基于高密度遺傳圖譜的多環(huán)境玉米穗長QTL 定位

馬曉杰，趙延明，王軍燕，周苗苗，彭欣，潘乃菲，高惠敏，劉宸銘，蘇成付

(青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山東 青島 266109)

玉米是重要的糧食和飼料作物，也是一種生物質(zhì)能源材料[1-2]，在人們生產(chǎn)生活中占據(jù)重要地位。 果穗是玉米的主要收獲器官，穗長是影響玉米籽粒產(chǎn)量的重要性狀之一。 Jenkins 等[3]早期研究表明，玉米自交系產(chǎn)量與穗長性狀顯著正相關；梁曉玲等基于17 個玉米雜交種[4]、李泉木等基于20 個雜交組合[5]的研究結(jié)果也證明穗長性狀與產(chǎn)量間存在正相關關系。 因此，定位玉米穗長的QTL 具有重要意義，不僅有助于理解玉米穗長性狀的遺傳基礎和分子調(diào)控機制，而且可為挖掘玉米產(chǎn)量潛力奠定基礎。

前人已對玉米穗長性狀開展了一些QTL 定位研究，但因穗長是復雜的數(shù)量性狀，不同試驗材料在不同環(huán)境下的研究結(jié)果不同[6]。 王幫太等[7]以87-1 和綜3 為試驗材料構(gòu)建染色體單片段代換系(SSSL)，并基于兩種環(huán)境下的表型數(shù)據(jù)，定位到20 個穗長QTL 位點，解釋表型貢獻率12.10%～19.18%。 胡利宗等[8]基于NX110 與NX5314 組合的BC2F2回交群體，定位到4 個控制穗長的QTLs，解釋表型變異1.32%～23.50%。 Li等[9]基于Dan232 和N04 雜交組合的F2、BC2F2和RIL 群體，在4 個環(huán)境下鑒定出14 個控制玉米穗長的QTLs，解釋表型變異4.5%～8.7%。 Sabadin等[10]基于玉米自交系L-06-05F 與L-14-4B 組合獲得包含400 個家系的F2∶3群體，定位到5 個控制玉米穗長的QTLs，解釋表型變異3.1%～7.9%。湯繼華等[11]以綜3 與87-1 為材料配制雜交組合，利用F2群體，在兩種環(huán)境中鑒定到8 個穗長QTLs，解釋表型變異3.11%～11.86%。 Ross[12]利用玉米自交系SE-40 與LE-37 雜交獲得的F2和F2∶3群體，分別定位到9 個和26 個與穗長相關的QTLs。 Veldboom 等[13]利用Mo17/H99 組合衍生的F2∶3群體定位到5 個穗長QTLs。 代國麗等[14]利用L26/095 組合的F2群體鑒定到3 個玉米穗長QTLs。 謝惠玲等[15]利用黃C/許178 組合獲得的重組自交系，定位到8 個穗長QTLs。 霍冬敖[16]利用玉米自交系TY6 分別與Mo17 和W138組配F2分離群體以及F2∶3群體，鑒定到11 個玉米穗長QTLs，解釋表型變異0.9%～15.6%。 李庭鋒[17]基于吉846/掖3189 組合的重組自交系群體，定位到19 個玉米穗長QTLs，解釋表型貢獻率4.09%～14.49%。 王輝等[18]以鄭58 和HD568 為親本構(gòu)建RIL 群體，在不同種植密度下進行QTL定位研究，檢測到8 個穗長QTLs，分別位于1、2、3、4、9 號染色體，可解釋表型變異4.37% ～10.50%。Zhou 等[19]以鄭58/昌7-2 組合的F2∶3群體、D276/D72/A188/Jiao51 進行四元雜交獲得的四交群體為材料，結(jié)合SSR 分子標記，在兩環(huán)境下共檢測到14 個穗長QTLs。 李衛(wèi)華等[20]以昌7-2的單片段代換系為材料，共檢測到22 個穗部性狀QTLs，其中控制穗長性狀的QTLs 有9 個，單個QTL 可解釋8.6%～14.25%的表型變異；且發(fā)現(xiàn)了前人研究中同樣被檢測到的3 個玉米穗長QTLs 和1 個穗粗QTL 穩(wěn)定表達位點。 Huo 等[21]以Mo17×TY6、W138×TY6 構(gòu)建兩套F2∶3家系群體，共檢測到11 個穗長QTLs，可解釋0.9% ～15.6%的表型變異；在1 號染色體發(fā)現(xiàn)一個一因多效位點qEL1.10，同時調(diào)控穗長及行粒數(shù)性狀。Zhao 等以廊黃×TS141 和昌7-2×TS141 兩組親本構(gòu)建的兩組F2∶3家系為材料，檢測到9 個穗長QTLs，單個QTL 可解釋4.0%～17.2%的表型變異[22]；應用同樣的試驗材料，在不同環(huán)境下，利用復合區(qū)間作圖法(CIM)及基于混合線性模型的復合區(qū)間作圖法(MCIM)相結(jié)合，定位到2 個調(diào)控穗長的MQTLs[23]。 Shi 等[24]構(gòu)建了240 個家系的DH 群體，結(jié)合高密度遺傳圖譜，定位到5 個與穗長相關的QTLs，并在1 號染色體上定位到成簇QTLs，穗長QTL(qEL1)、穗粗QTL(qED1)和穗軸粗QTL(qCD1)被重疊定位，3 個QTLs 分別解釋15.7%、28.3%和22.6%的表型變異。

在穗長基因克隆上，張人予[25]克隆了玉米穗長基因EL3，通過CRISPR/Cas9 技術(shù)進行基因敲除和超表達、結(jié)合轉(zhuǎn)錄組技術(shù)驗證了該基因。 Jia等[26]克隆了一個調(diào)控行粒數(shù)QTLqKNR6，研究結(jié)果表明該QTL 主效基因同時影響玉米穗長與行粒數(shù)性狀。 Luo 等[27]運用全基因組關聯(lián)分析(GWAS)技術(shù)，定位了一個未知蛋白編碼基因YIGE1，通過基因敲除及過表達分析，驗證了YIGE1基因?qū)τ衩谆ㄐ蚍稚M織(IM)、行粒數(shù)(KNR)和穗長(EL)具有正調(diào)控作用；進一步分析發(fā)現(xiàn)該基因可能通過參與糖和生長素信號途徑，進而調(diào)控玉米IM 的發(fā)育，影響行粒數(shù)和穗長，最終增加玉米的產(chǎn)量。

通過多環(huán)境QTL 定位研究可以發(fā)現(xiàn)控制穗長的穩(wěn)定QTL 位點，既為進一步精細定位、克隆相關主效候選基因并深入研究其調(diào)控機制奠定基礎，也為玉米基因組學研究提供重要的試驗材料和數(shù)據(jù)支持，有助于進一步深入解析玉米穗長遺傳調(diào)控機制。 雖然目前已有大量研究者利用不同作圖群體檢測了數(shù)百個穗長QTLs，但多為初定位，未經(jīng)多環(huán)境驗證其穩(wěn)定性，很難進一步克隆利用。 本研究以穗長性狀差異顯著的玉米自交系為親本，通過配制雜交組合，獲得F2代分離群體?；贔2代群體構(gòu)建高密度遺傳圖譜，結(jié)合多環(huán)境穗長表型數(shù)據(jù)，采用WinQTLCart2.5 中的復合區(qū)間作圖法對目標性狀QTL 進行定位，旨在對玉米穗長性狀進行遺傳剖析，研究穗長的遺傳機制，提供新的玉米穗長QTL 位點，為高產(chǎn)玉米新品種選育提供理論參考，加速玉米育種進程。

1 材料與方法

1.1 分離群體構(gòu)建及表型調(diào)查

2013 年夏以穗長差異顯著的玉米自交系SG5 和SG7 為試驗材料配制雜交組合，獲得F1代雜交種子，自交F1得到F2代種子。 2014 年冬在海南省三亞市的盤縣玉米育種試驗站種植由199株單株組成的F2分離群體，并自交，得到F2∶3家系。 2018 年和2019 年將F2∶3家系按穗行的方式，種植于盤縣玉米育種試驗站，采用完全隨機試驗設計，單行區(qū)，每個家系一行，每行15 株，行距和株距分別為0.50 m 和0.35 m，田間管理及水肥施用與當?shù)卮筇镉衩紫嗤?待果穗成熟收獲曬干后，用直尺測量穗基部到穗頂端的長度，即穗長。F2∶3家系穗長通過測量株行中間正常8 個果穗的平均值獲得。 表型數(shù)據(jù)錄入Microsoft Excel 表中保存，頻數(shù)分布圖及方差分析由SPSS 20.0 完成。

1.2 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL 定位

在玉米抽雄吐絲前，對兩個親本以及F2采取單株取樣。 剪取大小合適的葉片分別裝入帶有標記的離心管中，置于液氮罐后轉(zhuǎn)至冰箱-80 ℃保存待用。 DNA 提取、基因組測序、SNP 分型及高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的具體方法見前期研究[28]。 應用QTL Cartographer 2.5 的復合區(qū)間作圖法(CIM)的向前回歸模型進行穗長表型數(shù)據(jù)的全基因組掃描，步長1 cM，為避免遺傳信息遺漏，LOD 值設置為2.5；QTL 加性或顯性效應值為正表明QTL 的增加效應來自母本SG5，QTL 加性或顯性效應值為負則表明QTL 的增加效應來自父本SG7。 應用MapChart 2.32 軟件進行QTL 在染色體上的位置描述。 將多環(huán)境F2和F2∶3群體QTL定位結(jié)果進行比較，多環(huán)境重復表達的QTL 位點被認定為穩(wěn)定的QTL 位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 穗長性狀的統(tǒng)計分析

將2018、2019 年種植的F2∶3分離群體分別記為F2∶3-2018 和F2∶3-2019。 對F2、F2∶3-2018 和F2∶3-2019 三個環(huán)境穗長表型數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果(表1 和圖1)顯示，三個環(huán)境下，親本穗長表現(xiàn)穩(wěn)定，SG5 穗長為14.38 cm，SG7 穗長為12.72 cm；F2家系間穗長變異范圍為12.8 ～21.0 cm， 平均15.42 cm；F2∶3-2018 家系間穗長變異范圍為12.1～20.2 cm， 平均15.37 cm； F2∶3-2019 家系間穗長變異范圍為10.8 ～21.7 cm， 平均15.40 cm?？梢?，群體呈超親混合分布形式，家系間差異明顯，存在遺傳變異，該分離數(shù)據(jù)可以進行QTL 定位分析。

圖1 F2、F2∶3-2018、F2∶3-2019 群體穗長性狀頻次分布

表1 F2、F2∶3-2018 和F2∶3-2019 分離群體的玉米穗長性狀的統(tǒng)計分析 cm

2.2 QTL 定位結(jié)果

基于前期研究中構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜[28]，利用CIM 法，對多環(huán)境穗長表型數(shù)據(jù)進行QTL 定位。 從檢測結(jié)果(表2)看，在F2群體中共檢測到4 個QTL 位點qEL-1、qEL-2、qEL-3和qEL-4，分別位于第1、2、5、6 染色體上，其中，位于第1 染色體上的qEL-1具有最大的表型貢獻率，為24.0%，LOD 值為15.3；qEL-2具有最小的表型貢獻率，為3.0%，LOD 值7.2。 在F2∶3-2018中共檢測到4 個QTL 位點(qEL-1、qEL-2、qEL-3和qEL-5)，分別位于第1、2、3、5 染色體上，其中，位于第1 染色體上的qEL-1具有最大的表型貢獻率，為23.5%，LOD 值為16.6；qEL-2位于第2染色體，表型貢獻率最小，為4.2%。 在F2∶3-2019中共檢測到3 個QTL 位點(qEL-1、qEL-2、qEL-5)，分別位于第1、2、3 染色體上，其中，位于第1染色體上的qEL-1具有最大的表型貢獻率，為25.6%，LOD 值為15.3；qEL-2位于第2 染色體，其表型貢獻率最小，為3.9%。

表2 F2、F2∶3-2018 和F2∶3-2019 分離群體的玉米穗長性狀QTLs 定位結(jié)果

經(jīng)遺傳位置比對(圖2)，在F2、F2∶3-2018 和F2∶3-2019 三個環(huán)境下共定位到5 個穗長QTLs，其中，qEL-1和qEL-2在三個環(huán)境中重復被檢測到，qEL-3在F2和F2∶3-2018 兩個環(huán)境中被檢測到，qEL-5在F2∶3-2018 和F2∶3-2019 兩個環(huán)境中被檢測到，而qEL-4只在F2環(huán)境中被檢測到。

圖2 基于F2、F2∶3-2018 和F2∶3-2019 分離群體的玉米穗長QTLs 位置

可見，qEL-1和qEL-2為三環(huán)境穩(wěn)定表達QTLs。 從QTL 作用方式看，qEL-1表現(xiàn)為加性效應，其增效等位基因來自父本SG7；qEL-2表現(xiàn)為顯性效應，其增效基因來自父本SG7。

3 討論

遺傳圖譜的分子標記密度對QTL 準確定位及候選基因預測具有重大的理論價值。 分子標記密度低，分布不均勻，分子標記間的遺傳距離大，則定位到的QTL 之間距離過大，對QTL 定位準確性影響較大。 隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，全基因組測序逐漸被應用到QTL 定位中，SNP 分子標記借助于高通量基因分型技術(shù)，已在遺傳分析中得到廣泛應用。 同低密度遺傳連鎖圖譜相比，高密度遺傳連鎖圖譜具有眾多優(yōu)勢:首先，可以更準確地定位QTL 位置，縮小候選區(qū)間，提高QTL 定位的精度，同時，高密度遺傳連鎖圖譜還能夠檢測到更多的QTLs，提高檢測的靈敏性；其次，高密度遺傳連鎖圖譜可以提供更多的分子標記和候選基因信息，有助于篩選與目標性狀相關的候選基因，進一步了解基因功能和分子機制；此外，高密度遺傳連鎖圖譜可以加速分子育種進程，通過分子標記輔助育種，實現(xiàn)目標性狀的精準選育。 可見，高密度遺傳連鎖圖譜不僅能提高QTL 的檢測效率，還能提供與QTL 緊密連鎖的分子標記，用于分子標記輔助選擇。 前期研究中基于F2分離群體構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜[28]，為本研究QTL 定位提供了重組的分子標記數(shù)量，獲得了與目標QTL緊密連鎖的分子標記，為后期玉米穗長性狀精細定位奠定了堅實基礎。 應用構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜，我們分別在1、2、3、5、6 號染色體上檢測到玉米穗長QTLs，其最大表型貢獻率達到25.6%，位于第1 染色體上。 王幫太[7]、胡利宗[8]、Li[9]、霍冬敖[16]、李庭鋒[17]、呂學高[29]、周廣飛[30]等均在第1 染色體檢測到玉米穗長QTLs；王幫太[7]、Li[9]、湯繼華[11]、代國麗[14]、霍冬敖[16]等均在第2 染色體檢測到玉米穗長QTLs。 可見，1、2 號染色體是挖掘玉米穗長性狀的重要染色體，這與本研究在第1、2 染色體獲得三環(huán)境穩(wěn)定表達穗長QTLs 的結(jié)果一致。

多環(huán)境檢測能夠減少環(huán)境誤差的影響，提高QTL 檢測的準確性和可靠性，同時還能發(fā)現(xiàn)遺傳效應較小的QTL，提高檢測的靈敏性。 不同環(huán)境對同一性狀的影響不同，在不同環(huán)境中檢測QTL能夠驗證其效應是否一致和穩(wěn)定，排除偶然或環(huán)境干擾的影響，有助于進一步研究QTL 的表達規(guī)律和遺傳機制。 玉米大部分產(chǎn)量性狀QTL 為復雜的數(shù)量性狀，受環(huán)境影響較大，環(huán)境條件不同，產(chǎn)量性狀QTL 表達也不同，因此在多環(huán)境中被重復檢測到的QTL 可視為穩(wěn)定QTL，對于作物遺傳改良和分子育種具有重要的理論和實踐價值。

4 結(jié)論

本研究通過多環(huán)境QTL 檢測方法，以F2、F2∶3-2018 及F2∶3-2019 三環(huán)境穗長表型數(shù)據(jù)，結(jié)合高密度遺傳連鎖圖譜，從SG5 和SG7 的F2∶3群體中檢測到5 個控制玉米穗長QTLs，其中，qEL-1和qEL-2在三個環(huán)境中穩(wěn)定表達，且qEL-1具有超過20%的穩(wěn)定表型貢獻率；qEL-3和qEL-5均在兩個環(huán)境中被檢測到。 這些QTLs 可視為多環(huán)境穩(wěn)定表達位點，不僅可為玉米穗長性狀主效位點的精細定位、圖位克隆提供依據(jù)，同時可為玉米高產(chǎn)分子育種奠定理論基礎。