巴迪泰（廣西）C1500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血漿D- 二聚體的性能評(píng)估

韋嬪（通信作者），梁亞運(yùn)，陸建偉，李康，莊子檳，李登紅，王洪濤

1 巴迪泰（廣西）生物科技有限公司 （廣西南寧 530031）；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 （廣西南寧 530022）

D-二聚體臨床主要用于診斷肺栓塞和深靜脈血栓[1-5]，對(duì)彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intr-avascular coagulation，DIC）、惡性腫瘤、腦血管疾病和肝臟疾病等也具有重要診斷意義[6-9]。巴迪泰（廣西）生物科技有限公司采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)血漿中的D-二聚體，16.8 min 即可得到結(jié)果，為保證結(jié)果的可靠性，本研究使用巴迪泰（廣西）C1500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套的試劑和校準(zhǔn)品、質(zhì)控品進(jìn)行關(guān)鍵性能驗(yàn)證，對(duì)精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、空白限、抗干擾進(jìn)行驗(yàn)證[10-11]，同時(shí)與思塔高的STA Compact Max凝血分析儀的臨床樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

選取廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2022 年11—12 月心血管內(nèi)科的75 例枸櫞酸鈉抗凝血漿樣本為研究對(duì)象。采用巴迪泰（廣西）C1500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，原裝配套的D-二聚體試劑，D-二聚體質(zhì)控品，D-二聚體校準(zhǔn)品，試劑均在有效期內(nèi)。思塔高STA Compact Max 凝血分析儀，原裝配套的D-二聚體試劑，試劑均在有效期內(nèi)。

1.1 方法

采用巴迪泰（廣西）C1500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套的試劑和校準(zhǔn)品質(zhì)控品進(jìn)行精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、空白限和抗干擾的評(píng)估；同時(shí)選取廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2022 年11—12 月心血管內(nèi)科的75 例經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝的靜脈血漿樣本，采用巴迪泰C1500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)樣本中的D-二聚體，并與思塔高STA Compact Max 凝血分析儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證，具體如下。

1.1.1 批內(nèi)精密度驗(yàn)證

根據(jù)相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10]，取正常和異常濃度水平的質(zhì)控品，按常規(guī)方法重復(fù)檢測(cè)10 次，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，按以下公式計(jì)算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），若正常和異常質(zhì)控的CV不大于10.0%，則驗(yàn)證通過(guò)。CV=SD/M×100%式中，SD為10 次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差，M為10 次測(cè)量結(jié)果的平均值。

1.1.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證

將1 ml D-二聚體人源陰性血漿樣本平均分為3 份，并標(biāo)記為1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)樣本。在2 號(hào)樣本中加入0.1 ml 的3.65 μg/ml 的DD 標(biāo)準(zhǔn)液，混勻制備成待回收分析樣本1；在3 號(hào)樣本中加入0.1 ml的35.23 μg/ml 的DD 標(biāo)準(zhǔn)液，混勻制備成待回收分析樣本2。在1 號(hào)樣本中同樣加入0.1 ml 的無(wú)待測(cè)物的人源陰性血漿 （廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院）作為基礎(chǔ)樣本。用C1500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑對(duì)待回收分析樣本和基礎(chǔ)樣本分別進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣本測(cè)試3 次并計(jì)算平均值，然后按以下公式計(jì)算回收率，如果回收率為[85.0%，115.0%]，則驗(yàn)證通過(guò)。加入濃度n=標(biāo)準(zhǔn)液濃度n×[標(biāo)準(zhǔn)液加入體積/（樣本體積+標(biāo)準(zhǔn)液體積）]。式1：A=（B-C）/D×100%；其中，A 為回收率n，B 為測(cè)定待回收分析樣本濃度均值n，C 為測(cè)定基礎(chǔ)樣本濃度均值；D 為加入濃度n。式2：A1=（B1+B2+…+Bn）/C×100%，其中，A1為平均回收率，B 為回收率n，C 為回收率測(cè)試樣本總數(shù)。

1.1.3 線性范圍驗(yàn)證

根據(jù)相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和文件[10-11]，取1 份D-二聚體值接近線性范圍上限的血漿作為高值（H）樣本（20.64 μg/ml）和1 份接近線性范圍下限的血漿作為低值（L）樣本（0.11 μg/ml），按4L、3L+1H、2L+2H、1L+3H 和4H 的比例配制5 份標(biāo)本，將標(biāo)本按濃度由低到高，再由高到低進(jìn)行測(cè)試，2 次測(cè)試結(jié)果的平均值即為實(shí)測(cè)值。按稀釋比例計(jì)算各樣本的理論值，再按以下公式對(duì)實(shí)測(cè)值和理論值進(jìn)行回歸分析，若線性回歸方程的斜率K在1±0.05 范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r≥0.975，且稀釋后標(biāo)本實(shí)際測(cè)試值與其理論值百分偏差≤15%，則驗(yàn)證通過(guò)[10]。

式中X 為測(cè)定的濃度均值，Y 為與測(cè)定濃度相對(duì)應(yīng)的理論濃度。

1.1.4 空白限驗(yàn)證

重復(fù)測(cè)定零濃度校準(zhǔn)品20 次，得出20 次測(cè)定的相對(duì)發(fā)光單位（RLU），計(jì)算RLU 值的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，得出（M+2SD）對(duì)應(yīng)的RLU 值。同時(shí)測(cè)定相鄰濃度的校準(zhǔn)品（主校準(zhǔn)品S1），重復(fù)測(cè)試3 次，計(jì)算3 次測(cè)試結(jié)果的均值M，先將零濃度與相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度-RLU 值進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，再將（M+2SD）的RLU 值帶入進(jìn)行計(jì)算，得出對(duì)應(yīng)的濃度，就是空白限的值。

1.1.5 抗干擾驗(yàn)證

選用線性范圍內(nèi)的低、高濃度血漿樣本作為基質(zhì)樣本，各測(cè)試3 次，計(jì)算平均值；再將其分為4 份，其中3 份分別添加不同濃度的干擾物質(zhì)（血紅蛋白、膽紅素、三酰甘油）。分別測(cè)試3 次，計(jì)算平均值。若測(cè)定結(jié)果均值介于基質(zhì)樣本 ±10.0%范圍內(nèi)，則判為無(wú)顯著干擾。若測(cè)定結(jié)果均值超出規(guī)定范圍，則判為存在顯著干擾。按以下計(jì)算方式計(jì)算添加干擾物后測(cè)值與未添加樣本測(cè)值的偏差。偏差=（加入干擾物結(jié)果-未加干擾物樣本結(jié)果）/未加干擾物樣本結(jié)果×100%。

1.1.6 臨床樣本相關(guān)性驗(yàn)證

隨機(jī)選取廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2022年11—12 月心血管內(nèi)科的75 例經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝的靜脈血漿樣本，采用巴迪泰C1500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)樣本中的D-二聚體水平，并與醫(yī)院采用思塔高STA Compact Max 凝血分析儀檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證，若r＞0.975，則認(rèn)為2 種檢測(cè)方法相關(guān)性較好。

2 結(jié)果

2.1 批內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果

正常和異常濃度水平質(zhì)控品重復(fù)性驗(yàn)證CV分別為4.04 %和2.96 %，驗(yàn)證通過(guò)，性能滿(mǎn)足要求，見(jiàn)表1。

表1 批內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果（μg/ml）

2.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

兩個(gè)分析樣本的回收率分別為104.57%和101.10%，平均回收率為102.83%，均在[85.0%，115.0%]范圍內(nèi)，準(zhǔn)確度驗(yàn)證通過(guò)，見(jiàn)表2。

表2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果（μg/ml）

2.3 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果

以理論值為橫坐標(biāo)，實(shí)測(cè)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸分析，D-二聚體水平為0.11～20.64 μg/ml，線性范圍良好，R2=0.9991，r=0.99953，相關(guān)方程為y=0.9588x+0.0613，斜率K為0.9588，實(shí)測(cè)值與理論值的百分偏差均小于15%，故驗(yàn)證的線性范圍為0.11～20.64 μg/ml，滿(mǎn)足廠家說(shuō)明書(shū)要求，驗(yàn)證通過(guò)，見(jiàn)表3 和圖1。

圖1 線性驗(yàn)證結(jié)果

表3 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果

2.4 空白限驗(yàn)證結(jié)果

空白限驗(yàn)證結(jié)果為0.002 μg/ml，符合產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)對(duì)空白限不高于0.100 μg/ml 的規(guī)定，驗(yàn)證通過(guò)，見(jiàn)表4。

表4 空白限驗(yàn)證結(jié)果

2.5 抗干擾驗(yàn)證結(jié)果

高低濃度樣本中膽紅素≤40 mg/dL、血紅蛋白≤150 mg/dL、三酰甘油≤1 000 mg/dL 時(shí)，與未添加組的偏差均在±10.0 %范圍內(nèi)，因此膽紅素≤40 mg/dL、血紅蛋白≤150 mg/dL、三酰甘油≤1 000 mg/dL 對(duì)D-二聚體測(cè)試結(jié)果無(wú)顯著干擾，見(jiàn)表5。

2.6 臨床樣本相關(guān)性驗(yàn)證結(jié)果

巴迪泰（廣西）D-二聚體檢測(cè)試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）與思塔高D-二聚體定量檢測(cè)試劑盒（免疫比濁法）測(cè)試75 例枸櫞酸鈉抗凝血漿結(jié)果的一元線性回歸方程為y=0.9158x-0.1529，r=0.9925 ＞0.975，2 種檢測(cè)方法相關(guān)性較好，如圖2 所示。

圖2 兩種檢測(cè)方法結(jié)果的線性相關(guān)圖

3 討論

血液中D-二聚體水平檢測(cè)方法包括膠體金免疫滲透法、乳膠凝集法、酶聯(lián)免疫法、免疫比濁法、免疫熒光法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。膠體金免疫滲透法和膠乳凝集法由于為定性或半定量檢測(cè)，結(jié)果差異較大，且不適用于大批量檢測(cè)，目前已逐漸被淘汰；酶聯(lián)免疫法操作復(fù)雜且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)；免疫熒光法易受本底熒光干擾而精密度不高；免疫比濁法易受黃疸、乳糜等樣本干擾，這些局限性導(dǎo)致這些方法臨床使用受限[12-14]?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法靈敏度高、線性范圍寬，可自動(dòng)化批量分析，已廣泛應(yīng)用于臨床。

巴迪泰（廣西）采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析夾心法，使用堿性磷酸酶和生物素標(biāo)記D-二聚體抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中的D-二聚體發(fā)生反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體的夾心復(fù)合物，經(jīng)清洗液洗滌后，加入AMPPD 底物，AMPPD 底物在堿性磷酸酶的催化下發(fā)射光子，產(chǎn)生的光子數(shù)量與樣本中D-二聚體水平成正比。通過(guò)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的RLU 校準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出樣本中D-二聚體的水平。此測(cè)試方法只需10 μl 樣本量且16.8 min 即可出結(jié)果，空白限可以達(dá)到0.002 μg/ml，線性可達(dá)0.11～20.64 μg/ml，重復(fù)性驗(yàn)證的變異系數(shù)CV分別為4.04 %和2.96 %。本研究結(jié)果顯示，巴迪泰（廣西）C1500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血漿D-二聚體的精密度、準(zhǔn)確度、線性、空白限驗(yàn)證均通過(guò)；膽紅素≤40 mg/dl、血紅蛋白≤150 mg/dL 和三酰甘油≤1 000 mg/dl 對(duì)D-二聚體測(cè)試結(jié)果無(wú)顯著干擾；測(cè)試75 例臨床樣本與思塔高STA Compact Max 凝血分析儀檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.9925，2 種檢測(cè)方法相關(guān)性較好。

綜上所述，巴迪泰C1500 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血漿D-二聚體的性能可達(dá)到實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量要求，滿(mǎn)足臨床應(yīng)用需求。