正常-腦癱病證雙生子印記基因篩選
——功能分析與隨機(jī)驗(yàn)證研究

朱海燕，張春江，黃麗莉，董小麗，尹巧芝，張?zhí)於稹?/p>

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都市第一人民醫(yī)院，四川 成都 610095；3.成都中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610042)

腦性癱瘓(cerebral palsy，CP)是指胎兒及嬰幼兒期發(fā)育中腦的非進(jìn)行性損傷及缺陷所造成的運(yùn)動(dòng)障礙及姿勢(shì)異常，是目前導(dǎo)致小兒殘疾的疾病之一[1]。其發(fā)病原因十分復(fù)雜，包括遺傳學(xué)因素和非遺傳學(xué)因素，但具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。流行病學(xué)研究表明[2]，大多數(shù)腦癱起源于分娩之前，其中新生兒窒息、早產(chǎn)(和或低出生體重)、黃疸或和延遲(包括核黃疸)為腦癱最常見(jiàn)的高風(fēng)險(xiǎn)因素，部分腦癱患兒還存在潛在的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病或代謝障礙，與筆者團(tuán)隊(duì)前期對(duì)腦癱研究結(jié)果相一致[3]。近年來(lái)，影響腦癱的遺傳性因素逐漸被重視，其中印記基因被認(rèn)為與大腦及胎兒生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，因此印記基因的異常表達(dá)可能和腦癱具有相關(guān)性[4]。有研究[5]顯示，印記基因主要活躍在大腦和胎盤(pán)中，通過(guò)大腦和胎盤(pán)的共同作用，使許多相同的印記基因共同表達(dá)，以調(diào)控胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，但這也導(dǎo)致對(duì)印記基因的變異和表達(dá)差異難以掌控，使得胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、出生后的生長(zhǎng)發(fā)育障礙、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神障礙等病因難以準(zhǔn)確探查[6]。同卵雙生子在遺傳背景上幾乎相同，常被運(yùn)用于探索抑郁癥[7]、阿爾茨海默病[8]、肥胖[9]等復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制研究，本研究將以正常-腦癱雙生對(duì)及發(fā)育落后患兒為研究對(duì)象，篩選出外周血中差異性印記基因并進(jìn)行驗(yàn)證，以期進(jìn)一步闡明腦癱的發(fā)病機(jī)制，為腦癱的早期診斷提供候選靶點(diǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)早期干預(yù)，降低致殘幾率。

1 資料與方法

1.1 正常-腦癱雙生對(duì)的一般資料與數(shù)據(jù)來(lái)源

來(lái)自四川的兩對(duì)正常-腦癱雙生對(duì)，具有明確的病因病史診斷且患病不一致的同卵雙生子(曾就診于成都市第一人民醫(yī)院兒童康復(fù)中心)，唐姓雙生子，女性，10歲，大雙患病(重度痙攣型腦癱)，小雙正常；胡姓雙生子，男性，7歲，小雙患病(重度痙攣型腦癱)，大雙正常。提取唐、胡兩對(duì)雙生子mRNA，執(zhí)行全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)，獲取差異表達(dá)基因，實(shí)驗(yàn)由北京博奧生物芯片有限公司執(zhí)行[10]。

1.2 印記基因篩選與印記基因相互作用預(yù)測(cè)

根據(jù)兩對(duì)雙生子芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將表達(dá)差異基因(Ratio大于2高表達(dá)或小于0.5的低表達(dá)基因)與印記基因數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.geneimprint.com)進(jìn)行比對(duì)，篩選印記基因。應(yīng)用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲取的印記基因進(jìn)行基因間相互作用預(yù)測(cè)。

1.3 印記基因驗(yàn)證樣本來(lái)源

隨機(jī)選取成都市第一人民醫(yī)院2020年8月至2021年5月期間經(jīng)臨床確診、有完整病歷記錄的年齡相當(dāng)?shù)?例腦癱患兒與7例發(fā)育落后患兒，同時(shí)隨機(jī)選取6例年齡相當(dāng)?shù)恼和鳛檎?duì)照組，并簽署知情同意書(shū)。

1.4 主要儀器與試劑

可調(diào)式精密移液器(德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)：3123000225)；低溫離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀，型號(hào)：H1650)；醫(yī)用深低溫冰箱(中國(guó)Haier公司，型號(hào)：BCD-238WK)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(耶拿，型號(hào)：qTOWER3G)、PCR擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司，型號(hào)：TC-96/G/H/(b)B)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械，型號(hào)：LDZF-75L)；純水系統(tǒng)(德國(guó)Millipore公司，型號(hào)：Milli-Q Century)。

QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini Kit試劑盒(批號(hào)：80204，德國(guó)QIAGEN公司)；紅細(xì)胞裂解液(批號(hào)：BL503A，美國(guó)博士德公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(批號(hào)：AG29574691，美國(guó)HyClone公司)；DEPC(批號(hào)：BL510A，安徽蘭杰柯科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：R223，南京諾唯贊公司)；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒(批號(hào)：Q712，南京諾唯贊公司)；無(wú)水乙醇(批號(hào)：2021060902，成都科龍化工試劑廠)。

1.5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

選取芯片表達(dá)差異較大印記基因7條進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，包括SLC22A1、COPG2、IGF2R、HSPA6、GATA3、BRP44L、FAM50B。采集納入各組兒童外周血3 mL/人，提取總RNA，樣品質(zhì)量行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用Nanodrop超微量分光光度計(jì)對(duì)總RNA濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)。將RNA按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用特異性引物進(jìn)行RT-qPCR，檢測(cè)相應(yīng)印記基因表達(dá)情況，讀取CT值，運(yùn)用2-ΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)合成由上海生工公司完成。本實(shí)驗(yàn)引物序列如表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布則使用t檢驗(yàn)計(jì)算P值,若不符合正態(tài)分布,則運(yùn)用校正t檢驗(yàn)計(jì)算P值,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 印記基因篩選結(jié)果

獲取唐姓雙生對(duì)差異印記基因12個(gè),胡姓雙生對(duì)差異印記基因3個(gè)。共15個(gè),詳見(jiàn)表2。

表2 獲取的腦癱相關(guān)印記基因

2.2 基因間相互作用預(yù)測(cè)結(jié)果

GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,FAM50B與BRP44L、鋅指蛋白家族成員1(ZIC1)有直接共表達(dá)關(guān)系,ZIC1與SLC22A18有共表達(dá)關(guān)系,G蛋白偶聯(lián)受體1(GPR1)與淀粉樣β前體蛋白結(jié)合家族A成員1(APBA1)、溶質(zhì)載體家族4成員2(SLC4A2)有相同的表達(dá)模式,SLC4A2與GATA3有共表達(dá)關(guān)系,組織因子途徑抑制物2(TFPI2)與表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域成分7(EGFL7)有相同的共表達(dá)關(guān)系。GATA3-FAM50B、TFPI2-細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成員2(SPON2)和FLJ13081-G蛋白偶聯(lián)受體1(GPR1)三組基因之間存在直接的遺傳互作。詳見(jiàn)圖1(因數(shù)據(jù)庫(kù)使用的基因名不同,圖中的MPC1為BRP44L,MCMBP為FLJ13081)。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

部分樣品總RNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果呈現(xiàn)清晰且明亮的28S、18S和5S條帶,28S的亮度約為18S的兩倍,說(shuō)明總RNA較完整,達(dá)到RNA質(zhì)量要求,詳見(jiàn)圖2。

a.腦癱相關(guān)印記基因的共表達(dá)關(guān)系 b.腦癱相關(guān)印記基因的直接遺傳互作和共定位關(guān)系

a.部分腦癱外周血樣本 b.部分發(fā)育落后、正常外周血樣本

2.4 RT-qPCR驗(yàn)證差異印記基因表達(dá)結(jié)果

RT-qPCR結(jié)果顯示,COPG2、HSPA6、BRP44L、SLC22A18基因在腦癱組和發(fā)育落后組相對(duì)表達(dá)量皆低于正常組,其中腦癱組COPG2相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.01),發(fā)育落后組COPG2相對(duì)表達(dá)量降低(P>0.05),腦癱組、發(fā)育落后組HSPA6表達(dá)量降低(P<0.01,P<0.05),腦癱組、發(fā)育落后組SLC22A18、BRP44L相對(duì)表達(dá)量皆降低(P<0.01),腦癱組FAM50B相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。GATA3、IGF2R基因在腦癱組和發(fā)育落后組相對(duì)表達(dá)量皆高于正常組(P>0.05),發(fā)育落后組FAM50B亦為高表達(dá)(P>0.05)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 正常組-腦癱組-發(fā)育落后組RT-qPCR結(jié)果

3 討論

通過(guò)篩選正常-腦癱雙生對(duì)印記基因，共獲得芯片差異表達(dá)印記基因15個(gè)，其中APBA1被認(rèn)為是大腦中一種假定的囊泡運(yùn)輸?shù)鞍?，有可能將突觸囊泡胞吐作用和神經(jīng)元細(xì)胞粘附偶聯(lián)；ZIC1具有編碼基因功能的一種轉(zhuǎn)錄因子，可編碼C2H2，與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)[11]。因此我們認(rèn)為APBA1與ZIC1的表達(dá)可能與大腦功能具有相關(guān)性。與此同時(shí)，IGF2R具有降解胰島素生長(zhǎng)因子2、激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β和運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶的功能；BRP44L可編碼MPC1/MPC2異二聚體的一部分，且該蛋白存在于線粒體中，因此我們推斷IGF2R和BRP44L的表達(dá)可能與代謝具有相關(guān)性。此外，也有文獻(xiàn)記載[12-14]，F(xiàn)LJ13081、SPON2、FAM50B和SLC22A18的表達(dá)也與大腦功能相關(guān)，GPR1和IGF2R的表達(dá)與出生體重相關(guān)，SLC22A18、GPR1的表達(dá)亦和代謝具有相關(guān)性。研究表明[15-17]，GPR1、SPON2和SLC22A18表達(dá)異?；蛲蛔兛蓪?dǎo)致胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，從而表現(xiàn)出低體重、缺氧窒息以及胎兒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的代謝異常等問(wèn)題，該結(jié)果與腦癱患兒的臨床表現(xiàn)相一致。在臨床上，發(fā)育落后患兒癥狀和腦癱患兒具有相似性，發(fā)育落后常表現(xiàn)出語(yǔ)言、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和社會(huì)交流等2個(gè)及以上的神經(jīng)發(fā)育落后，而腦癱患兒可表現(xiàn)出更為典型的肌張力異常、神經(jīng)病理反射、發(fā)育異常及智力障礙等[18，19]。有學(xué)者認(rèn)為[20]，全面性發(fā)育落后患兒預(yù)后不良可能會(huì)進(jìn)展為腦癱。結(jié)合RT-qPCR結(jié)果顯示，腦癱組與發(fā)育落后組的COPG2、FAM50B和HSPA6表達(dá)有明顯差異。COPG2是一種胞質(zhì)復(fù)合體，參與可逆性囊泡介導(dǎo)的運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。Schneider等認(rèn)為[21]，與黑猩猩、狒狒、恒河猴和狨猴多種靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物相比，COPG2在人類(lèi)大腦中顯示出特有的下調(diào)，因此，COPG2表達(dá)的下調(diào)可能與“社交大腦”的進(jìn)化有關(guān)，而COPG2的異常下調(diào)可能是導(dǎo)致自閉癥的原因之一。Yamasaki等[22]發(fā)現(xiàn)由父系表達(dá)的COPG2的印記轉(zhuǎn)錄本1(COPG2IT1)位于COPG2內(nèi)含子20內(nèi)，該部位是行為障礙Silver-Russell綜合征的候選區(qū)域。Silver-Russell綜合征主要以子宮內(nèi)發(fā)育遲緩、生長(zhǎng)遲緩為表現(xiàn)的一組病癥，與腦癱的部分臨床表現(xiàn)具有相似性。此外，Kolarova等[23]在智力障礙患者的外周血樣中發(fā)現(xiàn)FAM50B基因的甲基化改變，考慮智力障礙可能與FAM50B表達(dá)異常相關(guān)。HSPA6是一種保護(hù)性蛋白，在人胎盤(pán)低氧條件下，滋養(yǎng)層細(xì)胞的存活需要金屬蛋白酶調(diào)節(jié)脫落肝素結(jié)合EGF樣生長(zhǎng)因子(HB-EGF)和下游信號(hào)傳導(dǎo)。Jain[24]等發(fā)現(xiàn)HSPA6不僅在調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬肽酶2(MMP2)的生物合成中起著重要作用，而且在缺氧情況下，HSPA6是HBEGF脫落所必需的。文獻(xiàn)研究指出[25]，HSPA6對(duì)于女性成功受孕也至關(guān)重要。由此可知，腦癱表現(xiàn)的生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及語(yǔ)言障礙可能與COPG2下調(diào)有關(guān)，智力障礙可能與FAM50B異常表達(dá)相關(guān)，HSPA6下調(diào)導(dǎo)致的缺氧窒息可能導(dǎo)致腦癱。這些基因表達(dá)差異的大小可能與癥狀輕重有關(guān)，與腦癱和發(fā)育落后患兒的臨床表現(xiàn)相一致。

營(yíng)養(yǎng)充足，正常代謝是胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)，胎盤(pán)缺陷是導(dǎo)致腦癱的根本原因。SLC22A18是一種參與腫瘤抑制和脂質(zhì)積累的印記基因[26，27]，與胎兒脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。Qiao[28]等通過(guò)比較正常小兒與具有可變性過(guò)敏、身材矮小和脂肪肝三聯(lián)征小兒的RT-qPCR、Sanger測(cè)序和DNA甲基化測(cè)序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有可變性過(guò)敏、身材矮小和脂肪肝三聯(lián)征小兒的SLC22A18mRNA表達(dá)水平較低、SLC22A18核心啟動(dòng)子“A”缺失且甲基化水平較高。因此認(rèn)為SLC22A18下調(diào)可能與小兒身材矮小和(或)肥胖伴兒童過(guò)敏病理機(jī)制可能具有相關(guān)性。同時(shí)，SLC22A18也被認(rèn)為與Silver-Russell綜合征和Beckwith-Wiedemann綜合征有關(guān)[29，30]。丙酮酸鹽位于連接碳水化合物，氨基酸和脂肪酸代謝的中心生化節(jié)點(diǎn)，因此BRP44L在代謝中具有至關(guān)重要的作用。Benoit[31]等發(fā)現(xiàn)小鼠MPC1基因的全身敲除，可導(dǎo)致胚胎死亡。Zou[32]等在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，MPC1敲低的小鼠出現(xiàn)體重低，身體運(yùn)動(dòng)少，軀體溫度低，運(yùn)動(dòng)測(cè)試中RER較低等情況。結(jié)合RT-qPCR結(jié)果可知，SLC22A18與BRP44L下調(diào)可能是發(fā)育落后患兒和腦癱患兒低體重、發(fā)育異常的病理因素；此外，GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ZIC1與SLC22A18有共表達(dá)關(guān)系，F(xiàn)AM50B、BRP44L和ZIC1有直接共表達(dá)關(guān)系，故腦癱低體重、發(fā)育異常的病理機(jī)制可能和ZIC1表達(dá)亦具有相關(guān)性。與SLC22A18和BRP44L相反的是，在RT-qPCR結(jié)果中，IGF2R與GATA3在腦癱組和發(fā)育落后組中皆有上調(diào)趨勢(shì)(P>0.05)。哺乳動(dòng)物早期胚胎需要通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、粘附受體及其配體來(lái)產(chǎn)生絨毛膜滋養(yǎng)外胚層前體，隨后是胎盤(pán)的胎兒部分，而滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡過(guò)程中的缺陷和分化異常與妊娠相關(guān)疾病有關(guān)。在滋養(yǎng)層祖細(xì)胞中，GATA因子具有直接調(diào)節(jié)BMP4，節(jié)點(diǎn)和Wnt信號(hào)成分，促進(jìn)胚胎-胚胎外信號(hào)傳導(dǎo)[33，34]。Lu[35]等發(fā)現(xiàn)GATA3在hESC中過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致自發(fā)分化成滋養(yǎng)層譜系和非滋養(yǎng)層譜系，同時(shí)，GATA3下調(diào)會(huì)影響滋養(yǎng)外胚層的規(guī)格，從而影響胚胎的發(fā)育。Lynda[36]等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IGF2與IGF2R相互作用可調(diào)節(jié)絨毛滋養(yǎng)層存活和凋亡，且其認(rèn)為IGF2R的異常表達(dá)會(huì)使滋養(yǎng)層功能異常，從而導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限。但由于胎盤(pán)植入和發(fā)育過(guò)程復(fù)雜且模型有限，GATA3與IGF2R對(duì)人類(lèi)滋養(yǎng)層細(xì)胞的具體影響尚不明確。因此，腦癱形成可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常有關(guān)，但GATA3和IGF2R對(duì)腦癱的病理影響還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

綜上所述，腦癱表現(xiàn)的生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、語(yǔ)言障礙及智力障礙可能與COPG2、FAM50B和HSPA6下調(diào)有關(guān)，這些基因表達(dá)差異的大小可能與癥狀輕重有關(guān)；發(fā)育落后患兒和腦癱患兒低體重、發(fā)育異?？赡芘cSLC22A18與BRP44L下調(diào)有關(guān)，因此，SLC22A18、BRP44L、COPG2、FAM50B和HSPA6可作為腦癱早期診斷的候選靶點(diǎn)，以期為腦癱生物學(xué)早期診斷提供依據(jù)。GATA3與IGF2R可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常有關(guān)，但與腦癱的具體影響尚不明確，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本研究尚存在一些不足之處，僅對(duì)部分芯片表達(dá)差異明顯的印記基因進(jìn)行驗(yàn)證，未對(duì)這些印記基因功能進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證分析，今后將進(jìn)一步完善。