Loop B3對GH7內(nèi)切纖維素酶功能的影響機制

楊俊釗 張新蕊 孫清揚 鄭菲

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

糖苷水解酶第七家族纖維素酶（glycoside Hydrolases family 7, GH7）在天然生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和降解中具有重要作用，因此一直是許多研究的熱點。在GH7中，主要包含外切纖維素酶和內(nèi)切纖維素酶兩大類，其中，內(nèi)切纖維素酶全部來自真菌，作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解分子內(nèi)部的β-1,4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子切割成短鏈［1］；外切纖維素酶作用于纖維素鏈的還原/非還原性末端，將短鏈的纖維素分子切成纖維二糖［2］。目前，對GH7的研究主要集中在外切纖維素酶方面，而對內(nèi)切纖維素酶的關(guān)注相對較少。CAZymes數(shù)據(jù)庫（carbohydrate?active enzymes, CAZymes）已被收錄的具有性質(zhì)報道的GH7內(nèi)切纖維素酶僅有27個，大多在50-60℃和pH 4.0-5.0顯示出最大酶活力［3-6］。根據(jù)PDB數(shù)據(jù)庫（protein data bank, PDB）中收錄的5個GH7內(nèi)切纖維素酶晶體結(jié)構(gòu)［ThCel7B（Trichoderma harzianum CBS 226.95, PDB ID: 5W0A）、TrCel7B（Trichoderma reesei, PDB ID :1EG1）、ReCel7B（Rasamsonia emersonii CBS 394.64, PDB ID: 6SU8）、FoCel7B（Fusarium oxysporum, PDB ID:1OVW）和HiCel7B（Humicola insolens, PDB ID:6YOZ）］［7-11］可知，GH7內(nèi)切纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域是由6個loop區(qū)（A1、A2、A3、B1、B3和B4）圍繞反向平行的β-折疊形成的β-三明治結(jié)構(gòu)［12］。GH7內(nèi)切纖維素酶中共有9個底物結(jié)合位點（?7 -+2）［13］。其中，loop A1和B1位于底物結(jié)合位點?7- ?4處，loop A3和B3位于催化活性中心附近，loop B4位于產(chǎn)物出口處［11］。由于覆蓋在催化口袋的loop較短，尤其是loop A3和loop B3的長度不能夠完全包裹催化中心，使得活性中心更加暴露。

研究表明，催化口袋周圍的loop參與酶的催化、底物結(jié)合過程，同時對酶的熱穩(wěn)定性也起著重要作用［14］。例如，GH12內(nèi)切纖維素酶NfEG12A具有較長的loop 3結(jié)構(gòu)，通過改變loop結(jié)構(gòu)的長度，加強了底物和酶之間的氫鍵相互作用，從而提高了產(chǎn)物分子的轉(zhuǎn)化率［15］。將GH5纖維素酶GtCel5 loop 6上的天冬酰胺Asn進(jìn)行飽和突變后，篩選到N233G突變體的比活值及催化效率較野生型顯著提高［16］。此外，loop結(jié)構(gòu)對酶的熱穩(wěn)定性也起到重要作用，有研究人員將幾丁質(zhì)酶BcChi?A的loop?III截斷后，其Tm值下降10℃［17］。GH7外切酶與內(nèi)切酶的loop區(qū)具有類似的結(jié)構(gòu)，在GH7外切纖維素酶中，loop結(jié)構(gòu)參與酶的催化過程。研究人員將TrCel7A與纖維四糖、纖維戊糖和纖維己糖的復(fù)合物分別共結(jié)晶，觀察到3個復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的loop B3區(qū)均參與底物的結(jié)合過程，且在催化過程中顯示出較高的柔性［18］。研究人員通過截斷TrCel7A loop B3中的8個殘基（245GTYSDNRY252），驗證得出酶對結(jié)晶纖維素的活性降低了50%，這表明loop B3是GH7酶催化的一個重要組成部分［19］。盡管有部分研究的關(guān)注點在GH7外切酶的loop區(qū)上，但對于內(nèi)切纖維素酶loop區(qū)的功能仍缺乏相關(guān)研究。經(jīng)分析，在GH7內(nèi)切纖維素酶loop區(qū)中，loop B3位于催化中心附近［11］，其氨基酸序列長度可分為兩種類型：一類是包含18個氨基酸殘基的長鏈型；另一類是包含4個氨基酸的短鏈型。據(jù)研究顯示，大多數(shù)耐熱性能比較好的GH7內(nèi)切纖維素酶均包含短鏈型的loop B3結(jié)構(gòu)［3-5,11］。為了探究loop B3在GH7內(nèi)切纖維素酶中的影響效果及其機制，本文以嗜熱毀絲菌M.thermophila來源的GH7纖維素酶MtCel7b為核心研究材料，通過截短其長鏈loop B3中的14個氨基酸殘基（216GPYLCEGAECEFDG229），構(gòu)建B3cut突變體，并分析比較突變體與野生型之間在酶催化效率及熱穩(wěn)定性方面的差異，為GH7內(nèi)切纖維素酶loop區(qū)的功能研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因和載體 Mtcel7b 基因編碼序列由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成；克隆宿主大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli Trans1?T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，用于目的基因的克隆。表達(dá)質(zhì)粒pPIC9和表達(dá)宿主畢赤酵母Pichia pastoris GS115購自美國Invitrogen生命技術(shù)有限公司，用于表達(dá)載體的構(gòu)建和外源基因的表達(dá)。

1.1.2 主要試劑與儀器 無縫克隆與重組試劑盒、快速凝膠提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉購自賽默飛世爾科技公司；底物羧甲基纖維素鈉（CMC?Na）、地衣多糖、大麥葡聚糖購自Sigma?Aldrich。瓊脂糖購自Biowest公司、YNB購自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司。D?無水葡萄糖和瓊脂粉均購自博奧拓科技有限公司。

PCR儀，Bio?Rad T100型梯度PCR儀分子擴增儀；蛋白電泳儀，DYY?8C電腦三恒多用電泳儀；培養(yǎng)箱，一恒Blue pard經(jīng)濟型生化培養(yǎng)箱；分子過濾膜包，賽多利斯回旋流切向流超濾器超濾膜包VF20P4；酶標(biāo)儀，瑞士Tecan M200 PRO多功能酶標(biāo)儀；蛋白純化儀，?KTA Pure；核酸蛋白測定儀，賽默飛NanoDrop2000超微量分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 序列與結(jié)構(gòu)分析 使用ExPASy?ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白的理論分子量和等電點進(jìn)行分析，使用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/servi Ces/Signa LP/）對蛋白的信號肽進(jìn)行預(yù)測，利用BLASTp（Basic Local Alignment Search Tool protein）對蛋白序列進(jìn)行同源性分析，利用Smart（http://smart.embl?heidelberg.de/）對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，利用AlphaFold2對蛋白質(zhì)建模。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與提取 將目的基因Mtcel7b重組至pPIC9表達(dá)質(zhì)粒EcoR I/Not I克隆位點處，利用熱激法轉(zhuǎn)化至Escherichia coli Trans1?T1細(xì)胞中，后涂布于固體LB培養(yǎng)基［0.5%酵母浸粉（W/V），1%胰蛋白胨（W/V），1%氯化鈉（W/V），1.5%瓊脂粉（W/V）］上，37℃倒置培養(yǎng)。12 h后挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗證并送測序，后將測序正確的克隆子接入到液體LB培養(yǎng)基［0.5%酵母浸粉（W/V），1%胰蛋白胨（W/V），1%氯化鈉（W/V）］中，在37℃條件下培養(yǎng)12 h，然后提取質(zhì)粒。突變體B3cut的構(gòu)建是以Mtcel7b為模板，以MtCel7b?F1′（5′?GA GAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC?3′），MtCel7b?R1′（5′?AGGCGAATTAATTCGCGGCCGC?3′）；B3cut?F2′（5′?CTCATCCTTGTTCCAAGGCTGTATGTGATAAGAA TGGTTGCGCCTG?3′），B3cut?R2′（5′?CAACCATTCTTA TCACATACAGCCTTGGAACAAGGATGAGGAG?3′）為兩組特異性引物進(jìn)行PCR擴增，利用overlap PCR方法獲得突變體基因的全長。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃終延伸5 min；4℃保存。質(zhì)粒提取方法同Mtcel7b。

1.2.3 蛋白的表達(dá)與純化 重組質(zhì)粒pPIC9?Mtcel7b用限制性內(nèi)切酶Dra I線性化處理，經(jīng)核酸電泳純化后回收線性化產(chǎn)物，通過電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布在固體MD培養(yǎng)基［1.5%瓊脂糖（W/V），2%葡萄糖（W/V），滅菌后加入1.34% YNB（W/V），4×10-4生物素（W/V）］上。在30℃倒置培養(yǎng)48 h后，篩選出重組轉(zhuǎn)化子。用牙簽隨機挑選48個克隆子，在固體MD平板上點種，并在30℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48 h。同時，將牙簽挑取的克隆子接種于含有3 mL BMGY培養(yǎng)基［1%酵母浸粉（W/V），2%胰蛋白胨（W/V），1%甘油（W/V），滅菌后加入1.34% YNB，4×10-4生物素（W/V）］的酵母管中。在30℃，200 r/min培養(yǎng)48 h后離心去除上清液，菌體用1 mL BMMY培養(yǎng)基［1%酵母浸粉（W/V），2%胰蛋白胨（W/V），滅菌后加入1.34% YNB，4×10-4生物素，0.5%甲醇（V/V）］重懸，誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后離心收集上清液。利用3,5?二硝基水楊酸（DNS）法測定酶活，并用SDS?PAGE檢測是否表達(dá)出目的蛋白。將篩選出的高活性陽性克隆子接種至30 mL YPD液體培養(yǎng)基［1%酵母浸粉（W/V），2%胰蛋白胨（W/V），2%葡萄糖（W/V）］中，30℃，200 r/min培養(yǎng)48 h后，以 0.5%（V/V）的接種量接種至BMGY液體培養(yǎng)基中。30℃，200 r/min培養(yǎng)48 h后，收集菌體轉(zhuǎn)移至BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h，每隔24 h補加一次甲醇［0.5%（V/V）］。48 h后收集上清液，利用10 kD膜包濃縮至15 mL體積后進(jìn)行脫鹽處理，脫鹽處理后的酶液加入到平衡后的HiTrap QXL陰離子交換層析柱中，在10 mmol/L的pH 8.0的Tris?HCl緩沖液中，使用0-1 mol/L NaCl進(jìn)行線性梯度洗脫，收集相應(yīng)的峰所對應(yīng)的蛋白并進(jìn)行酶活性的測定和SDS?PAGE分析。

1.2.4 酶活力的測定 纖維素酶的酶活性測定采用DNS法，具體反應(yīng)體系為50 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入到450 μL底物中，恒溫中反應(yīng)10 min，后加入750 μL DNS 終止反應(yīng)，沸水煮5 min后立即置于冷水中冷卻至室溫。從反應(yīng)體系中吸取250 μL在540 nm下測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)酶活值，每組實驗設(shè)置3個重復(fù)。酶活定義為：在酶的最適條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1個單位（U）。

2014年11月10日晚，參加北京APEC會議的各國領(lǐng)導(dǎo)人攜配偶在歡迎晚宴前現(xiàn)身，身著特色中式服裝合影的他們，吸引了全世界的目光。國家主席習(xí)近平說：“看到各位都穿上中國式服裝，既充滿中國傳統(tǒng)元素，又體現(xiàn)了現(xiàn)代氣息，讓我們更感親近，中國老百姓看了以后也會感到親切，就像到鄰居家串門。尤其是女裝，女士穿上更顯秀美！”

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.5.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性的測定 將純化后的酶進(jìn)行適當(dāng)稀釋，選擇10 mg/mL CMC?Na作為底物，溫度范圍設(shè)定為40-70℃，重組酶在最適pH條件下反應(yīng)10 min，測定酶活。將最高酶活性設(shè)置為100%，并計算其他溫度下的活性作為相對值（%），并繪制最佳溫度趨勢圖。將重組酶分別在70、80和90℃下分別孵育2、5、10、30和60 min后，在最適條件下測定酶活力。以未處理酶液的酶活值作為100%，計算各時間點和溫度點下的相對酶活值并繪制溫度穩(wěn)定性趨勢圖。

1.2.5.2 最適pH及pH穩(wěn)定性的測定 重組酶和底物（10 mg/mL CMC?Na）分別用不同pH緩沖液（pH 3.0-7.0：100 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉；pH 8.0-9.0：100 mmol/L Tris?鹽酸；pH 10.0-12.0：100 mmol/L 甘氨酸-氫氧化鈉）進(jìn)行稀釋，將重組酶放置在最適溫度條件下反應(yīng)10 min，測定各pH條件下的剩余酶活。以酶活最高的pH條件下的酶活值作為100%繪制最適pH和pH穩(wěn)定性趨勢圖。

1.2.5.3 比活值測定 以450 μL的10 mg/mL CMC?Na、10 mg/mL大麥葡聚糖、10 mg/mL地衣多糖為底物，分別向其中加入50 μL適當(dāng)稀釋的酶液，在重組酶最適條件下反應(yīng)10 min，測定重組酶的比活值。

1.2.5.4 動力學(xué)常數(shù)的測定 以濃度范圍為4-20 mg/mL的CMC?Na為底物，反應(yīng)體系包含450 μL的底物和50 μL的酶液，在最適條件下反應(yīng)5 min，測定酶活性。利用雙倒數(shù)法作圖并計算得到Km、Vmax、kcat及kcat/Km的值。

1.2.5.5 耐鹽性和鹽穩(wěn)定性的測定 重組酶耐鹽性的測定是將CMC?Na溶于不同濃度的NaCl（1-4 mol/L）溶液中，在最適條件下，與適當(dāng)稀釋的酶液孵育10 min，測定剩余酶活力。在測定酶的鹽穩(wěn)定性時，將重組酶與不同濃度的NaCl（1-5 mol/L）混合后在37℃下共同孵育1 h，后取50 μL孵育后的酶液與450 μL CMC?Na在最適條件下反應(yīng)10 min。以酶活最高的鹽濃度條件下的比活值為100%繪制耐鹽性和鹽穩(wěn)定性趨勢圖。

2 結(jié)果

2.1 序列與結(jié)構(gòu)分析

來源于M. thermophila的GH7內(nèi)切纖維素酶編碼基因Mtcel7b（GenBank Accession No.：XP_003664606.1）核苷酸序列全長為1 368 bp，編碼456個氨基酸，前20個氨基酸為信號肽序列，其去除信號肽后的理論分子量為47.2 kD，等電點為4.75。MtCel7b的結(jié)構(gòu)預(yù)測模型表明（圖1?A），MtCel7b的結(jié)構(gòu)與其他GH7家族纖維素酶一樣，由6個loop區(qū)圍繞反向平行的β-折疊形成的β-三明治結(jié)構(gòu)。多序列比對結(jié)果（圖1?B）顯示，E194、D196、E199為催化三聯(lián)體，其中，E194和E199分別作為親核試劑和酸/堿試劑催化糖苷鍵斷裂（編號不包括信號肽序列）。MtCel7b的loop B3比其他短鏈的內(nèi)切纖維素酶多出14個氨基酸殘基。MtCel7b長鏈的loop B3額外形成了一個β-折疊片和一個α-螺旋結(jié)構(gòu)。

圖1 MtCel7b結(jié)構(gòu)模擬（A）及氨基酸序列對比（B）Fig. 1 Structural simulation（A）and amino acid sequence alignment（B）of MtCel7b

2.2 MtCel7b及其突變體的表達(dá)和純化

SDS?PAGE結(jié)果顯示（圖2），野生型MtCel7b與突變體B3cut的表觀分子量均大于其理論分子量（MtCel7b: 47.2 kD；B3cut: 45.7 kD）。經(jīng)預(yù)測，野生型與突變體均包含3個N糖基化位點，可能是造成表觀分子量大于理論分子量的原因之一。

圖2 野生型MtCel7b和突變體B3cut的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

2.3 MtCel7b及其突變體的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性分析 在pH 5.0條件下測定野生型及突變體在不同溫度（40-70℃）下的酶活力，由圖3?A可知，MtCel7b的最適溫度為60℃，在40-60℃之間的酶活力均在80%以上。將MtCel7b分別在70、80和90℃下孵育，檢測其剩余酶活力（圖3?D-F）。結(jié)果表明，MtCel7b具有良好的耐熱性，在80℃和90℃條件下處理5 min后，剩余酶活仍保持在80%以上（圖3?E, F）。此外，MtCel7b在90℃孵育1 h后仍可檢測到40%以上的酶活性。突變體B3cut的最適溫度為50℃，整體趨勢較野生型變窄（圖3?A）。突變體在70、80和90℃的熱穩(wěn)定性較野生型提高，尤其在90℃孵育1 h后，其剩余酶活高達(dá)56%（圖3?F）。

圖3 野生型MtCel7b及突變體B3cut的酶學(xué)性質(zhì)Fig. 3 Enzymatic properties of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

2.3.2 最適pH及pH穩(wěn)定性分析 在pH 3.0-9.0范圍內(nèi)測定最適pH值（圖3?B）。MtCel7b的最適pH為5.0，在pH 5.0-6.0范圍內(nèi)保留大約80%以上的酶活性。B3cut與野生型一致均在pH 5.0下表現(xiàn)出最佳酶活性，但突變體的pH耐受范圍縮?。▓D3?B）。在pH 4.0時，野生型的相對酶活性高達(dá)79%，而突變體的相對酶活性為40%。此外，MtCel7b和突變體B3cut在pH 4.0-12.0穩(wěn)定性較好，在37℃下處理1 h后，仍然具有90%以上的酶活（圖3?C）。

2.3.3 耐鹽性和鹽穩(wěn)定性分析 在0-4 mol/L和0-5 mol/L NaCl中，測定了耐鹽性和鹽穩(wěn)定性。在耐鹽性方面，MtCel7b的相對比活隨著底物中鹽濃度的增加而逐漸降低（圖4?A），即當(dāng)2 mol/L時，MtCel7b的相對比活值為55%，而當(dāng)?shù)孜镏宣}濃度增加至4 mol/L時，MtCel7b的相對比活值下降至37%。鹽穩(wěn)定性檢測中，當(dāng)酶液分別與0-5 mol/L NaCl緩沖液孵育1 h后，其野生型的比活值保持恒定，具有穩(wěn)定的耐鹽性（圖4?B）。進(jìn)一步分析顯示，雖然突變體B3cut經(jīng)過0-5 mol/L NaCl溶液分別處理后的活性變化趨勢與野生型一致，但是其在不同濃度下的相對比活值明顯高于野生型，說明突變體B3cut在0-5 mol/L NaCl的濃度下穩(wěn)定性更好。

圖4 野生型MtCel7b及突變體B3cut的耐鹽性（A）與鹽穩(wěn)定性（B）Fig. 4 Halo tolerant（A）and halo stability（B）of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

2.3.4 比活性和動力學(xué)分析 以10 mg/mL CMC?Na、大麥葡聚糖和地衣多糖為底物測定MtCel7b及其突變體的比活性。MtCel7b水解CMC?Na、大麥葡聚糖和地衣多糖的比活值分別為（38 ± 2）、（790 ± 1）和（493 ± 10）U/mg（圖5）。突變體B3cut表現(xiàn)出與野生型相似的底物偏好，但B3cut水解這3種底物的比活值分別降低至（25 ± 1）、（255 ± 1）和（130± 3）mg/mL，較野生型降低了34%-74%。

圖5 野生型MtCel7b及突變體B3cut的比活值Fig. 5 Specific viabilities of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

以4-20 mg/mL CMC?Na作為底物，在最適反應(yīng)條件下測定酶的動力學(xué)參數(shù)。MtCel7b的Km和Vmax值分別為（8.8 ± 0.8）mg/mL和（143± 7）μmol/（min·mg），kcat/Km為（12.8 ± 0.1）mL/（mg·s）。與野生型相比，突變體的Vmax［（69± 8）μmol/（min·mg）］較野生型降低52%，催化效率［（4.9 ± 0.6）mL/（mg·s）］比野生型低約62%，并且突變體對底物的親和力減弱［Km=（10.9± 3.3）mg/mL］。

2.4 分子動力學(xué)模擬分析

根據(jù)圖6的RMSD的結(jié)果來看，MtCel7b與突變體在50 ns后達(dá)到平衡，平均RMSD值均為2.0 ?。MtCel7b與突變體均在loop區(qū)域表現(xiàn)出相似的RMSF趨勢，波動越大，顯示出loop區(qū)的靈活性越強。突變體中與loop B3相鄰的257-266位殘基的RMSF值增加到5 ?，而野生型相應(yīng)位置的RMSF值僅為2 ?（藍(lán)色虛線框）。說明截短loop B3后，會影響相鄰結(jié)構(gòu)的波動情況。

圖6 野生型MtCel7b及突變體B3cut的均方根偏差和均方根波動圖Fig. 6 RMSD and RMSF of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

圖7?A, B的主成分分析圖說明野生型與突變體均具有5種不同的狀態(tài)，分別以不同顏色顯示。野生型的樣點分布分散，表明每種狀態(tài)之間的相似性較低，結(jié)構(gòu)變化較大。但是，突變體狀態(tài)內(nèi)與狀態(tài)之間的聚類情況良好，樣點分布更加集中，狀態(tài)間有較好的區(qū)分，說明其在100 ns分子動力學(xué)模擬過程中構(gòu)象相對穩(wěn)定。提取分子動力學(xué)模擬的平均結(jié)構(gòu)用于進(jìn)一步分析，根據(jù)預(yù)測蛋白活性口袋大小的在線網(wǎng)站POCASA（http://altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/）計算得到野生型MtCel7b和突變體B3cut活性口袋的體積分別為2 799 ?3和1 078 ?3，野生型的口袋體積大概是突變體的2.5倍（圖7?C,D）。圖7?E, F顯示，B3cut的loop A3（351GDN353）和loop B1（W52）均向催化活性中心移動，導(dǎo)致其催化通道較野生型更加密閉。從平均結(jié)構(gòu)看出，野生型的loop B3周圍有一個復(fù)雜的氫鍵相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖7?E）。C225主鏈羧基O和主鏈氨基H分別與K233側(cè)鏈氨基HZ2和G222主鏈羰基O形成側(cè)鏈-主鏈氫鍵和主鏈氫鍵，并且C225還與C220的巰基形成二硫橋。在復(fù)雜的氫鍵網(wǎng)絡(luò)的控制下，K233側(cè)鏈氨基HZ3和主鏈氨基H分別與E226主鏈羰基O和C231主鏈羰基O形成側(cè)鏈 - 主鏈氫鍵和主鏈氫鍵。然而，由于loop B3截短，K233失去周圍氫鍵束縛，導(dǎo)致其側(cè)鏈扭轉(zhuǎn)了120°，并且側(cè)鏈氨基HZ2與催化殘基E194的側(cè)鏈羧基OE1形成鹽橋，并且K233的主鏈氨基H和D232側(cè)鏈羧基OD2形成新的側(cè)鏈-主鏈氫鍵，使兩個催化殘基（E194、E199）的Cα距離從12.7 ?減少到11.7 ?，并且明顯縮小了催化口袋。

圖7 野生型MtCel7b及突變體B3cut分子動力學(xué)模擬的軌跡主成分分析及平均結(jié)構(gòu)圖Fig. 7 Trajectory principal component analysis plots and average structure of molecular dynamics simulations of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

除此之外，催化通道兩端殘基的位置也發(fā)生了改變。圖7?C, D表明，突變體的催化口袋明顯較野生型窄。如圖所示，殘基W52、Q172、K233、N234、R242、G351、D352、N353、W356和E361均向催化中心移動。在催化通道的?3位處，突變體B3cut中的loop B1中W52側(cè)鏈的方向發(fā)生了變化，與野生型相比更接近催化中心。B3cut的loop A3中D352主鏈羰基O和靠近loop B3的Q172側(cè)鏈酰基2HE2之間形成側(cè)鏈-主鏈氫鍵，導(dǎo)致催化口袋被周圍的氨基酸覆蓋，催化通道的入口變窄。同時，在催化通道的+2位點處，氨基酸的取向也發(fā)生了變化，從而引起了氫鍵的改變。在野生型中，R242側(cè)鏈胍基2HH2和主鏈氨基H只與W356主鏈羰基O和N239側(cè)鏈?；鵒D1之間形成側(cè)鏈-主鏈氫鍵（圖7?E），而在B3cut中，R242周圍形成了一個新的復(fù)雜的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。如圖7?F所示，R242主鏈氨基H、側(cè)鏈胍基1HH1、2HH2、HE分別與催化裂隙上方的N239側(cè)鏈?；鵒D1、A237主鏈羰基O和裂隙下方的E361側(cè)鏈羧基OE1、OE2之間形成側(cè)鏈-主鏈氫鍵，這使得催化通道正位處變窄。雖然R242沒有與W356形成氫鍵作用力，但W356的吲哚環(huán)旋轉(zhuǎn)了50°，使產(chǎn)物生成部位更加封閉，增加了催化裂隙的疏水性。

3 討論

MtCel7b的最適溫度和最適pH值與大多數(shù)真菌源的GH7內(nèi)切葡聚糖酶相似，均在50-60℃和pH 4.0-5.0的范圍內(nèi)顯示出最大的酶活性［3-6］。此外，與先前的報道一致，MtCel7b對大麥葡聚糖的比活值高于對CMC?Na的水解活性，這可能是由于CMC?Na的分子結(jié)構(gòu)被甲氧基側(cè)鏈高度取代，從而干擾酶的活性［20］。目前報道的大多數(shù)GH7內(nèi)切酶都屬于嗜中溫酶，例如，來源于Aspergillus oryzae KBN616的CelA和CelB分別在60℃和55℃的溫度處理10 min后迅速失活［3］，當(dāng)在60℃條件下處理10 min后，來自H. grisea var. thermoidea的EGI穩(wěn)定性瞬間下降［4］。來源于A. fumigatus的Af?EGL7在60℃的溫度下處理30 min基本失活［6］。相比之下，MtCel7b的耐熱性顯著優(yōu)于其他已知的GH7內(nèi)切纖維素酶，在90℃的溫度下處理1 h后仍能剩余40%以上的酶活，這大大提高了MtCel7b在工業(yè)應(yīng)用上的潛力。除此之外，MtCel7b也表現(xiàn)出良好的耐鹽性。有研究表明，嗜鹽蛋白的標(biāo)志之一是表面具有較高的負(fù)電位，蛋白質(zhì)表面過量的酸性氨基酸殘基有助于增強水分子和金屬離子的結(jié)合，有助于形成水化膜，保護并維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性和活性［21-22］。在本研究中，MtCel7b蛋白表面具有大量負(fù)電荷殘基。其中，MtCel7b有64個帶負(fù)電荷的殘基，天冬氨酸占總氨基酸殘基的7.1%，谷氨酸占7.6%。B3cut有60個帶負(fù)電荷的殘基，天冬氨酸和谷氨酸均占總氨基酸殘基的7.1%。蛋白質(zhì)表面大量的酸性殘基也使得酶具有較低的pI（pI MtCel7b= pIB3cut= 4.86）。纖維素酶作為工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵酶系，需要適應(yīng)工業(yè)操作中特殊的物理和化學(xué)環(huán)境［23］。例如，在食品加工過程中，會遇到高溫（如烘焙、烘干等）、低溫（如低溫發(fā)酵、果汁澄清等）、高壓（如研磨、擠壓等）、高滲（如鹽漬、糖漬等）、強酸、強堿等較為苛刻的環(huán)境條件［24］。所以，能適應(yīng)極端環(huán)境的酶備受工業(yè)青睞。MtCel7b在酶學(xué)性質(zhì)上展現(xiàn)出的良好的耐熱、耐鹽性，表明其具有一定的潛在研究價值和工業(yè)應(yīng)用價值。Loop區(qū)結(jié)構(gòu)及氨基酸組成是影響酶熱穩(wěn)定性及活性的一個主要因素，尤其是催化通道周圍的loop區(qū)［25］。本研究中，將MtCel7b loop B3截短后發(fā)現(xiàn)，突變體B3cut雖然活性降低了，但其在高溫下的熱穩(wěn)定性較野生型有所提高。分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明，loop B3的局部變化使酶的整體構(gòu)象發(fā)生了較大程度的改變，特別是底物通道兩端，結(jié)構(gòu)更加緊湊，從而在高溫環(huán)境下保持穩(wěn)定。此外，loop B3的缺失也使催化通道內(nèi)的氫鍵作用網(wǎng)絡(luò)重新排布，尤其是催化殘基周圍的區(qū)域。在突變體中，K233位點喪失了與loop B3之間的聯(lián)系，與催化殘基E194建立了新的鹽橋，導(dǎo)致兩個催化位點之間的空間距離改變，從而使突變體的活性顯著下降。Km值的增大也從另一個角度說明，突變體催化通道內(nèi)氫鍵網(wǎng)絡(luò)的變化使酶結(jié)合底物的能力有所減弱。綜上所述，野生型loop B3中氨基酸之間的氫鍵相互作用網(wǎng)絡(luò)的影響使得MtCel7b具有更開放的催化裂隙，可以招募更多的底物分子，而突變體由于催化裂隙的開口變小，可能會干擾酶對底物的抓取和釋放，因此，突變體的催化效率較野生型顯著降低。本研究豐富了GH7嗜熱內(nèi)切纖維素酶的酶資源庫，同時為纖維素酶loop結(jié)構(gòu)的研究提供了理論支持。

4 結(jié)論

本研究從M. thermophila克隆表達(dá)了一個新型嗜熱、鹽耐受度高的GH7內(nèi)切纖維素酶MtCel7b，通過構(gòu)建loop B3截短突變體，探究了loop B3對GH7內(nèi)切纖維素酶熱穩(wěn)定性及催化活性的重要影響。酶學(xué)性質(zhì)與分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示，MtCel7b中長鏈的loop B3可以增加催化活性通道的體積，使其在催化底物過程中更加靈活。截短loop B3后，導(dǎo)致突變體B3cut催化通道體積的減小，酶的催化效率降低，熱穩(wěn)定性增強。