通督調(diào)神灸對大腦中動脈阻塞大鼠學習記憶及軸突再生的影響

劉芳，郭佳穎，林少鴻，侯玉菲，陳鑫

(福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122)

卒中后認知障礙(post-stroke cognitive impairment，PSCI)是卒中后常見的并發(fā)癥之一。一項大型國際隊列研究結(jié)果表明，PSCI發(fā)病率高達24%-53.4%[1]，我國最新的《卒中后認知障礙管理專家共識》顯示，約1/3的卒中幸存者患有PSCI，PSCI對卒中病人的生活質(zhì)量及生存時間產(chǎn)生了嚴重影響[2]。學習記憶障礙是PSCI患者最首要的特征，也是引起卒中持久后遺癥的主要因素[3]。艾灸作為其中不可或缺的一種非侵入性中醫(yī)外治法，是中風的中醫(yī)特色護理技術之一[4，5]。“通督調(diào)神灸”是艾灸中的一種重要類型，其“通督”的治療總綱領與歷代醫(yī)家強調(diào)的“病變在腦，首取督脈”一致，成為了臨床PSCI治療中最常用的艾灸類型，但其作用機制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血區(qū)域的存活神經(jīng)元可通過軸突再生(即損傷神經(jīng)元的軸突末端形成生長錐)與損傷區(qū)附近皮層重新建立連接，從而改善神經(jīng)功能。Cofilin是一種肌動蛋白相關蛋白，它定位于生長錐，研究顯示其與卒中以及認知障礙的發(fā)生發(fā)展存在著一定的聯(lián)系[6，7]。本研究通過觀察通督調(diào)神灸干預對大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠神經(jīng)缺損情況、學習記憶能力、腦梗死情況、神經(jīng)元凋亡、軸突再生及Cofilin的影響，探討通督調(diào)神灸對MCAO大鼠學習記憶能力的干預效果及作用機制，為通督調(diào)神灸在PSCI患者臨床康復護理中的推廣和應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

45只成年健康雄性SD大鼠[許可證號碼：SCXK(滬)2017-0005]購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，體質(zhì)量250-300 g，于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心[許可證編號:SYXK(閩)2020-0003]適應性喂養(yǎng)一周。實驗經(jīng)福建中醫(yī)藥大學動物實驗管理委員會批準(倫理號：2021159)。分組采用隨機數(shù)字表，分為假手術組、模型組和通督調(diào)神灸組3組，15只/組。

1.2 模型制備

所有大鼠于術前禁食12 h，對模型組和通督調(diào)神灸組大鼠進行左側(cè)MCAO手術。具體步驟：①大鼠稱重后，20%烏拉坦注射液0.6 mL/100 g腹腔注射麻醉；②充分麻醉后，仰臥固定頭部和四肢于實驗鼠板，頸部充分暴露后備皮，消毒；③從頸部正中線剪開皮膚，鈍性分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動脈和頸外動脈；④頸內(nèi)動脈被鈍性分離后用血管夾夾閉其遠心端；⑤在頸總動脈結(jié)扎處遠端0.5 mm處剪一小口，將MCAO模型線栓由頸總動脈開口處插入頸內(nèi)動脈；⑥松開血管夾，將線栓繼續(xù)推入至遇少許阻力，深度約為20 mm，即表明線栓已進入大腦中動脈內(nèi)，記錄時間；⑦將頸內(nèi)動脈及線栓一同結(jié)扎，常規(guī)縫合、消毒頸部手術切口并使線栓尾部暴露在皮膚之外，腹腔注射慶大霉素注射液后將大鼠放于恒溫加熱墊上保暖直至蘇醒；⑧待線栓插入1.5 h后將線栓部分拔出以實現(xiàn)大腦中動脈的缺血再灌注，最后將切口外線栓剪斷完成造模。待大鼠清醒后，根據(jù)Zea-Longa神經(jīng)功能缺損評分法[8]判斷造模是否成功，評分為1-3分表明MCAO大鼠造模成功。假手術組僅進行分離動脈操作，未結(jié)扎和插栓等。

1.3 干預措施

通督調(diào)神灸組于造模后第2天開始對大鼠進行通督調(diào)神灸干預，即一手抓取大鼠并用食指和中指對其頭部稍加固定，一手持點燃后的艾條(直徑約8 mm)，在大鼠百會穴上方20-30 mm處施灸，穴位定位參照《實驗針灸學》[9],20 min/次,1次/d,持續(xù)干預7 d[10]。另外兩組給予同等條件抓取，無其他干預。

1.4 評價指標

1.4.1 神經(jīng)功能缺損評分

于造模清醒后2 h及干預7 d后進行Zea-Longa評分評估各組大鼠的神經(jīng)功能缺損情況。

1.4.2 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮實驗包括定位航行和空間探索兩部分實驗，用以評估大鼠的學習記憶能力。定位航行實驗：于干預第2-6天進行。將大鼠面朝池壁順序從四個象限放入水中，若于90 s內(nèi)找到平臺并停留時間達3 s以上，尋找平臺成功，所耗費時間即為逃避潛伏期；若大于90 s仍未能找到平臺，則記為90 s，四個象限的平均值即為逃避潛伏期，實驗結(jié)束后用毛巾將大鼠擦干并置于烤燈下烘干保暖?？臻g搜索實驗：于艾灸干預7 d后，平臺移除后將大鼠從第一象限放入水中，記錄其90 s內(nèi)穿越平臺的次數(shù)。

1.4.3 腦梗死體積測定

于造模24 h后及干預7 d后采用micro-MRI對各組大鼠的頭部進行掃描，觀察大鼠左側(cè)腦梗死體積。大鼠吸入麻醉后，俯臥位固定于掃描床上，采用T2加權成像(T2-weighted imaging，T2WI)掃描。掃描結(jié)束后，運用Image J圖像處理軟件計算腦梗死體積百分比，即每層腦梗死面積×(層間距+層厚)/同一層全腦面積×(層間距+層厚)×100%。

1.4.4 TUNEL染色

采用20%烏拉坦對大鼠進行深度麻醉，全麻后取仰臥位，開胸暴露心臟，于心尖剪一小口，將已消毒的灌胃針從心尖插至升主動脈并用止血鉗夾閉灌胃針及心臟以便固定。于右心耳處剪一小口，釋放靜脈血，使用針筒向灌胃針中快速注入150 mL 0.9%氯化鈉溶液去除血液，再用150 mL 4%多聚甲醛溶液(pH值=7.3)進行固定。當大鼠處于四肢抽搐，明顯僵直狀態(tài)時，使用斷頭鍘，快速斷頭取全腦。全腦組織使用4%多聚甲醛浸泡，4℃冰箱保存24 h固定后，流水沖洗，切除嗅球，按4∶3∶3比例進行切割，切割完畢放于70%乙醇溶液中浸泡過夜。次日將浸泡完畢組織置于包埋盒中，脫水后用石蠟包埋。從腦組織的冠狀位，進行4 μm厚度切片。于約37℃溫水中進行攤片，使用載玻片將切片撈起烘干。將制備完成的腦組織切片放于60℃環(huán)境中復溫30 min，再用二甲苯脫蠟后滴加蛋白酶K工作液，置于20-37℃的環(huán)境反應15 min至30 min，再漂洗3次。各樣品滴加50 μL TUNEL檢測液進行上樣，避光，37℃，反應1 h，反應結(jié)束后 3次洗滌。封片使用抗熒光淬滅封片液，鏡下觀察。藍色熒光為細胞核，綠色熒光為凋亡細胞。每片隨機選取5個視野。使用Image-Pro-Plus(IPP)軟件計數(shù)凋亡細胞數(shù)量，細胞凋亡率=綠色熒光數(shù)/藍色熒光數(shù)×100%。

1.4.5 免疫組化

取材、包埋及切片制備同TUNEL染色。將樣本完全浸于抗原修復液中加熱煮沸10 min，待自然冷卻至室溫后漂洗3次，3 min/次。將樣本周圍多余液體拭去后，沿樣本周圍用免疫組化筆畫出隔水帶。樣本上滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷液，室溫下孵育10 min后漂洗3次。加GAP-43一抗(濃度1∶200)4℃孵育過夜，再滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次。按所購試劑盒說明書配置DAB工作液并滴加到待測樣本上，室溫孵育1-5 min(具體反應時間可在顯微鏡下觀察并進行控制)，隨后用純水進行洗滌。使用Mayer’s蘇木素對樣本復染10 min，再用純水沖洗，PBS反藍。將樣本脫水，樹膠封片，待干后置于鏡下進行觀察、拍照。每個切片任意選取5個視野拍照，計算平均光密度，即視野中陽性表達部位累積光密度/視野下樣品面積。

1.4.6 免疫熒光

取材、包埋及切片制備同TUNEL染色?？乖瓱嵝迯屯庖呓M化染色。將樣本置于硼氫化鈉溶液中室溫反應30 min后自來水沖洗5 min，再將樣本放入75%乙醇溶液中浸泡1 min，最后將樣本置于蘇丹黑染液中室溫反應15 min，隨后用自來水沖洗5 min。用濾紙擦去樣本周圍多余液體，并用免疫組化筆在玻片上的樣本周圍畫出隔水帶。在樣本上滴加山羊血清，室溫下封閉60 min后滴加GAP-43一抗(濃度1∶100)，4℃孵育過夜；滴加二抗，37℃孵育60 min后漂洗3次，采用含DAPI的抗熒光淬滅封片液進行封片，待干后于熒光顯微鏡下觀測、拍照。

1.4.7 免疫印跡

《中國儲運》創(chuàng)刊于1990年，經(jīng)國家新聞出版署批準出版，面向海內(nèi)外公開發(fā)行，國內(nèi)統(tǒng)一刊號CN12-1204/F，郵發(fā)代號6-151。國際16開銅版彩印，月刊，國際標準刊號ISSN1005-0434，國外發(fā)行代號BM1821。

采用20%烏拉坦注射液按0.6 mL/100 g進行腹腔注射麻醉后迅速斷頭取全腦，分離出左側(cè)海馬組織置于液氮中，存于-80℃冰箱中保存。取100 mg組織樣品放入800 μL按比例提前配置好的裂解液混合物相應組別凍存管中并剪碎組織，將凍存管置于研磨儀中進行研磨處理，超聲10 min，隨后于冰上靜置20 min使其充分裂解，4℃，14 000 r/min(r=6 cm)，離心20 min，取蛋白上清液按試劑盒說明書配置BCA工作液檢測蛋白質(zhì)濃度，以1∶4的比例進行上樣，7 500 r/min(r=6 cm)，離心5 min后置于100℃金屬浴鍋中，加熱10 min。按試劑盒說明書配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，順序一抗孵育、二抗孵育。按試劑盒說明書配置ECL，滴加于漂洗后的PVDF膜上避光反應1 min，最后在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中進行觀察、拍照。用Image Lab軟件進行條帶分析。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 各組最終完成實驗的大鼠情況

最終假手術組完成試驗大鼠15只；模型組和艾灸組大鼠因造模時大出血死亡、麻醉不耐受死亡及造模不成功剔除，最終模型組完成實驗13只，艾灸組13只。

2.2 通督調(diào)神灸對MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響

造模清醒后2 h，假手術組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損評分為0分，模型組和通督調(diào)神灸組大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，其評分較假手術組高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明造模成功。同時，模型組與通督調(diào)神灸組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示在干預前兩組大鼠的神經(jīng)功能缺損程度具有可比性。干預7 d后與模型組相比，通督調(diào)神灸組評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。提示通督調(diào)神灸可有效減輕MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損程度。

表1 各組大鼠Zea-longa評分 分

2.3 通督調(diào)神灸對MCAO大鼠學習記憶能力的影響

對3組大鼠干預第2-6天的逃避潛伏期進行重復測量方差分析，結(jié)果顯示，干預第2-6天，與其他兩組相比，假手術組的逃避潛伏期短，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；通督調(diào)神灸組逃避潛伏期于干預第4-6天均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表2。對干預第7天各組大鼠的穿越平臺次數(shù)進行組間比較結(jié)果顯示，假手術組高于模型組和通督調(diào)神灸組，通督調(diào)神灸組高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。以上結(jié)果表明通督調(diào)神灸能夠有效改善MCAO大鼠的學習記憶能力。

表2 各組大鼠逃避潛伏期 秒

表3 各組大鼠90 s內(nèi)穿越平臺次數(shù) 次

2.4 通督調(diào)神灸對MCAO大鼠腦梗死體積的影響

造模后24 h，與假手術組相比，模型組和通督調(diào)神灸組腦梗死體積明顯增大，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明造模成功；模型組與通督調(diào)神灸組兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可見兩組大鼠在干預前腦梗死體積具有可比性。干預7 d后，與模型組相比，通督調(diào)神灸組腦梗死體積縮小明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4、圖1。表明通督調(diào)神灸能有效減小MCAO大鼠的腦梗死體積。

注:高信號白色區(qū)域為缺血梗死灶

表4 各組大鼠的腦梗死體積百分比

2.5 通督調(diào)神灸對MCAO大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

注:藍色熒光為正常神經(jīng)元,綠色熒光為凋亡神經(jīng)元(標尺25 μm)

表5 各組神經(jīng)元凋亡率

2.6 通督調(diào)神灸對MCAO大鼠GAP-43的影響

采用免疫組化法對各組大鼠梗死側(cè)海馬區(qū)的GAP-43進行半定量分析，以平均光密度值代表GAP-43水平高低。對各組大鼠平均光密度值進行組間比較，結(jié)果顯示，與假手術組相比，模型組和通督調(diào)神灸組的平均光密度值增加，而通督調(diào)神灸組較模型組更高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表6和圖3。大鼠梗死側(cè)海馬區(qū)的GAP-43免疫熒光染色結(jié)果可見，GAP-43主要表達于細胞質(zhì)中，模型組和通督調(diào)神灸組的紅色熒光(GAP-43)強度均高于假手術組，且通督調(diào)神灸組的紅色熒光強度在所有組別中最高，GAP-43表達量最高，見圖4。以上免疫組化和免疫熒光結(jié)果表明通督調(diào)神灸干預能夠升高MCAO大鼠梗死側(cè)海馬區(qū)的GAP-43水平。

注:陽性染色結(jié)果為黃色或棕黃色

注:紅色熒光為GAP-43,藍色熒光為神經(jīng)元細胞(標尺25 μm)

表6 各組大鼠GAP-43免疫組化平均光密度值

2.7 通督調(diào)神灸對MCAO大鼠Cofilin表達的影響

對各組大鼠左側(cè)海馬組織Cofilin蛋白表達量進行比較，結(jié)果顯示，模型組和通督調(diào)神灸組較假手術組升高，通督調(diào)神灸組較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表7、圖5。以上結(jié)果表明通督調(diào)神灸可降低MCAO大鼠海馬中Cofilin表達量，說明通督調(diào)神灸可促進軸突再生可能與調(diào)控Cofilin有關。

圖5 各組大鼠海馬組織相關蛋白檢測結(jié)果

表7 各組大鼠Cofilin表達情況

3 討論

3.1 通督調(diào)神灸可減輕MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損，縮小腦梗死體積

通督調(diào)神理論是由全國名老中醫(yī)張道宗教授提出的，是通過通調(diào)督脈調(diào)治全身臟腑從而對疾病達到治療效果的學術思想[11]。通督調(diào)神灸是由通督調(diào)神理論延伸、發(fā)展而來，以艾灸督脈腧穴作為主要方式，對疾病進行治療，在臨床治療中已被證實具有疏經(jīng)通絡、調(diào)神益氣、補髓健腦的作用[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組和艾灸組大鼠經(jīng)MCAO造模后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損情況，同時micro-MRI圖像顯示MCAO造模后大鼠的左側(cè)皮層及海馬組織均出現(xiàn)大面積的缺血梗死灶且梗死體積相當，表明MCAO大鼠均造模成功且梗死部位及梗死程度相當，具有可比性。在經(jīng)過7 d的通督調(diào)神灸干預之后，艾灸組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分降低，腦梗死體積顯著縮小，較模型組改善程度顯著?？梢?，通督調(diào)神灸可以有效改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損及腦梗死的體積。艾灸可通過其燃燒物效應、溫熱刺激效應、紅外光譜共振效應等作用于人體腧穴從而產(chǎn)生治療效果。其中溫熱效應是艾灸產(chǎn)生療效的主要方式，艾灸的溫熱刺激能舒張人體局部及深層的血管，趙寧俠等人的研究表明艾灸百會穴能增加人大腦中動脈及后動脈的血流動力[13]。姚寶農(nóng)等[14]使用艾灸儀對中風患者的百會穴進行艾灸后發(fā)現(xiàn)，艾灸可明顯改善腦缺血病人的大腦血液循環(huán)，經(jīng)治療后其神經(jīng)功能缺損程度有了顯著改善，說明通督調(diào)神灸可能是通過其溫熱效應改善MCAO大鼠腦血流情況以改善MCAO大鼠的腦梗死體積及神經(jīng)功能。此外，蔣潔等[15]的研究表明艾灸可有效減輕MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損，減小腦梗死體積，促進神經(jīng)功能的康復，與本研究結(jié)果一致。

3.2 通督調(diào)神灸可改善MCAO大鼠學習記憶能力

本研究發(fā)現(xiàn)，在通督調(diào)灸干預第4-6天后，與模型組相比，通督調(diào)灸組的逃避潛伏期明顯縮短，在通督調(diào)灸干預第7天后，穿越平臺次數(shù)明顯增多，說明通督調(diào)神灸干預后MCAO大鼠的學習記憶較模型組得到了更大程度的改善。由此可見，通督調(diào)神灸可以有效改善MCAO大鼠的學習記憶能力。中醫(yī)學認為卒中后學習記憶障礙本質(zhì)為臟腑氣血不足以致腦髓不充，或因痰濕、瘀血、肝陽等上擾“元神”，使其受損而發(fā)病。督脈是匯聚全身精、神、氣，并交通心腎、統(tǒng)帥經(jīng)絡而循行入腦的一條經(jīng)脈，百會穴是督脈中最常用于健腦清竅的穴位[16]。艾灸可加強局部刺激，利于激活穴位精氣，故當艾灸作用于百會穴后可達到溫通經(jīng)絡、化瘀散結(jié)、通調(diào)髓海之功效，從而改善學習記憶功能[17]。

3.3 通督調(diào)神灸可抑制MCAO大鼠神經(jīng)元凋亡，抑制Cofilin活性，促進神經(jīng)元軸突再生

卒中發(fā)生后，梗死區(qū)域的腦組織神經(jīng)元受到損害后，梗死核心區(qū)的神經(jīng)元會立即發(fā)生細胞壞死，而缺血半暗帶的神經(jīng)元會延遲數(shù)小時或數(shù)天后才開始出現(xiàn)凋亡。而細胞凋亡可以通過一些治療手段的抑制而被逆轉(zhuǎn)，因此，及時挽救缺血半暗帶受損神經(jīng)元，抑制其細胞凋亡可減少缺血缺氧對于神經(jīng)元的損害，對改善腦卒中患者的神經(jīng)功能和預后尤為重要[18，19]。同時，腦缺血缺氧發(fā)生后，缺血半暗帶的受損神經(jīng)元會離斷成兩部分，包括與胞體相連的近端殘端及遠離胞體的遠端殘端，近端殘端軸突可通過發(fā)芽再生后朝著遠端軸突方向生長，進而與附近神經(jīng)元重新建立連接[20]。相關研究顯示，Cofilin是海馬神經(jīng)元軸突生長的必要條件之一，學習記憶功能的產(chǎn)生和維持依賴于肌動蛋白的動態(tài)組裝及Cofilin磷酸化水平的增加[21，22]。相關研究顯示，抑制Cofilin的活性可減少MCAO大鼠缺血半暗帶Cofilin的線粒體易位，從而抑制腦缺血引起的神經(jīng)元凋亡[23]。

GAP-43神經(jīng)生長相關蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)是一種軸突相關蛋白，在神經(jīng)元生長及突觸形成過程中高度表達，它能夠促進神經(jīng)元軸突再生、維持突觸可塑性并調(diào)節(jié)學習記憶相關信號的傳遞功能，是軸突再生的典型特征，并可作為反應神經(jīng)生長狀況的分子標志物[24，25]。GAP-43的表達水平在正常情況下很低，在腦缺血發(fā)生后，梗死區(qū)域存活的受損神經(jīng)元由于負反饋機制出現(xiàn)反應性軸突再生，使得GAP-43表達水平升高；隨著缺血缺氧時間的延長，受損神經(jīng)元的損傷情況加重并出現(xiàn)凋亡，反應性軸突再生減弱，GAP-43表達水平便開始逐漸下降[26]。而相關研究顯示，缺乏GAP-43會限制小鼠神經(jīng)元軸突再生，使其腦組織無法重建，導致突觸功能喪失，進而出現(xiàn)認知功能受損[27]。本研究結(jié)果顯示，MCAO造模后的大鼠神經(jīng)元凋亡率明顯高于假手術組大鼠，且造模后的大鼠梗死側(cè)海馬GAP-43、Cofilin表達水平顯著升高，說明腦缺血再灌注損傷導致大鼠腦部梗死灶神經(jīng)元出現(xiàn)大量凋亡，同時在腦缺血發(fā)生后，梗死區(qū)域神經(jīng)元出現(xiàn)了一定程度上的反應性軸突再生，神經(jīng)元中的Cofilin被大量激活，這不僅會導致生長錐崩塌，當其進入線粒體后還會促使存活的受損神經(jīng)元啟動細胞凋亡程序，引起神經(jīng)元大量凋亡，反應性軸突再生出現(xiàn)減弱。通督調(diào)神灸干預后大鼠的腦梗死區(qū)域神經(jīng)元凋亡率與模型組相比出現(xiàn)明顯的降低，梗死側(cè)海馬GAP-43表達水平升高，Cofilin表達水平降低?？梢姡ǘ秸{(diào)神灸確可改善MCAO大鼠的腦梗死區(qū)域神經(jīng)元凋亡，抑制Cofilin活性從而促進軸突再生，進而改善MCAO大鼠的學習記憶功能。

總之，通督調(diào)神灸干預可改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損情況，減少腦梗死體積，抑制腦梗死區(qū)域神經(jīng)元凋亡，同時抑制Cofilin表達，促進神經(jīng)元軸突再生，促進學習記憶功能康復。但通督調(diào)神灸通過哪些途徑影響Cofilin表達與軸突再生還有待進一步研究。