紅芪多糖通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路對(duì)異丙腎上腺素所致小鼠心肌肥厚的改善作用

陳啟艷，孫 媛，高春華，孟楚浛，隋海娟，于海英，張 玲*

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001； 2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001；3.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121001； 4.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 錦州 121001）

心肌肥厚是許多心血管疾病發(fā)展過(guò)程中一個(gè)重要的病理階段，持續(xù)性心肌肥厚最終會(huì)因心臟功能失常而出現(xiàn)心力衰竭，因此，探尋延緩或逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥厚的藥物已成為防治心力衰竭的重要策略之一。紅芪多糖是紅芪的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降血糖、抗腫瘤等多種藥理作用［1-3］。在心血管疾病方面，已有研究顯示紅芪多糖對(duì)糖尿病心肌病小鼠和急性心肌梗死大鼠的心肌損傷具有保護(hù)作用［4-5］，但對(duì)心肌肥厚是否存在影響未見(jiàn)報(bào)道。本次研究運(yùn)用異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO） 誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚模型，探討紅芪多糖對(duì)小鼠心肌肥厚的作用及相關(guān)信號(hào)通路的影響，以期為心肌肥厚的防治提供新的用藥方案。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)野生雄性C57BL/6N 小鼠，體質(zhì)量20～24 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司 ［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京）2021-0006］，飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （遼） 2019-0007］，環(huán)境溫度20～24 ℃、相對(duì)濕度50% ～56%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的所有操作均符合錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求（倫理號(hào)2022029）。

1.2 試劑 紅芪多糖 （ 純度 90%，批號(hào)20210508，甘肅益生祥生物技術(shù)有限公司）。ISO、普萘洛爾 （貨號(hào) I5627-5G、BCBB9359，美國(guó)Sigma 公司）； 游離脂肪酸（FFA）、腺苷三磷酸（ATP）、腺苷單磷酸（AMP） ELISA 試劑盒（貨號(hào)DY5848、DY4385-05、KGE011B，美國(guó)R＆D 公司）； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)R333-01，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）； 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、磷酸化-PI3K （p-PI3K） 一抗 （貨號(hào)ab182653、ab189401，英國(guó)Abcam 公司）； 蛋白激酶B （Akt）、磷酸化-Akt （p-Akt） 一抗 （貨號(hào)4691、4060，美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；β-actin （貨號(hào)210819，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 CISA-1000 計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)（北京大恒圖像視覺(jué)有限公司）； Pclab 生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（南京易美科技有限公司）； 光學(xué)顯微鏡及照相機(jī) （日本Olympus 公司）； Bio-Rad Model 1000/500 型電泳儀 （ 美國(guó) Bio-Rad 公司）；ChampGelTM3000 凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組 50 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、普萘洛爾組（40 mg/kg） 和紅芪多糖低、高劑量組 （60、120 mg/kg），每組10 只。普萘洛爾組灌胃給予40 mg/kg普萘洛爾； 紅芪多糖組灌胃給予60、120 mg/kg 紅芪多糖； 空白組和模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1 次，連續(xù)15 d。模型組和各給藥組均在灌胃藥物1 d 后開(kāi)始造模，前3 d 于小鼠背部皮下分別注射40、20、10 mg/kg ISO，第4 天皮下注射5 mg/kg ISO，持續(xù)10 d； 空白組小鼠皮下注射等量生理鹽水。

2.2 小鼠心臟指數(shù)測(cè)定 給藥結(jié)束后24 h，稱定小鼠體質(zhì)量； 取血處死后，開(kāi)胸取出心臟，剪去周圍血管及組織，生理鹽水洗盡殘血，濾紙吸干，稱定心臟質(zhì)量； 再剔除心房和右心室，稱定左心室質(zhì)量。計(jì)算全心指數(shù)（心臟質(zhì)量/體質(zhì)量） 和左心指數(shù)（左心室質(zhì)量/體質(zhì)量）。

2.3 Masson 染色觀察心肌組織形態(tài)變化 左心室心肌組織塊于4% 多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，制備組織切片，行Masson 染色，于光鏡下觀察，而后采用CISA-1000 計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)測(cè)定心肌細(xì)胞橫徑 （cardiomyocyte diameter，TDM） 和心肌膠原百分比 （cardiac ventricle fibrosis，CVF），每張切片隨機(jī)選取3 個(gè)視野，每個(gè)視野檢測(cè)10 個(gè)細(xì)胞。

2.4 ELISA 法檢測(cè)心肌組織FFA、ATP、AMP 水平 取出于液氮灌中凍存的心肌組織，加入預(yù)冷的RIPA 裂解液，勻漿，收集勻漿液于離心管中，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠心肌組織FFA、ATP和AMP 水平。

2.5 RT-qPCR 法檢測(cè)心肌組織ANP、BNPmRNA表達(dá) 取出于液氮灌中凍存的心肌組織，經(jīng)裂解、抽提、RNA 沉淀和清洗，提取心肌總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。通過(guò)Primer Bank 網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)引物序列，由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus） 試劑盒行RT-qPCR 反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算小鼠心肌組織ANP、BNPmRNA 表達(dá)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 Western blot 法檢測(cè)心肌組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá) 取100 mg 凍存的心肌組織，加入胞漿蛋白抽提試劑于勻漿器中充分勻漿，按試劑盒說(shuō)明書(shū)以BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），蛋白樣本經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜后，封閉液封閉1 h，加入稀釋的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 和β-actin 一抗，4 ℃雜交孵育過(guò)夜，洗滌后再加二抗進(jìn)行孵育，ECL 法顯影，通過(guò)Image J 軟件分析條帶灰度值，各目的蛋白表達(dá)量以內(nèi)參β-actin 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，有差別者組間兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法（LSD 法） 檢驗(yàn)； 偏態(tài)或方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅芪多糖對(duì)心肌肥厚小鼠心臟指數(shù)的影響由表2 可知，與空白組比較，模型組全心指數(shù)和左心指數(shù)均升高（P＜0.01），分別升高了19.75%和23.03%，說(shuō)明小鼠心臟指數(shù)增大，造模成功； 與模型組比較，紅芪多糖低、高劑量組和普萘洛爾組全心指數(shù)均降低（P＜0.05，P＜0.01），分別降低了5.26%、7.37% 和13.15%，左心指數(shù)均降低（P＜0.05，P＜0.01），分別降低了6.15%、9.36%和14.97%，表明紅芪多糖能抑制ISO 引起的小鼠心臟指數(shù)變大。

表2 各組小鼠心臟指數(shù)比較（mg/g，±s，n＝10）Tab.2 Comparison of mouse cardiac indices levels in each group （mg/g，±s，n＝10）

表2 各組小鼠心臟指數(shù)比較（mg/g，±s，n＝10）Tab.2 Comparison of mouse cardiac indices levels in each group （mg/g，±s，n＝10）

注： 與空白組比較，**P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別全心指數(shù)左心指數(shù)空白組4.76±0.283.04±0.21模型組5.70±0.32**3.74±0.24**紅芪多糖低劑量組5.40±0.31＃3.51±0.23＃紅芪多糖高劑量組5.28±0.26＃＃3.39±0.21＃＃普萘洛爾組4.95±0.31＃＃3.18±0.18＃＃

3.2 紅芪多糖對(duì)心肌肥厚小鼠心肌組織形態(tài)及TDM、CVF 值的影響 如圖1 所示，空白組小鼠心肌細(xì)胞未見(jiàn)明顯肥大及壞死，無(wú)膠原纖維增生； 與空白組比較，模型組可見(jiàn)小鼠心肌細(xì)胞變大，有局灶性壞死，膠原纖維呈大斑片狀增生（圖中綠色部分）； 與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和普萘洛爾組小鼠心肌細(xì)胞肥大程度減輕，心肌纖維排列較整齊，偶有點(diǎn)片狀壞死，膠原纖維增生較少，其中以普萘洛爾組小鼠心肌病變的改善程度最好，紅芪多糖高劑量組次之。

圖1 各組小鼠心肌組織形態(tài)變化（Masson，×200）Fig.1 Morphological changes of mouse myocardial tissue in each group （Masson，×200）

由表3 可知，與空白組比較，模型組小鼠TDM 和CVF 值升高 （P＜0.01），分別升高了29.13%和90.43%； 與模型組比較，紅芪多糖低、高劑量組和普萘洛爾組小鼠TDM 值降低 （P＜0.01），分別降低了7.06%、13.97% 和19.34%，CVF 值也降低（P＜0.01），分別降低了14.1%、25.93%和74.96%。

表3 各組小鼠TDM 和CVF 值比較（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of mouse TDM and CVF values in each group （±s，n＝10）

表3 各組小鼠TDM 和CVF 值比較（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of mouse TDM and CVF values in each group （±s，n＝10）

注： 與空白組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別TDM/μmCVF/%空白組10.09±0.523.34±0.58模型組13.03±0.59**17.77±1.34**紅芪多糖低劑量組12.11±0.56＃＃13.00±1.57＃＃紅芪多糖高劑量組11.21±0.49＃＃7.57±0.98＃＃普萘洛爾組10.51±0.52＃＃4.45±0.87＃＃

3.3 紅芪多糖對(duì)心肌肥厚小鼠心肌組織FFA、ATP、AMP 水平和ATP/AMP 比值的影響 由表4可知，與空白組比較，模型組小鼠心肌能量代謝利用底物FFA 水平升高（P＜0.01），反應(yīng)心肌能量生成水平的ATP、AMP 和ATP/AMP 比值降低（P＜0.01）； 與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和普萘洛爾組小鼠心肌組織FFA 水平降低 （P＜0.01），ATP、AMP 和ATP/AMP 值升高 （P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各組小鼠心肌組織FFA、ATP、AMP 水平和ATP/AMP 比值比較（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of FFA，ATP，AMP levels and ATP/AMP ratio in mouse myocardial tissue of each group （±s，n ＝10）

表4 各組小鼠心肌組織FFA、ATP、AMP 水平和ATP/AMP 比值比較（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of FFA，ATP，AMP levels and ATP/AMP ratio in mouse myocardial tissue of each group （±s，n ＝10）

注： 與空白組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別FFA/（nmol·L-1）ATP/（mg·g-1）AMP/（mg·g-1）ATP/AMP空白組10.09±0.520.49±0.040.74±0.030.70±0.06模型組13.03±0.59**0.21±0.03**0.48±0.05**0.45±0.06**紅芪多糖低劑量組12.11±0.56＃＃0.30±0.03＃＃0.60±0.06＃＃0.50±0.05＃紅芪多糖高劑量組11.21±0.49＃＃0.36±0.03＃＃0.64±0.04＃＃0.56±0.04＃＃普萘洛爾組10.51±0.52＃＃0.43±0.03＃＃0.69±0.05＃＃0.63±0.06＃＃

3.4 紅芪多糖對(duì)心肌肥厚小鼠心肌組織ANP、BNPmRNA 表達(dá)的影響 在心臟處于應(yīng)激狀態(tài)，心室肌牽張會(huì)釋放ANP 和BNP 以對(duì)抗心肌肥厚，因此ANP 和BNP 被認(rèn)為是心肌肥厚的重要標(biāo)志［6］。如圖2 所示，與空白組比較，模型組小鼠心肌組織ANP、BNPmRNA 表達(dá)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和普萘洛爾組小鼠心肌組織ANP、BNPmRNA 表達(dá)均降低 （P＜0.01）。

圖2 各組小鼠心肌組織ANP、BNP mRNA 表達(dá)比較（±s，n＝10）Fig.2 Comparison of ANP and BNP mRNA expressions in mouse myocardial tissue of each group （±s，n＝10）

3.5 紅芪多糖對(duì)心肌肥厚小鼠心肌組織PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組小鼠心肌組織p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)比值均降低（P＜0.01）； 與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和普萘洛爾組小鼠心肌組織p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)比值均有升高（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠心肌組織PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝5）Fig.3 Comparison of of PI3K and Akt protein expressions in mouse myocardial tissue of each group （±s，n＝5）

4 討論

神經(jīng)體液因素是引起心肌肥厚的多種因素之一。交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活，釋放的兒茶酚胺可激動(dòng)腎上腺素受體引起心肌肥厚。ISO 激動(dòng)β 受體可引起心肌細(xì)胞肥大、膠原纖維增生，故常作為基礎(chǔ)研究誘導(dǎo)心肌肥厚模型的藥物［7-8］。

全心指數(shù)是心肌肥厚的重要檢測(cè)指標(biāo)，左心指數(shù)更是人類心肌肥厚的診斷指標(biāo)［9］。心肌肥厚病理表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大和心肌間質(zhì)纖維化。心肌細(xì)胞表面積可以衡量心肌細(xì)胞肥大程度，間質(zhì)纖維化則會(huì)導(dǎo)致心室重構(gòu)進(jìn)而引起心律失常、心衰和猝死等。CVF 可反映膠原的沉積程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠全心指數(shù)和左心指數(shù)均較空白組增加； 心肌組織切片觀察和TDM、CVF 結(jié)果也證實(shí)了模型組小鼠心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)纖維化，說(shuō)明模型制備成功。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞能量代謝紊亂可能是導(dǎo)致心肌肥厚和心肌組織重構(gòu)的潛在機(jī)制［10］。ATP 作為細(xì)胞活力標(biāo)志，其水平高低可衡量心肌能量?jī)?chǔ)備狀態(tài)。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌細(xì)胞處于病理狀態(tài)下，ATP 和AMP 水平均會(huì)發(fā)生變化［11］，因此ATP/AMP 的改變是能量變化的綜合體現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ISO 可引起小鼠心肌細(xì)胞FFA 水平升高和ATP/AMP 比值降低，說(shuō)明模型小鼠心肌細(xì)胞已出現(xiàn)能量代謝紊亂、能量供應(yīng)及儲(chǔ)備不足情況。同時(shí)，ISO 還會(huì)使作為心肌肥厚標(biāo)志的ANP、BNPmRNA 表達(dá)升高，這些結(jié)果也間接反映了ISO 對(duì)心肌組織的不良影響。

本研究以“正氣虧虛” 為心肌肥厚的中醫(yī)病機(jī)［9］，運(yùn)用紅芪的“補(bǔ)氣升陽(yáng)、生津養(yǎng)血” 之功效［12］，觀察紅芪主要活性成分紅芪多糖對(duì)ISO 誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚模型的干預(yù)作用。結(jié)果表明，紅芪多糖可降低ISO 引起全心指數(shù)、左心指數(shù)、TDM和CVF 值的升高，改善心肌組織病理性改變，降低ISO 誘導(dǎo)的心肌組織FFA 水平和ANP、BNPmRNA 表達(dá)，提高ATP/AMP 比值。這些結(jié)果表明紅芪多糖可通過(guò)改善FFA 的氧化代謝、提高心肌組織能量供應(yīng)和儲(chǔ)備而使小鼠的心肌肥厚指標(biāo)趨于正常。

已有報(bào)道指出，ISO 可通過(guò)多條信號(hào)通路誘導(dǎo)心肌肥厚，PI3K/Akt 信號(hào)通路便是其中重要的一條［13］。作為一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，PI3K 可被胞外多種信號(hào)激活，其活性產(chǎn)物促使Akt 轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面活化，并進(jìn)一步磷酸化下游因子（多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等），發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化、凋亡等作用［14-16］，調(diào)控心肌細(xì)胞的生存和功能，進(jìn)而干預(yù)心肌肥厚［17-18］。它還是調(diào)控線粒體的通路之一，而線粒體是細(xì)胞的“能量供應(yīng)器”［19-20］。本研究顯示，ISO 能抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路中PI3K 和Akt 的磷酸化，而紅芪多糖可上調(diào)ISO 引發(fā)的p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 比值降低。

綜上所述，本次研究證實(shí)紅芪多糖對(duì)ISO 誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚具有改善作用，該作用可能與提升PI3K/Akt 信號(hào)通路活性有關(guān)。