鏈霉菌Streptomyces sp. FXP04全基因組測序分析

唐碧瑤 付學(xué)鵬

（齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，齊齊哈爾 161006）

鏈霉菌是具有復(fù)雜生長周期的有機化能、好氧型革蘭氏陽性放線菌（G+），在系統(tǒng)分類上歸為放線菌目，是放線菌中最為高等的一類菌群。鏈霉菌種類繁多，在陸地、海洋、極端環(huán)境以及一些生物體內(nèi)都有廣泛分布，其中主要分布在土壤環(huán)境中。其孢子抗逆性強、存活時間長，具有良好的分枝菌絲，能產(chǎn)生水溶性或脂溶性的色素。因為其復(fù)雜的生長發(fā)育周期，產(chǎn)生了多種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然代謝產(chǎn)物，其中產(chǎn)生大量的各式各樣的抗生素，目前在臨床應(yīng)用的抗生素約 2/3 來源于鏈霉菌屬［1］，包括井崗霉素、萬古霉素等。除抗生素外還包括抗腫瘤劑、殺蟲劑、酶抑制劑、色素及酶類，如幾丁質(zhì)酶、果膠酶、木聚糖酶和蛋白酶等［2］。例如Arasu 等［3］從海洋中分離出Streptomyces sp. AP?123鏈霉菌產(chǎn)生的聚酮類化合物對綠猴腎細(xì)胞和喉癌細(xì)胞有顯著毒性。Kim等［4］研究發(fā)現(xiàn)沙門氏鏈霉菌菌株KP1404能產(chǎn)生多烯類抗生素，抑制番茄枯萎病菌菌絲的生長，其拮抗效果與苯菌靈相當(dāng)。胡磊等［5］發(fā)現(xiàn)產(chǎn)水鏈霉菌和球孢鏈霉菌可明顯抑制由核盤菌引起的油菜菌核病，球孢鏈霉菌的防治機理可能是產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶部分分解油菜菌核。這些產(chǎn)物在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品、化工、環(huán)保等領(lǐng)域都有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ瑢θ祟惖纳a(chǎn)生活至關(guān)重要。因此，近幾十年來，關(guān)于鏈霉菌遺傳發(fā)育及代謝調(diào)控的研究備受重視。

Streptomyces sp. FXP04是本課題組在健康馬鈴薯根際土壤中分離的鏈霉菌菌株。該菌對致病疫霉P.infestans有很強的拮抗效果，對于作物生長具有良好的防病和促生［6-7］作用，表現(xiàn)出了較好的應(yīng)用前景，有作為生物農(nóng)藥的潛力。近年來，對于鏈霉菌的研究多集中在抗菌、促生、抗腫瘤等生物活性以及分離純化的表層上，而利用基因組測序技術(shù)研究和預(yù)測微生物代謝產(chǎn)物的種類、結(jié)構(gòu)和合成途徑成為了發(fā)掘鏈霉菌屬代謝產(chǎn)物的一種新方向。在自然情況下，鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的實際表達(dá)率并不高，應(yīng)用效果大大縮減。所以利用全基因組分析有助于人們對這種具有多種次級代謝物生產(chǎn)能力的鏈霉菌進行更深層次的研究。全基因組測序是針對未知基因組序列的物種進行個體全部基因組測序，具有測序覆蓋面廣、準(zhǔn)確性極高的技術(shù)優(yōu)勢［8］。在本研究中，利用Illumina HiSeq高通量測序平臺對FXP04的全基因組進行了測序。同時，進行了基因預(yù)測和基因序列的功能注釋以及次級代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測，利用生物信息學(xué)分析強調(diào)了天然產(chǎn)物生物合成在菌株應(yīng)用中的重要性，比較基因組學(xué)為FXP04的進化提供了見解，為揭示FXP04生防作用機制、功能基因的挖掘與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 Streptomyces sp. FXP04培養(yǎng)和基因組DNA的提取

FXP04菌株接種至Luria?Bertani（LB）培養(yǎng)基活化，28℃培養(yǎng) 4 d，挑取菌絲轉(zhuǎn)接至三角瓶液體培養(yǎng)基于 28℃、140 r/min 培養(yǎng) 4 d后，12 000 r/min 離心20 min 收集菌體送至華大基因公司進行de novo 測序分析。FXP04已于中國普通微生物菌種保藏管理中心進行保藏，保藏號為CGMCC No.16826。

1.2 全基因組測序

測序采用第三代 PacBio 平臺與第二代 Illumina平臺相結(jié)合的測序技術(shù)，得到的測序結(jié)果采用Glim?mer軟件對基因組進行編碼基因預(yù)測；TRF（Tandem Repeat Finder）軟件對串聯(lián)重復(fù)序列預(yù)測；通過軟件PHAST預(yù)測前噬菌體（Prophage）；利用相關(guān)軟件完成對非編碼RNA的預(yù)測，包括RNAmmer軟件預(yù)測rRNA、tRNAscan軟件預(yù)測tRNA區(qū)域和tRNA的二級結(jié)構(gòu)以及利用Infernal軟件與Rfam數(shù)據(jù)庫比對得到sRNA。測序結(jié)果再與GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、COG（Cluster of Orthologous Groups of Proteins）、VFDB（Virulence Factor Database）、ARDB（Antibiotic Resistance Genes Database）、CAZy（Carbohydrate?Active EnZymes Database）數(shù)據(jù)庫進行比對，完成蛋白序列功能注釋［9］。

1.3 比較基因組學(xué)分析

先通過FXP04的16S RNA序列比對，從中選取5種與其近緣關(guān)系相近且不同類型的模式菌株，從NCBI Genome上下載S. varsoviensis NRRL ISP?5346（GCF_000718635.1），S. diacarni LHW51701（GCF_003323715.1），S. celluloflavus NRRL B?2493（GCF_000720995.1），S. kasugaensis BCRC 12349（GCF_002261115.1），S. platensis DSM 40041（GCF_00211 9195.1）共5種模式菌株的全基因組序列，與FXP04全基因組序列一起進行以下比較基因組學(xué)分析。其中包括共有基因（Core Gene）和特有基因（Specif?ic Gene）分析［10］、基因家族（Gene Family）分析［11-13］，通過相關(guān)軟件進行聚類分析，根據(jù)基因集分布情況，繪制熱圖和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 次生代謝產(chǎn)物合成基因簇分析

將菌株FXP04的全基因序列采用antiSMASH（V6.1.1）軟件（https://antismash.secondarymetabolites.org/#!/ start）在線預(yù)測次級代謝產(chǎn)物合成基因簇，并結(jié)合 NCBI BLAST 比對分析結(jié)果［14］。

2 結(jié)果

2.1 菌株FXP04全基因組概況

本研究利用PacBio與Illumina 平臺相結(jié)合測序技術(shù)對FXP04基因組測序，共得到1 367 Mb的原始數(shù)據(jù)量，對原始數(shù)據(jù)過濾后得到1 141 Mb的數(shù)據(jù)量，K?mer預(yù)估其基因組大小為4.89 Mb（K?mer值為15，深度為37）。FXP04基因組大小為4 535 201 bp（圖1）［6］，共有5 037個基因，基因的總長度為3 674 928 bp，GC含量為72.95%，基因長度占基因組總長的81.03%。在菌株 FXP04的核基因組中，利用RNAmmer軟件［15］和tRNAscan軟件［16］對FXP04基因組的ncRNA進行預(yù)測分析，其中 rRNA有 3 種類型：3個5S rRNA、3個16S rRNA、3個23S rRNA，33個tRNA以及23個sRNA；利用 TRF軟件［17］對FXP04基因組的重復(fù)序列進行搜尋，結(jié)果顯示FXP04共有1 699個串聯(lián)重復(fù)序列，總長度為77 244 bp，大小為4-672 bp，其中含1 284個小衛(wèi)星 DNA，含188個微衛(wèi)星DNA；利用 PHAST軟件［18］對基因組進行前噬菌體預(yù)測的結(jié)果僅得到一個可疑的前噬菌體，其長度為34 291 bp。

圖1 菌株FXP04的全基因組Fig. 1 Whole genome of strain FXP04

2.2 基因功能注釋

2.2.1 VFDB數(shù)據(jù)庫注釋 將菌株FXP04的基因組與VFDB數(shù)據(jù)庫進行比對分析，在FXP04的全基因組中共發(fā)現(xiàn)139個毒力相關(guān)基因，其中最大基因序列為1 999 bp，最小基因序列為41 bp（表1）。通過比對發(fā)現(xiàn)基因序列主要在PDIM（二霉酚）和PGL（酚類糖脂）的生物合成和運輸（ddrA、pks15、ppsC基因）、ABC轉(zhuǎn)運蛋白（irtA、fbpC、fagA/B/C/D基因）、DevR/S雙組分系統(tǒng)（devR/dosR基因）、PhoP/R雙組分系統(tǒng)（phoP/R基因）4種功能中有較高的覆蓋度。ddrA基因編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白參與抗腫瘤藥物柔紅霉素合成，pks15基因編碼聚酮合酶，ppsC基因編碼β-酮?；厦福籪bpC、fagA/B/C/D基因與鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相關(guān)，irtA基因編碼跨膜ATP結(jié)合蛋白幫助藥物轉(zhuǎn)運進入細(xì)胞；devR/dosR基因和phoP/R基因都為雙組分系統(tǒng)調(diào)控因子，綜上說明菌株FXP04所注釋到的139個基因序列并非真正的毒力基因，且identity（一致性）≤70%，所以我們推測FXP04在與病原菌對抗中通過控制某些基因調(diào)節(jié)自身或共生生物體的生物學(xué)過程來發(fā)揮作用，也表明了FXP04被用作生物防治時是安全無害的。

2.2.2 ARDB數(shù)據(jù)庫注釋 通過ARDB數(shù)據(jù)庫的注釋可了解FXP04基因的潛在的抗生素耐受性，通過注釋結(jié)果找出了14個耐藥基因，基因長度介于100-480 bp之間，耐受藥物嘌呤霉素（Puromycin）、桿菌肽（Bacitracin）、氨基糖苷（Aminoglycoside）、四烯霉素c（Tetracenomycin_c）、抗菌物（Na_Antimicrobials）、氯霉素（Chloramphenicol）、鏈霉素（Streptomycin）、萬古霉素（Vancomycin）共8種，具體預(yù)測結(jié)果見表2。

表2 菌株FXP04在ARDB數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果Table 2 Annotation results of strain FXP04 in ARDB database

2.2.3 CAZy 數(shù)據(jù)庫注釋 將基因組序列與 CAZy 數(shù)據(jù)庫進行比對，發(fā)現(xiàn)菌株 FXP04的基因組中共有73個編碼蛋白結(jié)構(gòu)域歸于 CAZy 家族，其蛋白編碼基因分布狀況如下：糖苷水解酶（glycoside hydrolases,GHs）基因27個，糖類酯解酶（car bohydrate esterases, CEs）基因6個，糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferases, GTs）基因12個，碳水化合物酶相關(guān)模塊（carbohydrate?binding modules, CBMs）基因18個，輔助功能酶（auxiliary activities, AAs）基因7個，多糖裂合酶（polysaccharide lyases, PLs）基因3個。在糖苷水解酶中，覆蓋度最高的主要是葡聚糖酶（EC 3.2.1.70）。在碳水化合物酶相關(guān)模塊中，幾丁質(zhì)酶（EC 3.2.1.14）、β-1,4?木聚糖內(nèi)切酶（EC 3.2.1.8）等有較高的覆蓋度。在糖基轉(zhuǎn)移酶中，磷壁酸酶（EC 2.4.1.129）有著較高覆蓋度。在糖類酯解酶中D?葡萄糖醛酸酶（EC 3.1.1.?）也有比較高覆蓋度。

2.2.4 GO數(shù)據(jù)庫注釋 FXP04通過GO注釋，共有2 088個基因在GO數(shù)據(jù)庫中被注釋到，按照GO數(shù)據(jù)庫的分類方式，F(xiàn)XP04的基因組功能被分為31個分支（圖2）。其中有9個跟細(xì)胞組分有關(guān)，12個與生物學(xué)過程有關(guān)，10個與分子功能有關(guān)。在細(xì)胞組分中共有731個基因被注釋，其中與細(xì)胞膜、細(xì)胞膜部分有關(guān)的基因表現(xiàn)出最高相關(guān)性，各有306、160個；在生物學(xué)過程中共3 867個基因被注釋，與其細(xì)胞過程、代謝過程以及單有機體過程的基因表現(xiàn)出很高的相關(guān)性，各有831、1 193、752個；分子功能分支共2 531個注釋結(jié)果，其中涉及最多的基因與結(jié)合（binding）、催化活性（catalytic activity）有關(guān)，分別為925、1 261個。

圖2 菌株FXP04基因組的GO功能分類圖Fig. 2 GO functional classification map of strain FXP04 genome

2.2.5 COG數(shù)據(jù)庫注釋 將FXP04基因組中能編碼蛋白的基因與COG進行比對，得到FXP04的COG 功能數(shù)據(jù)分析結(jié)果如圖3所示。在 FXP04菌株有2 319個可以在 COG 數(shù)據(jù)庫中找到分類信息，包含COG數(shù)據(jù)庫功能的23類。主要涉及 General function prediction only（通用功能預(yù)測）345個，占功能注釋基因的14.88%；Transcription（轉(zhuǎn)錄）371個，占功能注釋基因的16%；Amino acid transport and metabolism（氨基酸的運輸與代謝）229個，占功能注釋基因的9.87%；Carbohydrate transport and metabolism（碳水化合物的運輸與代謝）205個，占功能注釋基因的8.84%；Signal transduction mechanisms（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)）198個，占功能注釋基因的8.54%，不同類型的基因執(zhí)行功能有所側(cè)重。

圖3 菌株FXP04基因組的COG功能分類圖Fig. 3 COG functional classification diagram of the genome of strain FXP04

2.2.6 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋 FXP04菌株共有1 530個基因在KEGG中被注釋，被分為6個分類31個功能條目（圖4）?；驍?shù)量占比最多的是與新陳代謝相關(guān)的。在KEGG注釋的代謝中，參與概述的基因有535個，輔因子和維生素的代謝130個，氨基酸代謝182個，碳水化合物代謝175個。

圖4 菌株FXP04基因組的KEGG功能分類圖Fig. 4 KEGG functional classification diagram of FXP04 genome

2.3 比較基因組學(xué)分析

2.3.1 共有基因和特有基因分析 通過 Core/Pan分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XP04與5個模式菌株的所有非冗余的 Pan Gene 數(shù)量為18 057個，長度為 5 710 958 bp；其中共有的Core Gene 數(shù)量為532 個，長度為180 719 bp；非共有的Dispensable Gene 數(shù)量為6 778個（圖5?B），長度為2 315 398 bp。通過Dispensable Gene同源關(guān)系熱圖（圖5?A）和Core Gene系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5?C）可看出，F(xiàn)XP04的基因組與S. varsoviensis NRRLISP?5346最為相似，其次是S. diacarni LHW51701和S. platensis DSM40041，與另外2 株模式菌株具有明顯的遺傳距離。

圖5 6個菌株之間基因組Core/Pan 分析結(jié)果Fig. 5 Genome Core/Pan analysis results among 6 strains

2.3.2 基因家族分析 基于6個菌株全基因組序列的 Gene Family分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XP04與S. varsoviensis NRRLISP?5346、S. diacarni LHW51701、S. platensis DSM40041等 6個菌株能夠聚類到Gene Family 的基因數(shù)量分別為 3 010 個、5 827個、5 287 個、5 974個、6 692個和6 376個，Gene Family 數(shù)量分別為 1 437個、2 469 個、2 294個、2 613 個、3 101個和3 019個；其中共有的 Gene Family 數(shù)量為 871個，各菌株特有的 Gene Family 數(shù)量分別為 25 個、25 個、24個、40個、9個、3個（圖6?A、圖6?B）。通過 Gene Fam?ily系統(tǒng)發(fā)育樹可看出，F(xiàn)XP04 菌株與 S. varsoviensis NRRLISP?5346聚類到同一分支，其次是S. diacarni LHW51701和S. platensis DSM40041，與另外2株菌株之間的遺傳距離約為0.45（圖6?C）。通過Gene Family和Core Gene系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)FXP04 菌株與S. varsoviensis NRRLISP?5346模式菌株的相似性最高，選取S. varsoviensis NRRLISP?5346的基因序列與FXP04進行共線性分析（圖7），結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果相同，但也存在倒位、缺失和重排等現(xiàn)象。

圖6 6個菌株之間基因組Gene family分析結(jié)果Fig. 6 Genome Gene family analysis results among 6 strains

圖7 FXP04與S. varsoviensis NRRLISP-5346共線性分析Fig. 7 Collinearity analysis between FXP04 and S.varsoviensis NRRLISP-5346

2.3.3 次生代謝產(chǎn)物基因簇分析 利用 anti SMASH（V6.1.1）［14］對FXP04基因組的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進行預(yù)測分析，結(jié)果（表3）表明該菌株基因組中預(yù)測到了13個次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因簇，分別為聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）基因簇3種、非核糖體多肽合成酶（non?ribosomal peptide synthase，NRPS）基因簇3種和萜烯類簇（Terpene）2種、芳基聚烯烴（arylpolyene）基因簇2種、套索肽（lassopeptide）基因簇1種、四氫嘧啶（ectoine）基因簇1種和尚未被定義出類型的基因簇1種。進一步將FXP04預(yù)測的13個基因簇與其中已知合成基因簇序列進行 BLAST 比對后發(fā)現(xiàn)，其中有些與參考基因簇表現(xiàn)為完全相似或高度相似的合成基因簇。Cluster 3與BGC0001742（Candidatus Streptomyces philanthi bv. Triangulum）來源的殺粉蝶菌素（piericidin A1）基因簇相似度達(dá)到100%；Cluster 8與BGC0002052（Streptomyces sp. ID38640）來源的四氫嘧啶（ectoine）基因簇相似度也達(dá)到100%； Cluster 13與BGC0002547來源的Youssoufene類合成基因簇的相似度達(dá)到了88%。據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)報道，基因簇分析中確定已知化合物的標(biāo)準(zhǔn)是基因簇與已報道基因簇之間的相似度≥85%。所以，上述基因簇與已知基因簇序列的相似度≥85% 時，由該基因編碼形成的化合物是已知的；即低于85% 時，可以推測出該基因中存在獨特的序列。如Cluster 5與BGC0000663（Streptomyces coelicolor A3（2））來源的何帕烯（Hopene）基因簇的相似度達(dá)到61%；Cluster 7與BGC0000368來源的Griseobactin基因簇相似度達(dá)到53%；Cluster 4與BGC0001110（Uncultured bacterium psy1）來源的羊海綿抑素（Psymberin/Irciniastatin B）基因簇的相似度達(dá)到31%；Cluster 1與BGC0002662來源的二聚化Piperazyl環(huán)肽Petrichorin A /Petrichorin B基因簇的相似度達(dá)到24%；Cluster 6與 BGC0000431來源的Stenothricin基因簇和Cluster 11與BGC0002591來源的Aurachin類基因簇的相似度都達(dá)到13%；Cluster 9與BGC0001764來源的s56?p1基因簇相似度達(dá)到11%，這些基因簇可能會合成新的抑菌物質(zhì)，有待于后續(xù)研究。除了上述的這些基因簇和一個尚未被定義出類型的基因簇，還有2個功能未知的基因簇（Cluster2、10）存在，說明菌株FXP04可能存在能合成新型抑菌物質(zhì)的潛力，對農(nóng)業(yè)的發(fā)展需求有著重要意義。

表3 次生代謝產(chǎn)物合成區(qū)域鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of synthetic regions of secondary metabolites

3 討論

Streptomyces sp. FXP04是從健康馬鈴薯根際土壤中分離的一株對致病疫霉具有明顯拮抗作用的鏈霉菌菌株［6］，且前期研究也發(fā)現(xiàn)其對水稻等作物有促生效果［7］。日常生活中常見的抗生素大多來自鏈霉菌，而傳統(tǒng)實驗和鑒定方法很難全面地分析鏈霉菌的作用機制，對此，深入研究FXP04在基因組層面的內(nèi)在原因有著重要意義。所以我們通過全基因組測序和生物信息學(xué)分析得到了FXP04的全基因組序列，確定了FXP04基因組大小為4 535 201 bp，共編碼5 037個基因，通過GO、KEGG、COG等數(shù)據(jù)庫比對分析，完成了FXP04基因組的注釋結(jié)果和數(shù)據(jù)整理。結(jié)果表明無論在GO、COG還是KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋中，菌株FXP04的基因功能多集中于氨基酸的轉(zhuǎn)運及代謝和碳水化合物的轉(zhuǎn)運及代謝。此外，在KEGG注釋中還發(fā)現(xiàn)53個基因與萜類和聚酮化合物的代謝相關(guān)，可能參與抗菌活性物質(zhì)的生物合成，例如，ncsB1（Gene636）、ncsB3（Gene2 206）為烯二炔類抗生素（biosynthesis of enediyne antibiotics）的生物合成基因［19］；tktA（Gene751）為芳香族氨基酸生物合成中心途徑的關(guān)鍵酶基因，糖肽類抗生素（glycopeptide antibiotics）幾乎都含有芳香族氨基酸，如萬古霉素等［20-21］。

碳水化合物在動物生長生產(chǎn)方面具有重要作用。在碳水化合物功能注釋結(jié)果中顯示，菌株FXP04基因組中含有與葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、β-1,4?木聚糖內(nèi)切酶、D?葡萄糖醛酸酶等相關(guān)的基因。β-1,4?木聚糖內(nèi)切酶、D?葡萄糖醛酸酶屬于木聚糖降解酶家族，木聚糖是僅次于纖維素存在于植物細(xì)胞壁的一種重要的異源多糖。葡聚糖酶屬纖維素酶家族，對纖維素的分解有著重要意義，幾丁質(zhì)廣泛存在于甲殼類動物的外殼、真菌的胞壁以及一些高等植物的細(xì)胞壁等，而菌株FXP04中存在的幾丁質(zhì)酶可以降解和破壞病原菌的外壁，從而起到防治作用，推測可能為其抑菌機理之一。

利用antiSMASH工具對菌株FXP04的次級代謝產(chǎn)物基因簇進行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)了10種已知的抗菌活性物質(zhì)合成基因簇，Hopene是合成具有巨大商業(yè)價值的生物活性物質(zhì)Hopanoids（何帕烷類）的重要前體，據(jù)相關(guān)報道何帕烷類化合物具有抗炎、抗菌等生理活性［22-24］；Psymberin也稱為Irciniastatin A，是一種聚酮酸的生物活性天然產(chǎn)物。Psymberin于2004年由Crews和Pettit的研究小組從海綿Psammocinia sp.中獨立發(fā)現(xiàn)，是一種有效的抗癌劑［25］；Petrichorin A是一種具有抗癌、抗腫瘤活性的二聚化Piperazyl環(huán)肽［26］；Griseobactin是一種具有兒茶酚肽結(jié)構(gòu)的鐵載體，在2010年P(guān)atzer等［27］發(fā)現(xiàn)由鏈霉菌屬ATCC 700974和幾種灰鏈霉菌株合成的，參與灰霉菌素的合成需求；s56?p1是一種具有獨特的肼單元的二肽天然產(chǎn)物，s56?p1生物合成基因簇是第一個被確定為負(fù)責(zé)含肼類天然產(chǎn)物生物合成的基因簇［28］；Aurachin是各種細(xì)胞色素復(fù)合體的抑制劑，具有強大的抗菌、抗真菌和抗瘧原蟲藥物［29-30］。上述7種活性物質(zhì)與已知基因簇相似度低，推測可能合成新的活性物質(zhì)，對于鏈霉菌屬的潛在的天然產(chǎn)物開采提供理論，對于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用有著重要的研究意義。同時，通過預(yù)測得到的已確定的3種活性物質(zhì)，包括Youssoufene、四氫嘧啶、殺粉蝶菌素，四氫嘧啶（Ectoine）可以幫助微生物適應(yīng)在高鹽、高滲透壓和紫外輻射等逆境中正常生長［31］，使得促生菌株在惡劣氣候下能在根系或根際穩(wěn)定繁殖。Youssoufene化合物是含有肉桂酰基團的天然產(chǎn)物，對于Youssoufene化合物的報道較少，但肉桂?；惢衔镉兄鴱V泛的生理活性，包括抗菌和抗結(jié)核活性等［32］。殺粉蝶菌素（Piericidin A1）最早由日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，是一種具有良好生物活性的 α-吡啶酮類天然產(chǎn)物，后來在多個鏈霉菌中都有發(fā)現(xiàn)［33-34］。其可能是線粒體呼吸作用抑制劑，對多種生物具有較強的生物活性。首先，殺粉蝶菌素 A1 對蠶、菜青蟲有很顯著的殺蟲效果［35］，對多種癌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞也有很好的生長抑制作用［36-37］。其次，殺粉蝶菌素對多種病原真菌和粘紅酵母等也有很強的抑制活性［38］。最后，何亞文等［39］發(fā)現(xiàn)殺粉蝶菌素A1 對水稻白葉枯菌的生長有較強的抑制作用，在溫室條件下噴施殺粉蝶菌素A1能夠減輕白葉枯癥狀。而且在我們前期研究中已經(jīng)對FXP04的次生代謝物進行純化，與殺粉蝶菌素標(biāo)品對比出的抑菌效果相同［6］，進一步說明菌株FXP04有抗菌、抗蟲、抗腫瘤以及促生長的潛力。

通過以上的數(shù)據(jù)結(jié)果分析，我們了解了菌株FXP04的全部基因組序列信息，發(fā)現(xiàn)其屬于天然小基因組，其中存在有3種重要的次級代謝產(chǎn)物基因簇和7種有望合成新型抑菌物質(zhì)的抗生素基因簇，極可能挖掘出結(jié)構(gòu)新穎、活性更強、靶向性更好的天然藥物用于臨床研究；而且據(jù)相關(guān)報道表明鏈霉菌基因組中含有大量的冗余基因，其中就包括次級代謝合成基因簇、可移動元件等［40］，它們是菌株正常生長發(fā)育中非必需的，可以通過大規(guī)模刪除冗余基因用于構(gòu)建高版本工業(yè)底盤細(xì)胞，用作天然產(chǎn)物基因的異源表達(dá)；其次對于殺粉蝶菌素的抑菌效果有了初步了解，后期將通過預(yù)測到的殺粉蝶菌素的合成途徑進行超表達(dá)和構(gòu)建缺失突變體，以驗證其在FXP04中的地位，同時也為通過遺傳技術(shù)獲取高產(chǎn)殺粉蝶菌素的菌株提供理論基礎(chǔ)，有待于對Streptomyces sp. FXP04的次級代謝產(chǎn)物進行后續(xù)研究與應(yīng)用。

4 結(jié)論

通過Illumina和PacBio平臺相結(jié)合的測序技術(shù)，對鏈霉菌Streptomyces sp. FXP04進行全基因組測序，獲得了菌株FXP04的全部基因組序列信息。分析結(jié)果可知FXP04基因組大小僅為4.5 M，屬天然的小基因組，后續(xù)可以構(gòu)建成高版本工業(yè)底盤細(xì)胞用作天然產(chǎn)物基因的異源表達(dá)，滿足微生物藥物工業(yè)化生產(chǎn)需求，發(fā)揮其應(yīng)用潛力。