲沉香中分離得到。

絲沉香；沉香；2-(2-苯乙基)色酮二聚體；α-葡萄糖苷酶抑制活性；aquifilarone N；diaquilariachrome B

沉香為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬Lam. 或擬沉香屬Gaertn. 植物含有樹脂的木材。作為傳統(tǒng)名貴藥材，沉香主要用于治療胸腹脹悶疼痛、嘔吐呃逆、氣逆喘急等癥[1]，還可治療精神疾病，如神經(jīng)官能癥、神經(jīng)分裂癥和神經(jīng)衰弱[2]。此外，沉香還是天然香料，位列“沉檀龍麝”四大名香之首，被稱為“香料之王”，在香文化、日化等領(lǐng)域廣泛使用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，沉香主要含有倍半萜類和2-(2-苯乙基)色酮類化合物[3]，此類化合物具有抗炎、細(xì)胞毒、α-葡萄糖苷酶抑制、乙酰膽堿酯酶抑制、神經(jīng)保護(hù)等生物活性[3-7]。其中，2-(2-苯乙基)色酮類化合物是沉香真?zhèn)舞b定和品質(zhì)評(píng)價(jià)的關(guān)鍵成分[1]。據(jù)中國(guó)瀕危物種進(jìn)出口管理辦公室數(shù)據(jù)顯示絲沉香為四大沉香進(jìn)口品種之一[8]。絲沉香(Oken) Merr.主要分布于印度尼西亞、巴布亞新幾內(nèi)亞、菲律賓、馬魯古群島[9-10]。作為沉香貿(mào)易的重要組成部分，關(guān)于絲沉香中化學(xué)成分的報(bào)道屈指可數(shù)，對(duì)其鑒定與應(yīng)用也缺乏科學(xué)指導(dǎo)[7,11-15]。本課題組首先系統(tǒng)研究了印度尼西亞產(chǎn)絲沉香的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)5,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮衍生物豐富，且具有顯著的抗炎活性[7,14]。另外，也從菲律賓產(chǎn)絲沉香中發(fā)現(xiàn)一系列結(jié)構(gòu)新穎且有抗炎活性的2-(2-苯乙基)色酮二聚體，聚合方式與印度尼西亞產(chǎn)絲沉香中2-(2-苯乙基)色酮二聚體的結(jié)構(gòu)存在一定差異，尚未發(fā)現(xiàn)5,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮衍生物[5]。本課題繼續(xù)對(duì)菲律賓產(chǎn)絲沉香的乙醇提取物醋酸乙酯相進(jìn)行分離純化，得到2個(gè)2-(2-苯乙基)色酮二聚體（圖1），分別為aquifilarone N（1）和diaquilariachrome B（2）。其中化合物1為新化合物，化合物2首次從菲律賓產(chǎn)絲沉香中分離得到?；衔?和2均具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖1 菲律賓產(chǎn)絲沉香中2-(2-苯乙基)色酮二聚體

1 儀器與材料

安捷倫1260分析型高效液相色譜儀和安捷倫1260半制備型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Cosmosil 5PFP色譜柱（250.0 mm×10.0 mm，5 μm，Nacalai tesque公司）；Cosmosil πNAP色譜柱（250.0 mm×10.0 mm，5 μm，Nacalai tesque公司）；布魯克AV-500型超導(dǎo)核磁儀（德國(guó)布魯克公司）；沃特世Xevo G2-XS QTof質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世科技有限公司）；旋光儀MCP 5100（奧地利Anton Paar有限公司）；圓二色譜儀MOS-500（法國(guó)Biologic公司）；CA-1111型冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph Laborota）；Mettler Toledo ME204精密分析天平[萬分之一，梅特勒-托力多儀器（上海）公司]；ELX-800 酶標(biāo)儀（美國(guó)寶特公司）；薄層色譜硅膠板G和柱色譜硅膠G、H（200～300、60～80目，青島海洋化工廠）；ODS（20～45 μm，日本Fuji公司）；凝膠Sephadex LH-20（德國(guó)Merck公司）；色譜級(jí)甲醇（批號(hào)221121）購(gòu)于康科德科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（批號(hào)6052006）購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；阿卡波糖（批號(hào)W12J9B52561）購(gòu)于青島騰龍微波科技有限公司；金雀異黃酮（批號(hào)C11903909）購(gòu)于Macklin公司；4-硝基苯基-β--吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl- β--glucopyranoside，pNPG，批號(hào)K22J9B64113）購(gòu)于源葉生物公司。

菲律賓產(chǎn)絲沉香樣品購(gòu)于海南省?？谑?，經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所戴好富研究員鑒定其基原植物為絲沉香(Oken) Merr.，憑證標(biāo)本（FLBS20200710）保存在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

2 提取與分離

將干燥的絲沉香樣品（817.0 g）粉碎后經(jīng)95%乙醇（5.0 L）回流提取5次，減壓濃縮得到浸膏（180.4 g）。乙醇提取物均勻分散于去離子水中，用石油醚（3.5 L×3）、醋酸乙酯（3.5 L×3）和正丁醇（3.5 L×3）依次進(jìn)行萃取，即得石油醚相7.4 g、醋酸乙酯相81.7 g和正丁醇相85.2 g。醋酸乙酯相經(jīng)減壓硅膠柱色譜（9 cm×25 cm），以氯仿-甲醇（100∶1→0∶1）梯度洗脫后，根據(jù)TLC和HPLC分析合并得到14個(gè)流分（Fr. 1～14）。Fr. 12（17.8 g）在ODS柱上通過甲醇-水溶液（40%～100%）加壓洗脫，所得洗脫液濃縮后經(jīng)過TLC和HPLC分析合并得到20個(gè)流分（Fr. 12.1～12.20）。Fr. 12.6（232.8 mg）經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）得到3個(gè)流分（Fr. 12.6.1～12.6.3），F(xiàn)r. 12.6.2（96.3 mg）經(jīng)半制備型HPLC（πNAP柱，甲醇-水65∶35）柱色譜后得到3流分（Fr. 12.6.2.1～12.6.2.3），F(xiàn)r. 12.6.2.2（37.8 mg）再經(jīng)半制備型HPLC（5PFP柱，甲醇-水50∶50）獲得化合物1（3.7 mg，R＝25.0 min）。Fr. 12.9（532.8 mg）經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）得到3個(gè)流分（Fr. 12.9.1～12.9.3），F(xiàn)r. 12.9.2（48.9 mg）經(jīng)半制備型HPLC（πNAP柱，甲醇-水65∶35）分離得化合物2（8.0 mg，R＝50.0 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1的1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)和DEPTQ (125 MHz, DMSO-d6)數(shù)據(jù)

圖2 化合物1的關(guān)鍵2D NMR信號(hào)

綜合分析化合物1的一維和二維核磁數(shù)據(jù)，化合物1中Unit A和Unit B的結(jié)構(gòu)分別與aquilarone D[16]和6,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮[17]一致，共20個(gè)不飽和度，不含有其他環(huán)。由HMBC上H-8到C-8的遠(yuǎn)程相關(guān)，ROESY上H-8到H-7的NOE效應(yīng)，確定Unit A與Unit B是通過C8--C8連接?；衔?的相對(duì)構(gòu)型通過偶合常數(shù)和NOE效應(yīng)確定。H-5/H-8的偶合常數(shù)[35,6(6.8 Hz)、36,7(9.0 Hz)和37,8(7.2 Hz)] 表明以上4個(gè)氫原子均位于假直立鍵，且H-5/H-6、H-6/H-7、H-7/H-8為反式構(gòu)型。ROESY上H-5/H-7和H-6/H-8的NOE效應(yīng)進(jìn)一步證明以上推斷，該化合物的相對(duì)構(gòu)型與crassin B[6]一致（圖2）?；衔?的CD圖譜中Cotton效應(yīng)[243 (?9.7), 210 (＋9.7) nm]與crassin B [236 (?12.65), 214 (＋9.88) nm]的一致，表明該化合物與crassin B的絕對(duì)構(gòu)型相同，為5,6,7,8。命名為aquifilarone N。

4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)試

α-葡萄糖苷酶抑制劑能選擇性的作用于小腸黏膜刷狀緣上的葡萄糖苷酶，抑制多糖及蔗糖分解成葡萄糖，延緩碳水化合物的分解，減少葡萄糖的吸收。

采用改進(jìn)后的pNPG法[21-24]測(cè)試化合物1和2的α-葡萄糖苷酶抑制活性。α-葡萄糖苷酶用0.1 mol/L pH 6.8的PBS稀釋成0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液。取65 μL的待測(cè)溶液加入650 μL的α-葡萄糖苷酶溶液，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組待測(cè)溶液為DMSO，搖勻后，取110 μL于96孔板中（4次重復(fù)），因以上2個(gè)化合物顏色為黃色，需除去本底吸收，多做2組平行。將96孔板于37 ℃放置15 min后，化合物組與陰性對(duì)照組加入40 μL的2.5 mmol/L pNPG溶液；空白對(duì)照組與化合物本底組加入40 μL 0.1 mol/L PBS溶液。將96孔板于37 ℃放置15 min后，在405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔的吸光度（）值。以阿卡波糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95.0%）、金雀異黃酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.0%）為陽性對(duì)照。并按照公式計(jì)算抑制率。

抑制率＝[(DMSO－PBS)－(樣品－本底)]/(DMSO－PBS)

DMSO為陰性對(duì)照組的值，PBS為空白對(duì)照組的值，樣品為化合物組的值，本底為化合物本底組的平均值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物1和2均具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為（14.33±0.38） μmol/L和（39.53±2.09）μmol/L。陽性對(duì)照阿卡波糖和金雀異黃酮的IC50分別為（1 147.05±185.87）μmol/L和（30.57±1.07）μmol/L。

5 討論

沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物結(jié)構(gòu)類型豐富，其中2-(2-苯乙基)色酮二聚體的單體結(jié)構(gòu)類型和聚合方式多樣，國(guó)產(chǎn)沉香、柯拉斯那沉香、絲沉香等不同來源沉香中2-(2-苯乙基)色酮二聚體結(jié)構(gòu)和相對(duì)含量存在差異，可為沉香的鑒別提供依據(jù)[3-7]。本研究利用多種現(xiàn)代色譜和波譜學(xué)技術(shù)從菲律賓產(chǎn)絲沉香中分離鑒定2個(gè)2-(2-苯乙基)色酮二聚體aquifilarone N（1）和diaquilariachrome B（2），2個(gè)化合物都為5,6,7,8-四氫-2-(2-苯乙基)色酮與flindersia型2-(2-苯乙基)色酮通過C8--C8''連接的二聚體。然而，文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)化合物2曾被錯(cuò)誤鑒定為AH15[18]?；衔?和2對(duì)α-葡萄糖苷酶都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的體外抑制活性，IC50值分別為（14.33±0.38）μmol/L和（39.53±2.09）μmol/L。以上結(jié)果豐富了絲沉香的化學(xué)成分及α-葡萄糖苷酶抑制活性化合物，為絲沉香鑒定技術(shù)體系的建立提供了科學(xué)依據(jù)，也為絲沉香資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Two 2-(2-phenylethyl) chromone dimers with α-glucosidase inhibitory activity from agarwood of

WEI Yuan1, 2, DONG Wen-hua2, LI Wei2, ZENG Jun2, CHEN Hui-qin2, YUAN Jing-zhe2, MEI Wen-li2, DAI Hao-fu2, WANG Hao2, GUO Zhi-yong1

1. Hubei Key Laboratory of Natural Product Research and Development, College of Biological and Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002, China 2. Hainan Engineering Research Center of Agarwood, International Joint Research Center of Agarwood, Hainan Key Laboratory of Natural Products Research and Development of Li Folk Medicine, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China

To investigate the chemical constituents of agarwood offrom Philippines.All compounds were isolated by using various chromatographic techniques, including silica gel, Sephadex LH-20, semi-preparative high performance liquid chromatography. Their structures were elucidated based on modern spectroscopic methods, such as high-resolution mass spectrometry (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NMR). The α-glucosidase inhibition assay was performed by modified pNPG (4-nitrophenyl β--glucopyranoside) method.Two 2-(2-phenylethyl) chromone dimers were isolated from agarwood of, and identified as aquifilarone N (1) and diaquilariachrome B (2). Compounds 1 and 2 exhibited α-glucosidase inhibitory activities, with IC50values of (14.33 ± 0.38）μmol/L and (39.53 ± 2.09) μmol/L, respectively.Compound 1 is a new compound, and compound 2 is isolated fromfor the first time.

(Oken) Merr.; agarwood; 2-(2-phenylethyl) chromone dimer; α-glucosidase inhibitory activity; aquifilarone N; diaquilariachrome B

R284.1

A

0253 - 2670(2023)22 - 7336 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.010

2023-07-21

海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目（ZDKJ2021031）；財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-21）；海南省自然科學(xué)基金高層次人才項(xiàng)目（320RC714）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1630052023006）

韋 媛（1998—），女，壯族，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail: weiyuannpc@126.com

通信作者：郭志勇（1975—），男，教授，從事藥用植物及其內(nèi)生菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物研究。E-mail: zhyguoctgu@foxmail.com

王 昊（1990—），男，助理研究員，從事熱帶藥用植物活性次生代謝產(chǎn)物研究。E-mail: wanghao@itbb.org.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]