FLAG標(biāo)簽納米抗體的篩選、表達(dá)及驗(yàn)證

王欣怡 王曉倩 王紅軍 晁躍輝

（1. 北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，北京 100083；2. 北京泰德制藥股份有限公司，北京 100176）

1993年，Hamers?Casterman等［1］首次在駱駝血清中發(fā)現(xiàn)了一種新型抗體，被稱為重鏈抗體（heavy chain antibodies, HCAbs）。這種抗體由CH2、CH3、鉸鏈區(qū)和重鏈可變區(qū)（heavy chain variable domain,VHH）組成，天然缺失輕鏈和重鏈的CH1區(qū)（heavy chain constant region）。HCAbs的N端可變區(qū)，也稱為單域抗體（single domain antibody, sdAb），具有直徑約為2.5 nm和長度約為4 nm的尺寸，因其結(jié)構(gòu)簡單和尺寸小，也被稱為納米抗體（nanobody,Nb）［2］?？茖W(xué)家們在羊駝、單峰駝、美洲駝等駝科動(dòng)物，以及鯊魚、鰩魚等軟骨魚中發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)構(gòu)的抗體［1,3］。

納米抗體是目前已知的具有完整功能、穩(wěn)定且能夠結(jié)合抗原的最小單位［4］。相較于常規(guī)抗體，納米抗體具有諸多優(yōu)點(diǎn)，例如相對分子質(zhì)量小、易于生產(chǎn)和改造、特異性和親和力高、穩(wěn)定性和可溶性高、組織滲透性強(qiáng)、易清除、易表達(dá)、免疫原性弱和能夠識(shí)別縫隙表位等［2,5-6］。因此，在基礎(chǔ)研究、分子成像、親和純化基質(zhì)、診斷試劑、新藥開發(fā)、疾病診斷和治療等領(lǐng)域，納米抗體具有廣泛的應(yīng)用。例如，納米抗體可作為腫瘤成像［7］和分子成像［8］的小分子探針、蛋白質(zhì)或大分子復(fù)合物的結(jié)晶伴侶［9］、理想的毒素中和劑［10］，以及用于癌癥治療的抗腫瘤藥物［11］。曹飛婷等［12］利用噬菌體篩選技術(shù)，成功篩選出抗小鼠IgG的納米抗體，并制備出特異性親和小鼠IgG的親和層析介質(zhì)。Orlov等［13］分離出抑制葡萄扇葉病毒（grapevine fanleaf virus, GFLV）的納米抗體Nb23，在煙草和葡萄砧木中穩(wěn)定表達(dá)并觀察到對GFLV的特異性抵抗力。Ahmadi等［14］總結(jié)了幾種蝎子毒液治療的抗毒劑，因具有較低的免疫原性和較高的體外穩(wěn)定性，納米抗體可以發(fā)展為下一代蝎子抗毒血清。Uchański等［15］通過將納米抗體嫁接到選定的支架蛋白質(zhì)上，以產(chǎn)生穩(wěn)定且有效折疊的單體嵌合體并開發(fā)了巨型抗體。

FLAG融合標(biāo)簽是一個(gè)由8個(gè)氨基酸（Asp·Tyr·Lys·Asp·Asp·Asp·Asp·Lys）組成的親水性短肽，專門設(shè)計(jì)用于重組蛋白質(zhì)的免疫吸附純化工作［16］。利用FLAG融合標(biāo)簽，可以建立一個(gè)基于融合多肽的高效檢測和純化系統(tǒng)，簡化蛋白質(zhì)的純化過程，控制蛋白質(zhì)固定的空間取向，并方便檢測和體內(nèi)生物事件的可視化，提高重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量、增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的可溶性和穩(wěn)定性等［17］。具有FLAG標(biāo)簽的融合蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）序列短小，只需一條人工合成的寡核苷酸鏈即可編碼該抗原肽；（2）含有一個(gè)腸激酶切割位點(diǎn)，腸激酶可以識(shí)別該短肽C端的5個(gè)氨基酸（Asp·Asp·Asp·Asp·Lys），通過腸激酶處理除去標(biāo)簽后可以獲得天然的非融合蛋白質(zhì)［16］；（3）融合在N端的FLAG序列很穩(wěn)定，且不會(huì)被大腸桿菌蛋白酶除去；此外，目的蛋白N端融合FLAG標(biāo)簽后C末端還可以融合其他模塊；（4）融合有FLAG標(biāo)簽的目的蛋白可直接通過FLAG進(jìn)行親和層析，可純化有活性的融合蛋白且純化效率高；（5）抗FLAG的抗體可有效識(shí)別FLAG標(biāo)簽，可以通過Western Blot、ELISA等方法對含有FLAG標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行檢測和鑒定［18］。然而，目前商品化的FLAG標(biāo)簽抗體均為傳統(tǒng)類型的抗體，穩(wěn)定性差、不易保存、制備成本較高。因此，將FLAG標(biāo)簽蛋白與納米抗體庫中的抗體進(jìn)行相互作用篩選，可以快速、高通量地篩選出親和力較高和特異性較強(qiáng)的抗體。這對于FLAG標(biāo)簽蛋白的檢測、定位和純化等方面具有十分重要的意義。

納米抗體篩選主要通過噬菌體展示技術(shù)和酵母雙雜交技術(shù)兩種方法。噬菌體展示技術(shù)基于噬菌體的表面展示技術(shù)，通過將感興趣的抗原蛋白與噬菌體表面的蛋白進(jìn)行融合，并使用噬菌體庫進(jìn)行篩選，最終獲得與目標(biāo)抗原高度特異性結(jié)合的納米抗體。該技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，能夠應(yīng)用于篩選各種抗原結(jié)合的納米抗體［19］。但噬菌體文庫的庫容非常大，其隨機(jī)多樣性可達(dá)107-109，篩選抗體需要特異、高效的篩選方法［20］。酵母雙雜交技術(shù)是利用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行篩選，該技術(shù)基于酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子分為兩個(gè)部分：DNA結(jié)合域（DNA?binding domain, BD）和激活域（activation domain, AD），分別發(fā)揮結(jié)合DNA和激活轉(zhuǎn)錄的作用。將待篩選的納米抗體與AD域融合，而作為抗原的蛋白質(zhì)與BD域融合，分別連接到兩個(gè)不同的載體上，然后將這兩個(gè)載體一起轉(zhuǎn)染到酵母細(xì)胞中。若這兩個(gè)蛋白相互作用，則BD和AD結(jié)合形成一個(gè)功能完整的轉(zhuǎn)錄因子，激活其下游靶基因的表達(dá)，通過篩選生長特征正常的菌落，可以鑒定出這兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，能夠篩選出高親和力的納米抗體［21］。噬菌體展示技術(shù)和酵母雙雜交技術(shù)在納米抗體篩選方面各有優(yōu)劣。噬菌體展示技術(shù)可以直接篩選出抗原結(jié)合的納米抗體，具有高效性和高特異性，但是需要構(gòu)建大規(guī)模的噬菌體庫，且需要進(jìn)行后續(xù)的體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。使用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行篩選，不需要構(gòu)建大規(guī)模的噬菌體庫，且可以在體內(nèi)進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。由于酵母菌屬于真核細(xì)胞生物，所以與噬菌體表面展示技術(shù)相比，能夠更好地維持抗原抗體的生物活性。

在本研究中，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選、表達(dá)和驗(yàn)證，成功獲得了兩株具有特異性識(shí)別FLAG標(biāo)簽蛋白能力的納米抗體。這種簡便易行的FLAG標(biāo)簽技術(shù)具有很好的應(yīng)用潛力，而納米抗體的制備和驗(yàn)證為FLAG標(biāo)簽技術(shù)的更廣泛應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用的駝源納米抗體文庫為北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院構(gòu)建并保存。限制性內(nèi)切酶Sma I、Xba I和Bgl II，酵母轉(zhuǎn)化試劑盒等購買于TaKaRa公司。細(xì)胞質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒等購買于OMEGA公司。彩色預(yù)染蛋白Marker（10-170 kD）、原核表達(dá)菌株BL21購買于上海碧云天生物技術(shù)公司。鼠源Anti?Strep Tag II、HRP?conjugated Goat Anti?Mouse lgG、兔源HRP?conjugated Anti?Camelid VHH抗體購買于生工生物工程公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、酵母菌Y2H Gold及Y187菌株等均為北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用軟件Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中pGBKT7?FLAG?F和pGBKT7?FLAG?R用于FLAG標(biāo)簽酵母雙雜交篩庫載體的構(gòu)建；pCold?VHH?F和pCold?VHH?R用于原核表達(dá)載體的構(gòu)建（表1）。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiment

1.2.2 pGBKT7?FLAG載體的構(gòu)建 使用pGBKT7?FLAG?F和pGBKT7?FLAG?R引物，通過鏈間退火的方法使兩條反向互補(bǔ)引物，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，具體操作為：95℃ 5 min；?0.2℃/s，25℃ 5 min。提取pGBKT7質(zhì)粒在30℃條件下使用Sma I酶切15 min；使用DNA純化試劑盒，純化并回收酶切產(chǎn)物，使用無縫連接酶在50℃條件下，將酶切及復(fù)性產(chǎn)物連接15 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中并涂布在含卡納霉素的LB固體培養(yǎng)基上。使用通用引物T7 promoter和3′BD對單菌落進(jìn)行PCR鑒定，并將陽性單克隆菌落送至生物技術(shù)公司測序，將測序正確的載體命名為pGBKT7?FLAG。

1.2.3 酵母轉(zhuǎn)化 使用質(zhì)粒提取試劑盒從測序正確的大腸桿菌中提取pGBKT7?FLAG質(zhì)粒，并使用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒將pGBKT7?FLAG轉(zhuǎn)入到Y(jié)2H Gold酵母菌株中，涂布在SD/?Trp固體培養(yǎng)基上，放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱直至出現(xiàn)單菌落，挑取單克隆酵母菌落，經(jīng)PCR檢測后保存測序正確的pGBKT7?FLAG酵母菌液。

1.2.4 酵母雙雜篩選 將含有pGBKT7?FLAG的Y2H Gold酵母菌搖菌，離心棄上清后用SD/?Trp液體培養(yǎng)基重懸浮，加入納米抗體文庫菌液（酵母菌Y187）和2×YPDA液體培養(yǎng)基，放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度設(shè)置為29.5℃，時(shí)間為20 h，培養(yǎng)結(jié)束離心棄上清，并使用0.5×YPDA液體培養(yǎng)基重懸浮后，涂布于四缺培養(yǎng)基SD/?Trp/?Leu/?His/?Ade/X?α-Gal/AbA，放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-4 d后，挑取生長狀態(tài)良好且呈現(xiàn)藍(lán)色的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取酵母質(zhì)粒。使用引物T7 promoter與3′AD進(jìn)行PCR檢測，將含有陽性條帶的質(zhì)粒送至北京睿博興科生物公司測序，并保存測序結(jié)果。

1.2.5 “點(diǎn)對點(diǎn)”驗(yàn)證 將能夠在四缺培養(yǎng)基上正常生長，并且呈現(xiàn)藍(lán)色的單菌落，提取酵母質(zhì)粒，使用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒將提取的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)入到Y(jié)187酵母菌株中，涂布在SD/?Leu培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，單克隆菌落經(jīng)PCR檢測和測序后，進(jìn)行保存，以備后續(xù)使用。將重新轉(zhuǎn)化的Y187酵母菌分別與含有誘餌載體pGBKT7?FLAG、pGBKT7空載Y2H Gold酵母菌分別組合進(jìn)行酵母有性雜交，然后將每個(gè)組合分別稀釋10倍、100倍、1 000倍，將稀釋后的菌液吸取10 μL分濃度梯度涂于四缺培養(yǎng)基SD/?Trp/?Leu/?His/?Ade/X-α-Gal/AbA上，放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3-4 d后，觀察并記錄分析菌落生長狀態(tài)及顏色變化。

1.2.6 原核表達(dá)載體構(gòu)建 由于pGADT7 AD與pCold?SUMO載體，均含有氨芐青霉素抗性基因，為了防止載體自身的干擾，使用Xba I和Bgl II對含有納米抗體的酵母載體進(jìn)行雙酶切處理。以酶切產(chǎn)物為模板，使用pCold?VHH?F和pCold?VHH?R為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用無縫連接酶將PCR產(chǎn)物連接到pCold?SUMO，具體步驟：pCold?SUMO質(zhì)粒在37℃條件下使用Kpn I酶切15 min，將PCR及酶切產(chǎn)物純化后使用無縫連接酶，50℃條件下連接15 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中并涂布在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上。經(jīng)過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，使用pCold?f和pCold?r為引物進(jìn)行PCR檢測，送至北京睿博興科生物公司測序。對測序正確的大腸桿菌提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，以備進(jìn)行表達(dá)使用。

1.2.7 納米抗體的原核表達(dá)及檢測 取含有正確納米抗體序列的大腸桿菌BL21單菌落，接種于20 mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌至OD600為0.4-0.6，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，調(diào)整溫度為14℃低溫誘導(dǎo)過夜，收集菌體，超聲破碎后，取上清進(jìn)行SDS?PAGE分析。將超聲破碎后的上清樣品進(jìn)行SDS?PAGE電泳，將凝膠與大小適當(dāng)?shù)腘C膜組裝膜轉(zhuǎn)移裝置后置于冰內(nèi)，60 V轉(zhuǎn)膜40 min后調(diào)至120 V轉(zhuǎn)膜30 min，將NC膜轉(zhuǎn)移至含5%脫脂奶粉TBS封閉緩沖液放置于搖床上1 h后，將NC膜轉(zhuǎn)移至含5%脫脂奶粉TBST溶液中，加入1 μL的鼠源Anti?Strep Tag II單克隆抗體，放置于37℃恒溫振蕩器孵育1 h。用TBST溶液漂洗3遍，每次5 min，再將NC膜轉(zhuǎn)移至含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，加入1 μL的HRP?conjugated Goat Anti?Mouse lgG二抗，放置于37℃恒溫振蕩器孵育30 min，用TBST溶液漂洗5遍，每次5 min，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，使用BioRad超靈敏化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)進(jìn)行觀察，以未進(jìn)行低溫誘導(dǎo)的樣品為陰性對照。使用Strep?tag II抗體磁珠對表達(dá)的表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物放置于4℃冰箱以備后續(xù)研究。

1.2.8 抗體的Western blot驗(yàn)證 為了驗(yàn)證制備的納米抗體的效果，分別吸取2 μL FLAG多肽、NAP?FLAG（融合FLAG標(biāo)簽的紫花苜蓿MsNAP蛋白）、UFO?FLAG（融合FLAG標(biāo)簽的紫花苜蓿MsUFO蛋白）、Tag標(biāo)簽（含有16種標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，P0059，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、NAP（紫花苜蓿MsNAP蛋白）、UFO（紫花苜蓿MsUFO蛋白）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）、紫花苜?？偟鞍讟悠伏c(diǎn)樣于NC膜上，待樣品晾干后，取5 μL轉(zhuǎn)膜液覆蓋住樣品并再次晾干。以制備的納米抗體為一抗，兔源HRP?conjugated Anti?Camelid VHH為二抗，進(jìn)行Western blot檢測。同時(shí)，以商品化的常規(guī)FLAG抗體為對照。

2 結(jié)果

2.1 酵母雙雜交篩選結(jié)果

將構(gòu)建好的pGBKT7?FLAG轉(zhuǎn)化至酵母Y2H Gold中，以FLAG標(biāo)簽作為誘餌蛋白，對實(shí)驗(yàn)室保存的含有FLAG納米抗體的酵母文庫進(jìn)行篩選。通過酵母雙雜交操作，共計(jì)篩選到52個(gè)陽性克隆（圖1），通過PCR檢測、測序分析、序列比對、合并重復(fù)序列，初步確定5個(gè)FLAG納米抗體序列。

圖1 FLAG標(biāo)簽酵母雙雜交篩選Fig. 1 Yeast two-hybrid screening of FLAG tag

2.2 序列分析

基于測序結(jié)果，使用DNA Man軟件，將DNA序列轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)序列。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，所獲得的5個(gè)納米抗體序列，長度為123-129 aa，符合駝源納米抗體結(jié)構(gòu)，其N端為駝源重鏈單域抗體（variable domain of heavy chain of heavy?chain antibody,VHH）保守序列“QVQLQSEGG”，C端為“TQVTVSSA”或“TLVTVSSA”。所有序列均含有4個(gè)骨架區(qū)（frag?ment region, FR）及3個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)（complemen?tarity determining region, CDR）（圖2）。

圖2 FLAG標(biāo)簽納米抗體序列及結(jié)構(gòu)Fig. 2 Sequences and structures of FLAG-tag nanobody

2.3 酵母雙雜交點(diǎn)對點(diǎn)驗(yàn)證

為了排除pGBD T7載體自身存在的假陽性干擾，需要對篩選的5個(gè)納米抗體進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。通過“點(diǎn)對點(diǎn)”分析顯示（圖3），5個(gè)含有納米抗體的Y187酵母菌，能夠分別與含有FLAG標(biāo)簽的Y2H Gold酵母菌結(jié)合，同時(shí)在SD/?Trp?Leu?His?Ade/X?α-Gal/AbA能夠正常生長，而且呈現(xiàn)藍(lán)色；而僅含有pGBKT7空載的Y187酵母菌與含有FLAG標(biāo)簽的Y2H Gold酵母菌結(jié)合后，雖然能夠在四缺培養(yǎng)基上生長，但是菌體卻不能呈現(xiàn)藍(lán)色。以上結(jié)果表明，所篩選的5個(gè)納米抗體能夠識(shí)別FLAG標(biāo)簽，但不能識(shí)別GAL4蛋白質(zhì)的BD結(jié)構(gòu)域。

圖3 互作蛋白酵母雙雜交驗(yàn)證Fig. 3 Yeast two-hybrid assay for protein-protein interaction

2.4 納米抗體原核表達(dá)

將5個(gè)納米抗體DNA序列連接至pCold?SUMO載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使用pCold?F和pCold?R為引物，進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果（圖4）顯示，構(gòu)建的5個(gè)載體均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的PCR條帶，初步顯示原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。將檢測陽性的大腸桿菌送至北京睿博興科生物公司測序，結(jié)果顯示用于所構(gòu)建的5個(gè)原核表達(dá)載體序列正確，納米抗體原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 納米抗體原核表達(dá)載體PCR檢測Fig. 4 PCR detection of prokaryotic expression vector for nanobodies

將5種納米抗體的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)低溫誘導(dǎo)過夜，收集菌體，超聲破碎，取5 μL上清液進(jìn)行SDS?PAGE檢測，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果（圖5）顯示，僅有Nano?FLAG6和Nano?FLAG7成功表達(dá)出了可溶性納米抗體蛋白。

圖5 原核表達(dá)Fig. 5 Prokaryotic expression

為了確定蛋白表達(dá)成功，利用原核表達(dá)載體上的Strep?tag II標(biāo)簽，對融合蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果（圖6）顯示，Nano?FLAG6和Nano?FLAG7均能被檢測出一條單一、清晰的雜交條帶，而作為陰性對照的兩個(gè)樣品，沒有任何雜交信號(hào)。以上結(jié)果表明，Nano?FLAG6和Nano?FLAG7均表達(dá)成功。

圖6 Western blot檢測Fig. 6 Western blot detection

2.5 表達(dá)抗體的Western blot驗(yàn)證

對不同的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行Western blot檢測，一抗為Nano?FLAG6和Nano?FLAG7原核表達(dá)的上清提取液，二抗為兔源HRP?conjugated Anti?Camelid VHH。檢測結(jié)果（圖7）顯示，兩種通過原核制備的納米抗體，均能成功識(shí)別含有FLAG標(biāo)簽及含有FLAG標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，而作為陰性對照蛋白樣品NAP蛋白質(zhì)、UFO蛋白質(zhì)、BSA以及紫花苜蓿全蛋白，均不能被制備的納米抗體識(shí)別。該結(jié)果表明，成功制備了FLAG標(biāo)簽的納米抗體，而且該納米抗體具有極高的特異性。

圖7 納米抗體Western blot驗(yàn)證Fig. 7 Western blot validation of nanobodies

3 討論

本研究成功通過酵母雙雜交技術(shù)，從駝源納米抗體文庫中篩選出具有特異性識(shí)別FLAG標(biāo)簽蛋白的納米抗體。經(jīng)過表達(dá)、驗(yàn)證分析，獲得了兩株具有高特異性和親和力的抗FLAG標(biāo)簽蛋白納米抗體。通過“點(diǎn)對點(diǎn)”驗(yàn)證和原核表達(dá)Western blot分析，制備出含抗FLAG標(biāo)簽蛋白的納米抗體，為FLAG標(biāo)簽的更廣泛應(yīng)用提供了理論參考和技術(shù)支持。

3.1 FLAG標(biāo)簽抗體

抗標(biāo)簽蛋白抗體作為研究相應(yīng)融合蛋白的主要方法之一，具有很高的實(shí)用價(jià)值。然而，目前用于檢測和純化這些融合蛋白的商品化抗標(biāo)簽蛋白抗體種類較少、價(jià)格較高、穩(wěn)定性較差、不易保存。因此，制備抗FLAG標(biāo)簽的特異性納米抗體，可以滿足融合蛋白實(shí)驗(yàn)研究的需求，發(fā)揮重要作用。本研究還可作為一種技術(shù)平臺(tái)，為其他多種帶標(biāo)簽蛋白納米抗體的制備提供技術(shù)支持，并探討不同方法制備抗FLAG標(biāo)簽納米抗體的效果與作用。隨著對FLAG短肽研究的深入和新型抗體的開發(fā)，F(xiàn)LAG標(biāo)簽的應(yīng)用將會(huì)越來越廣泛。

3.2 FLAG納米抗體篩選

納米抗體篩選技術(shù)包括噬菌體展示、酵母雙雜交、mRNA展示、高通量測序和質(zhì)譜分析等［2］。酵母雙雜交技術(shù)是一種簡便、高效、快速篩選蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的方法［22］。2013年，F(xiàn)u等［23］設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一個(gè)駱駝科動(dòng)物單鏈抗體酵母雙雜交文庫，并成功篩選出具有高親和力的抗豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）Cap蛋白的納米抗體，該工作為研究豬圓環(huán)病毒2型的診斷和治療提供新的工具和方法。Gao等［24］利用酵母雙雜交技術(shù)篩選抗紐卡斯?fàn)柌《荆∟ewcastle disease virus, NDV）血凝素-神經(jīng)氨酸酶（haemagglutinin?neuraminidase,HN）蛋白的納米抗體。本研究中，通過酵母文庫篩選出特異性強(qiáng)、親和力高的納米抗體，并通過Western blot等方法進(jìn)行檢測和鑒定分析。通過酵母雙雜交分析，從駝源中獲得的5個(gè)納米抗體序列，長度在123-129 aa之間，同時(shí)在N端和C端分別含有納米抗體的保守序列；進(jìn)一步的序列分析揭示了每個(gè)納米抗體序列都含有4個(gè)骨架區(qū)和3個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)。骨架區(qū)和抗原互補(bǔ)決定區(qū)是納米抗體與抗原結(jié)合的關(guān)鍵部位，骨架區(qū)提供了穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，而抗原互補(bǔ)決定區(qū)是抗體和抗原特異性結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。表明了這些納米抗體與常見駝源納米抗體結(jié)構(gòu)的一致性［25］，這些特征說明這些序列可能在抗體的識(shí)別和穩(wěn)定性方面起到關(guān)鍵的作用，這些發(fā)現(xiàn)為理解駝源納米抗體的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的視角，這對開發(fā)更有效的抗體療法具有重要意義。

3.3 FLAG抗體融合表達(dá)

含標(biāo)簽融合蛋白是由目的蛋白和標(biāo)簽共同構(gòu)成的蛋白嵌合體，具有許多優(yōu)點(diǎn)，如有利于外源目的基因的有效翻譯和表達(dá)、保持目的蛋白天然構(gòu)象、避免重組蛋白降解、便于檢測和純化等［26］。常見的標(biāo)簽包括His標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、Strep?tag II標(biāo)簽、GST、MBP、Ub和SUMO等［27］。如姜茵等［28］利用GST融合基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了幽門螺桿菌Catalase融合蛋白，李志要等［29］利用豬源SUMO3標(biāo)簽蛋白可溶性表達(dá)豬腺病毒3型的Hexon基因高變區(qū)蛋白。SUMO標(biāo)簽除具有傳統(tǒng)融合標(biāo)簽的特性外，還具有分子小、促進(jìn)折疊、能被SUMO蛋白酶1專一性識(shí)別、對熱和蛋白酶有很強(qiáng)的抗性、有利于保持目的蛋白的穩(wěn)定性等優(yōu)勢［30］。Strep?tag II系統(tǒng)的純化條件比較寬泛，因?yàn)槠湓诩兓^程中不依賴金屬離子，Strep?tag II也適合含金屬離子蛋白質(zhì)的純化［31］。本研究利用含SUMO和Strep?tag II標(biāo)簽的pCold?SUMO載體進(jìn)行原核表達(dá)，并利用原核表達(dá)載體上的Strep?tag II標(biāo)簽對融合蛋白質(zhì)進(jìn)行了Western blot分析。

3.4 抗體效果驗(yàn)證

Western blot分析是進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測的重要手段，而外源蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)，對于維持蛋白質(zhì)的生物活性具有重要意義［32-33］。利用表達(dá)的納米抗體的融合標(biāo)簽進(jìn)行檢測，通過分析發(fā)現(xiàn)，使用Strep?tag II抗體，能夠檢測出6號(hào)和7號(hào)納米抗體在上清中成功表達(dá)。這一結(jié)果為制備兩種納米抗體，并為進(jìn)一步評(píng)估這些納米抗體的功能提供了關(guān)鍵工具。然而，在后續(xù)的研究中仍需要深入探討其他3種納米抗體在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率較低的原因，并對Nano?FLAG6和Nano?FLAG7進(jìn)行更多的功能性和療效性研究。由于使用了Strep?tag II標(biāo)簽，以及在進(jìn)行納米抗體純化的時(shí)候購買的磁珠吸附能力及純化效率低下等原因，導(dǎo)致僅僅富集了很少量的蛋白質(zhì)，鑒于此情況，可以考慮后續(xù)將Strep?tag II標(biāo)簽更換為其他標(biāo)簽，如6×His標(biāo)簽等，進(jìn)行納米抗體的大量制備及純化。

制備的納米抗體，需要進(jìn)行抗體效果檢測，Western blot是進(jìn)行抗體檢測的最簡單、有效的方法［34］。利用成功制備的納米抗體，并以商品化的FLAG標(biāo)簽抗體作為對照，通過WB來分析抗體效果。經(jīng)過檢測，在所有測試的樣品中，只有含有FLAG標(biāo)簽的蛋白質(zhì)被成功識(shí)別，而陰性對照組包括NAP蛋白質(zhì)、UFO蛋白質(zhì)、BSA以及紫花苜蓿全蛋白均未被識(shí)別，這一結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了本研究所制備的納米抗體對于FLAG標(biāo)簽的高度特異性。以上結(jié)果表明，通過篩選及制備納米抗體，來進(jìn)行蛋白質(zhì)的Western blot檢測是可行的。為了進(jìn)一步檢測抗體的效果，在未來工作中應(yīng)對抗體進(jìn)行其他研究，如免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）、免疫共沉淀（co?inmunoprecipitation, CoIP）、染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）等。

總之，本研究為后基因組時(shí)代大量涌現(xiàn)的新分子的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了重要的工具。通過酵母雙雜交技術(shù)篩選、表達(dá)、驗(yàn)證分析，以及制備含抗FLAG標(biāo)簽蛋白的納米抗體，為應(yīng)用FLAG標(biāo)簽融合蛋白的研究提供了重要工具，并為進(jìn)一步的FLAG標(biāo)簽應(yīng)用提供了理論參考。此外，本研究為其他標(biāo)簽蛋白納米抗體的制備提供了技術(shù)平臺(tái)，有助于解決目前商品化抗標(biāo)簽蛋白抗體的種類有限、價(jià)格高昂、穩(wěn)定性差和保存困難等問題，進(jìn)一步拓寬FLAG標(biāo)簽技術(shù)在目的蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究通過酵母雙雜交篩選方法，從駱源納米抗體文庫中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)與FLAG標(biāo)簽蛋白互作的蛋白。這些互作蛋白在大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中成功表達(dá)并得到正確的驗(yàn)證。其中，兩個(gè)蛋白通過原核表達(dá)Western blot驗(yàn)證存在與FLAG標(biāo)簽蛋白的相互關(guān)系。這兩種蛋白都能特異性識(shí)別FLAG標(biāo)簽蛋白，從而成功制備出含有抗FLAG標(biāo)簽蛋白的抗體。