觀賞植物花斑形成調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

齊方婷 黃河

（北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083）

花色是植物重要的觀賞性狀，被子植物的花色多樣性不僅體現(xiàn)在顏色的多變，還包括形成一些獨(dú)特的色彩圖案即花瓣彩斑（花斑）。花斑一般是指花瓣上不同區(qū)域出現(xiàn)的差異著色模式［1］，能給花朵增添極大的觀賞性。此外，花朵斑部內(nèi)含物具備吸收可見紫外光的特質(zhì)，使得花斑在昆蟲眼中呈現(xiàn)特異的顏色，能夠減少傳粉昆蟲的搜索時(shí)間［2-3］，因此，相較于單色花來說，帶有花斑的品種在繁衍上占據(jù)優(yōu)勢地位，更能吸引傳粉者如蝴蝶［4］、蒼蠅［5］和黃蜂［6］的注意。而一些植物也可以利用花斑來抵御食草昆蟲［7］、防護(hù)紫外線以及適應(yīng)不同的溫度［8］?？梢哉f花斑是植物進(jìn)化、自然選擇和人工選擇的重要方向，在現(xiàn)代花卉業(yè)中具有重要意義［9］。因此，對(duì)花斑形成機(jī)理的探究尤為重要，目前，色素合成途徑研究較為透徹，而花斑的形成還涉及多種發(fā)育和環(huán)境信號(hào)參與，更具多變性和復(fù)雜性。已有研究對(duì)花斑形成過程中的化學(xué)物質(zhì)組成和分子調(diào)控模式進(jìn)行深入挖掘，就觀賞植物花斑的形成提出多種模型和假說，本文對(duì)此進(jìn)行總結(jié)歸納，以期促進(jìn)對(duì)觀賞植物花斑的深入研究。

1 花斑的分類及遺傳規(guī)律

1.1 規(guī)則型花斑

花斑可分為規(guī)則型花斑和不規(guī)則型花斑兩大類，規(guī)則型花斑主要包括脈絡(luò)狀（venation）、斑塊（blotch）、點(diǎn)狀（spots）、二色（bicolor）、花邊（picotee）、星型（star）、花眼（bull?eyes）以及蜜導(dǎo)（nectar guide）等類型（圖1?a-h）［1］，能按照遺傳的基本規(guī)律進(jìn)行世代傳遞。部分植物的花斑性狀由單基因控制，在樹棉（Gossypium arboreum）［20］和猴面花（Mimulus lewisii）［21］中發(fā)現(xiàn)，花斑性狀在雜交子代中的分離比遵循簡單的顯性單基因遺傳規(guī)律。夏堇（Torenia fournieri）在腹瓣或背瓣表現(xiàn)出的多種著色模式也由單基因決定且通常為顯性性狀［22］，而Kondo等［23］在夏菫的一個(gè)品種中發(fā)現(xiàn)背瓣白色和紫色株系雜交后，F(xiàn)1花均為背瓣白色帶紫邊表型（半色系），半色系自交后代中白色∶半色∶紫色的分離比為1∶2∶1，屬于不完全顯性遺傳?？死ǎ–larkia gracilis）中心斑點(diǎn)和基部斑點(diǎn)花朵雜交F1代表現(xiàn)出雙斑點(diǎn)表型，F(xiàn)2中基部斑點(diǎn)∶雙斑點(diǎn)∶中心斑是1∶2∶1，為共顯性遺傳［24］。

圖1 規(guī)則和不規(guī)則型花斑Fig. 1 Regular and irregular flower spots

1.2 不規(guī)則型花斑

相對(duì)較為簡單的規(guī)則型花斑，不規(guī)則型花斑是指花瓣上有非固定的異色散點(diǎn)或條紋，形成園藝學(xué)上所謂的“灑金”“跳枝”“二喬”“二色”等（圖1?i-m），在牡丹（Paeonia suffruticosa）［25］、桃花（Prunus persica）［26］和矮牽牛（Petunia hybrida）［27］中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子（transposons）或小片段插入、甲基化（methylation）和small RNA等均有可能形成不規(guī)則型花斑，其花斑性狀也可以遺傳給子代，但往往具有隨機(jī)性和可變性，遺傳過程不遵循孟德爾定律。此外，病毒感染也會(huì)導(dǎo)致不規(guī)則型花斑的產(chǎn)生，如病毒感染蘭科（Orchidaceae）植物后會(huì)出現(xiàn)花瓣壞死、色素不均以及嵌合條紋等現(xiàn)象［28］，大麗花（Dahlia pinnata）感染了煙草壞死病毒（tobacco streak virus,TSV）后會(huì)出現(xiàn)雜色花［29］。因病毒感染產(chǎn)生的不規(guī)則型花斑一般不能通過雜交的方式穩(wěn)定遺傳給后代。

2 影響花斑形成的理化因素

花斑的本質(zhì)是呈色上的差異，而花色在視覺上的呈現(xiàn)通常是由于色素對(duì)光的選擇性吸收和花內(nèi)部結(jié)構(gòu)的光散射性［30］，因此花瓣內(nèi)色素物質(zhì)的組成和分布是花斑形成的重要影響因素［15］。此外，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境（液泡pH、金屬離子及其絡(luò)合物［31］等）也影響著植物花斑的形成。

2.1 花瓣中色素的組成和分布影響花斑形成

自然界中，植物花朵的成色主要由類黃酮（favonoids）、類胡蘿卜素（carotenoids）和甜菜色素（betalains）三大類色素決定。其中，最為廣泛分布的類黃酮是形成黃、紅和藍(lán)色系花朵的重要組分，包括花青素（anthocyanins）、黃酮（flavones）和黃酮醇（flavonols）類化合物?；ㄇ嗨刂饕譃樘祗每兀╬elargonidin, Pg）、矢車菊素（cyanidin, Cy）和飛燕草素（delphinidin, Dp）三大類及其衍生色素芍藥素（peonidin, Pn）、矮牽牛素（petunidin, Pt）和錦葵素（malvidin, Mv），它們共同組成了從橙紅色到藍(lán)色的花色區(qū)間。類胡蘿卜素決定了花色從黃到橙的變化區(qū)間。而甜菜色素目前主要在石竹目中發(fā)現(xiàn)，參與黃色系或紅色系花朵的形成［32-33］。

色素在花瓣中的不同位置或細(xì)胞中差異積累，使得花朵呈現(xiàn)獨(dú)特的色彩圖案。牡丹‘二喬’粉色區(qū)域主要積累1種芍藥花素衍生物，而紅色區(qū)域積累2種矢車菊素衍生物和2種芍藥花素衍生物［25］；克拉花花瓣有斑區(qū)積累Cy和Pn，無斑區(qū)積累Mv［24］。猴面花［21］、向日葵［34］（Helianthus argophyllus）和金魚草［35］中黃酮醇和橙酮類（aurone）化合物的累積使得花朵靠近花心的部位出現(xiàn)不同于花瓣背景色的白色或黃色斑區(qū)。一些蘭科花卉（orchids）如大花蕙蘭［16］和金黃石斛蘭［36］（Dendr?obium chrysotoxum）中花青素和類胡蘿卜素在不同花瓣中差異積累并形成了豐富的彩色圖案。東方黑種草（Nigella orientalis）花瓣發(fā)育早期只積累葉綠素，中期類胡蘿卜素含量上調(diào)，后期花青素在花瓣特定區(qū)域匯聚，共同組成了黃色花瓣帶有綠色眼狀斑點(diǎn)、紫紅色橫條紋和飛濺斑紋的復(fù)雜圖案［37］。

2.2 細(xì)胞內(nèi)環(huán)境理化性質(zhì)改變

花瓣細(xì)胞內(nèi)部條件的改變會(huì)導(dǎo)致原本的色素分布出現(xiàn)變化，進(jìn)而產(chǎn)生新的花色變異?；ò昙?xì)胞內(nèi)pH的變化會(huì)使得原本純色的花朵出現(xiàn)脈絡(luò)或斑塊狀花斑，矮牽牛中PH5（P?type H+?ATPase 5）和AN1（ANTHOCYANIN1）都能通過促進(jìn)局部花瓣細(xì)胞內(nèi)部H+的跨膜運(yùn)輸引起液泡內(nèi)環(huán)境酸化，導(dǎo)致了多種花斑突變體的出現(xiàn)［38］。杜鵑花（Rhododendron oldhamii）中也發(fā)現(xiàn)紅色花瓣上部的紫紅色斑塊內(nèi)細(xì)胞的pH高于其他部分［39］。除pH變化外，高濃度的Fe3+與山奈酚（kaempferol）類化合物形成的絡(luò)合物累積是郁金香［40］（Tulipa gesneriana）和北海道紫菫［41］（Corydalis ambigua）紫色花瓣出現(xiàn)藍(lán)色色素沉積的原因。

3 色素代謝途徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因影響花斑形成

3.1 結(jié)構(gòu)基因的時(shí)空表達(dá)影響色素積累

色素物質(zhì)在花瓣不同區(qū)域的定位積累是花斑產(chǎn)生的重要原因，類黃酮的自然合成途徑目前已較為清晰［33］，因此，花瓣中控制色素物質(zhì)合成的基因的時(shí)空差異表達(dá)對(duì)花斑形成起到了關(guān)鍵作用，Martins等［24］在克拉花中發(fā)現(xiàn)，花發(fā)育早期，花斑區(qū)域F3′H（flavonoid 3′? hydroxylase）和DFR2（dihydrokaempferol 2）表達(dá)顯著提高，積累Cy，而在發(fā)育后期，無斑區(qū)中DFR1和F3′5′H（flavonoid?3′,5′?hydroxylase）開始表達(dá)，并積累Mv，形成較淺的背景色。矮牽牛中CHS（chalcone synthase）在花瓣中的空間差異表達(dá)是星型和花邊型花斑形成的原因［14,27］。牡丹‘和諧’中一個(gè)在無斑區(qū)高表達(dá)的糖基化基因（UDP?glycosyltransferases, UGT）PhUGT78A22，使得花瓣有斑區(qū)和無斑區(qū)中色素的糖基化程度不同，引發(fā)花色差異［42］。此外，花青素轉(zhuǎn)運(yùn)基因（glutathione S?transferase, GST）也會(huì)影響花斑的形成，在白色紅斑品種的樹棉中沉默GaGST后紅色斑點(diǎn)減少［43］。亞洲雜種百合中PSY（phytoene synthase）和HYB（β-ring hydroxylase）的差異累積導(dǎo)致了‘Connecticut King’和‘Virginale’花被片上分別出現(xiàn)橙黃色斑塊和窄橢圓形斑紋［44-45］。

此外，結(jié)構(gòu)基因的序列差異如轉(zhuǎn)座子或小片段插入會(huì)改變其原有的時(shí)空表達(dá)模式，進(jìn)而產(chǎn)生不規(guī)則型花斑。轉(zhuǎn)座子是指可從一個(gè)位置“跳躍”到另一個(gè)位置的一段DNA序列，日本牽?；ǎ↖pomoea nil）Tpn轉(zhuǎn)座子（transposable element of Pharbitis nil）與花斑性狀密切相關(guān)，在DFR、EFP（enhancer of flavonoid production）和3GT（flavonoid?3?O?glucosyltransferas）中分別發(fā)現(xiàn)Tpn1、Tpn13和Tpn10轉(zhuǎn)座子在非編碼區(qū)以及啟動(dòng)子區(qū)域的插入，導(dǎo)致了矮牽?；ò臧邏K或者雜色花的形成［46-48］?？的塑埃―ianthus caryophyllus）CHI（chalcone isomerase）和DFR上的Ac/Ds（activator/dissociation）超家族轉(zhuǎn)座子dTdic1的插入會(huì)在花朵上產(chǎn)生白色的斑點(diǎn)或條紋［49］。而在‘二喬’牡丹F3′H編碼區(qū)的小片段插入，會(huì)使得花瓣部分區(qū)域花青素積累減少出現(xiàn)雜色［25］。

3.2 結(jié)構(gòu)基因的競爭表達(dá)促進(jìn)色素差異分布

色素物質(zhì)的合成過程中，會(huì)出現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)基因編碼的酶作用于同一底物的情況，使得結(jié)構(gòu)基因之間存在競爭表達(dá)。在類黃酮代謝途徑中，F(xiàn)LS（flavo?nol synthase）和DFR競爭同一底物柚皮素（narin?genin），猴面花DFR促進(jìn)外側(cè)花冠合成花青素呈紅色，F(xiàn)LS使得內(nèi)側(cè)花冠積累黃酮醇變成白色［21］。牡丹‘二喬’雙色花中粉色區(qū)域FLS的上調(diào)表達(dá)抑制了花青素的積累［25］。C. trapeziformis蘭花唇瓣的斑塊中CtrDFR和CtrLDOX（leucoanthocyanidin dioxygenase）的表達(dá)上調(diào)，CtrFLS表達(dá)下調(diào)，激活該區(qū)域花青素的合成［50］。黃色向日葵的花心中檢測到HaFLS1的高表達(dá)，促進(jìn)槲皮素苷（quercetin）和二咖啡基奎寧酸（di?O?caffeoyl quinic acid, CQA）的積累，出現(xiàn)獨(dú)特的UV著色模式［34］。夏堇中，有斑區(qū)VwDFR、VwF3′5′H和VwANS（anthocyanidin synthase）的表達(dá)量遠(yuǎn)高于非斑部，使其形成了積累Dp和Cy的黑色斑塊，而無斑區(qū)中花青素通路在柚皮素處被阻斷，只積累二氫槲皮素（dihydroquercetin），呈現(xiàn)黃色［51］。

4 花斑形成中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

在花斑形成的過程中，結(jié)構(gòu)基因的差異表達(dá)影響著不同色素物質(zhì)的積累，其受到多種轉(zhuǎn)錄因子的控制，因此轉(zhuǎn)錄調(diào)控是整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，已有大量研究揭示了花斑形成過程中的多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，主要包括單個(gè)以及多個(gè)調(diào)節(jié)基因直接或間接控制結(jié)構(gòu)基因的定位表達(dá)等。

4.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花斑形成

在色素合成途徑中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮最重要的調(diào)控作用，其中，R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子中的S5和S6亞家族能激活色素的合成；而S4亞家族因具備EAR（ERF?associated amphiphilic repression）和TLLLFR抑制基序，從而負(fù)調(diào)控色素積累［52］；R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子則是一類花青素合成的抑制子［53］。已有大量研究顯示MYB轉(zhuǎn)錄因子參與花斑的形成，棉花（Gossypium hirsutum）BM位點(diǎn)（beauty mark）編碼的R2R3類MYB基因MYB113編碼區(qū)的單堿基突變（SNP）導(dǎo)致了花瓣基部斑點(diǎn)的出現(xiàn)［54］；夏堇和蝴蝶蘭TfMYB1內(nèi)含子和PeMYB11啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)座子插入引發(fā)了多種著色模式的變化［55-56］。百合R2R3?MYB轉(zhuǎn)錄因子（如LhMYB12、LcMYBSPLATTER、LhMYB19L和LhMYB19S）參與雙色、點(diǎn)狀、刷痕狀、凸起式等多種斑點(diǎn)類型的形成［57-59］，其中，LhMYB12的等位基因LhMYB12?Lat在編碼區(qū)多了一段核苷酸序列的插入，能夠控制飛濺式斑點(diǎn)的形成［60］；而LhMYB19L在點(diǎn)狀和刷痕狀斑點(diǎn)中均能檢測到表達(dá)，但LhMYB19S僅在點(diǎn)狀斑點(diǎn)中表達(dá)，推測是因?yàn)長hMYB19S相較于LhMYB19L有一段序列的缺失以及若干SNP［58-59］。

MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠通過直接激活或遏制花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)來控制花瓣不同區(qū)域色素的積累。百合中LrMYB15通過激活LrANS和LrDFR的表達(dá)促進(jìn)凸起狀斑點(diǎn)處的色素累積［61］。牡丹中PsMYB30和PrMYB5可以分別與PsANS和PrDFR的啟動(dòng)子結(jié)合來激活基因表達(dá)，導(dǎo)致花瓣基部出現(xiàn)紫紅色斑塊［62-63］。除調(diào)控花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因外，MYB轉(zhuǎn)錄因子還可以通過控制類黃酮的分支代謝參與花斑的形成。猴面花的花冠喉部白色區(qū)域的形成是因?yàn)長AR1（leucoanthocyanidin reductase 1）位點(diǎn)編碼的R2R3?MYB轉(zhuǎn)錄因子激活FLS的表達(dá)進(jìn)而合成黃酮醇，而不再積累花青素［21］。向日葵花朵中花心部分主要積累能吸收紫外光的黃酮醇，其在紫外光下呈現(xiàn)黑色，過表達(dá)HaMYB111能夠激活花心處HaFLS的表達(dá)，促進(jìn)槲皮素等黃酮醇類物質(zhì)的積累，使得深色花心范圍不斷擴(kuò)大［34］。MYB轉(zhuǎn)錄因子還可與bHLH（basic helix?loop?helix）和WD40轉(zhuǎn)錄因子組成蛋白復(fù)合物（MBW復(fù)合體）激活下游基因的表達(dá)，從而共同調(diào)控色素代謝途徑［64］。彩色三葉草（Trifolium repens）中MYB轉(zhuǎn)錄因子RED LEAF和RED LEAFDIFFUSE都是通過與bHLH轉(zhuǎn)錄因子JAF13結(jié)合，正調(diào)控花青素合成促進(jìn)葉脈斑紋的形成［65］。在百合中LhMYB18和LhMYB6需要與bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活DFR的表達(dá)進(jìn)而在花被片上形成斑點(diǎn)［66-67］。紫斑牡丹PsMYB12與bHLH和WD40蛋白組成的MBW復(fù)合體直接激活下游結(jié)構(gòu)基因PsCHS的表達(dá)促進(jìn)斑點(diǎn)形成［68］。

MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)花青素的正向或負(fù)向的調(diào)控作用決定了色素物質(zhì)的有無，不同于純色花，帶有花斑的花朵中不同區(qū)域積累的色素并不相同，這需要依靠多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控。在金魚草中，MYB轉(zhuǎn)錄因子ROSEA1和ROSEA2決定了花瓣和花蕾的呈色模式，而VENOSA控制上唇瓣脈絡(luò)斑紋的形成［10,35］；在矮牽牛［69］和蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）［70］中也發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)果?？死–gMYB6控制背景色的形成，CgMYB1控制斑點(diǎn)處色素積累，CgMYB1在花瓣不同位置的表達(dá)分別形成了基部斑點(diǎn)和中部斑點(diǎn)，而CgMYB11和CgMYB12是花青素合成的激活子，它們?cè)诨ò曛械牟町惐磉_(dá)以及基因突變形成了更豐富的色彩圖案，如基部“白杯”的產(chǎn)生是因?yàn)镃gMYB11僅在中上部表達(dá)，而花斑基部CgMYB12的等位基因CgMYB12W出現(xiàn)過早的終止密碼子進(jìn)而不積累花青素；而中部條紋的出現(xiàn)是因?yàn)镃gMYB11在上部表達(dá)，CgMYB1在基部表達(dá)，而花瓣中部CgMYB12出現(xiàn)缺失，只檢測到350 bp的外顯子，最終呈白色［71-73］。

近年來，一些研究深入挖掘了多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子共同控制花斑形成的調(diào)控機(jī)制，Ding等［74］在猴面花中提出了一個(gè)由2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的“反應(yīng)-擴(kuò)散”模型，該模型由花青素激活子NEGAN（NECTAR GUIDE ANTHOCYANIN）和抑制子RTO（red tongue）組成，NEGAN激活RTO的表達(dá)，反之RTO能抑制NEGAN的活性，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在花瓣中動(dòng)態(tài)擴(kuò)散并相互拮抗，在猴面花蜜導(dǎo)中形成了分散斑點(diǎn)。后續(xù)Zheng等［75］又在猴面花中鑒定出了一個(gè)NEGAN的同源基因MYB5a，發(fā)現(xiàn)它也能與RTO形成類似的模型，進(jìn)而調(diào)控花斑形成。這種“反應(yīng)-擴(kuò)散”模型通過基因之間的此消彼長來形成斑點(diǎn)，這也導(dǎo)致形成的斑點(diǎn)大小不一，呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)模式。東方黑種草中激活子NiorMYB113?1負(fù)責(zé)在花瓣中上部積累花青素，而抑制子NiorMYB113?2能在花瓣背景色和花青素之間形成隔絕帶，控制色素在花瓣上積累的區(qū)域和邊界，最終構(gòu)建出復(fù)雜的花斑圖案［37］。

4.2 其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花斑形成

雖然參與色素合成的結(jié)構(gòu)基因是整個(gè)花斑形成中的關(guān)鍵基因模塊，但是花朵的著色模式是伴隨著發(fā)育進(jìn)程逐步建立的，并受環(huán)境因素影響，因此一些參與發(fā)育進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄因子能夠直接或者上游調(diào)控花斑的形成。MADS?box（MCM1、AGAMOUS、DEFICIENS和SRF?box）轉(zhuǎn)錄因子中的A類（APETALA1）、B類（PISTILATA和APETALA3）、C類（AGAMOUS）和E類（SEPALLATA）是花器官發(fā)育的ABCDE模型的重要組成［76-77］。近年來，MADS?box轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道參與花朵差異著色模式的形成，在卡特蘭（Cattleya hybrid）中，與唇瓣的發(fā)育和分化有關(guān)的AP3（APETALA3）?1/2/3/4s和AGL6（AGAMOUS?like 6）?2s也參與了上下唇瓣的差異著色［78］。百合中抑制花被片中B類MADS?box基因TrihDEFa（DEFICIENSa）的表達(dá)，會(huì)使得花瓣由紅變白，斑點(diǎn)變淡或消失［79］。矮牽牛中單獨(dú)沉默C類MADS?bos基因pMADS3時(shí)，深藍(lán)色花瓣中部分區(qū)域的色素積累被抑制，出現(xiàn)藍(lán)白雙色的表型［80］。瓜葉菊中鑒定出了2個(gè)在白斑區(qū)高表達(dá)的C類MADS?box轉(zhuǎn)錄因子ScAG（AGAMOUS）和ScAGL11，它們相互作用形成二聚體，并通過直接結(jié)合ScF3H1（flavonoid 3?hydroxylase 1）和ScDFR3的啟動(dòng)子來抑制花青素的積累，最終形成花斑［13］。

發(fā)育基因除了直接影響色素合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)外，還可通過控制MYB基因的表達(dá)進(jìn)而層級(jí)調(diào)控花朵著色模式的形成。在蝴蝶蘭‘Sogo Yukidian’中發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)僅在側(cè)萼片中出現(xiàn)且由PeMYB11控制，該基因受到一個(gè)變異的AGL6類MADS?box轉(zhuǎn)錄因子OAGL6?2調(diào)控，OAGL6?2可與OAP3?1結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，能夠在改變花瓣下側(cè)萼片結(jié)構(gòu)的同時(shí)上游調(diào)控PeMYB11的表達(dá)進(jìn)而形成斑點(diǎn)，說明色素的差異定位積累可能是發(fā)育基因產(chǎn)生新功能的結(jié)果［81］。夏堇中CYC2（CYCLOIDEA）和RAD類（RADIALIS?like）轉(zhuǎn)錄因子RAD1在背側(cè)花瓣中特異性表達(dá)，其可直接結(jié)合MYB1基因，抑制該基因在此區(qū)域的作用，從而影響花青素合成途徑下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，最終建立了夏堇背腹不對(duì)稱的著色模式［22,82］；而當(dāng)TfCYC2的外顯子上插入一個(gè)Ty1/Copia?like型LTR（long terminal repeat）逆轉(zhuǎn)座子TORE2時(shí)，會(huì)導(dǎo)致TfCYC2和TfRAD1表達(dá)下降，白色背側(cè)花瓣腹側(cè)化并開始著色［23］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中TCP4（TEOSINTE?BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF 4）能夠直接結(jié)合葉綠素合成途徑結(jié)構(gòu)基因PORB（protochlorophyllide oxidoreductase）和DVR（divinyl reductase）或者轉(zhuǎn)錄因子SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1）的啟動(dòng)子來降低花瓣遠(yuǎn)端葉綠素的積累，促使tcp2、tcp3、tcp4、tcp5、tcp10、tcp13、tcp17 七個(gè)基因突變體的遠(yuǎn)端花瓣的葉綠體轉(zhuǎn)化為白質(zhì)體，綠色花瓣尖端呈現(xiàn)白色［83］。

5 花斑形成過程中的其他調(diào)控機(jī)制

目前，對(duì)于花斑的研究多集中于對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的挖掘及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，觀賞植物復(fù)雜的顏色圖案模式的形成需要依靠多種調(diào)控手段的層層協(xié)作，并不局限于轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而是包含了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯后調(diào)控、基因序列差異以及甲基化等不同水平的調(diào)控機(jī)制（圖2）。

圖2 花斑形成的多種調(diào)控機(jī)制Fig. 2 Multiple regulation mechanisms of the flower spots formation

5.1 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（post?transcriptional regulation）是指真核生物對(duì)轉(zhuǎn)錄出的mRNA進(jìn)行加工，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)起到重要的調(diào)控作用［84］，如可變剪接（alternative splicing）、小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）和microRNA（miRNA）等均被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)控觀賞植物花斑的形成?？勺兗艚幽軌虍a(chǎn)生多種mRNA，翻譯出不同功能的蛋白，但也可以引起翻譯的提前終止，使蛋白改變或喪失原有功能［85］，因此，在花朵著色過程中，可變剪接極易產(chǎn)生不規(guī)則型花斑。跳枝桃就是因?yàn)榭勺兗艚邮沟肁NS在紅色花中有兩種不同長度的轉(zhuǎn)錄本，而在白色花中僅檢測到一種轉(zhuǎn)錄本［86］。

small RNA（sRNA）是指一類小片段的不編碼蛋白的RNA分子，能夠通過引起基因轉(zhuǎn)錄后沉默來參與花斑形成［87］。在日本龍膽（Gentiana scabra）［88］和秘魯三角梅（Bougainvillea peruviana）［89］的雙色花中都檢測到了sRNA在花朵白色部位的大量累積。sRNA又可進(jìn)一步分為siRNA和miRNA，植物內(nèi)源性siRNA來源于長的雙鏈RNA（dsRNA），雙鏈siRNA與Argonaute（AGO）蛋白形成基因沉默復(fù)合體RISC（RNA?induced silencing complex）降解互補(bǔ)配對(duì)的靶mRNA從而抑制基因表達(dá)［90］。siRNA引起的基因沉默能夠調(diào)控花瓣的差異色素沉著，遺傳過程中的染色體重排導(dǎo)致了矮牽牛星型和花邊型的花中存在兩個(gè)頭尾串聯(lián)的CHS?A，它們能夠產(chǎn)生21 nt的siRNA并降解花瓣白色區(qū)域CHS?A成熟mRNA，引起色素的差異空間積累［14］。金魚草花冠中一個(gè)含有Am4′CGT（chalcone 4′?O?glucosyltransferase）反向重復(fù)序列的SULF優(yōu)先表達(dá)，產(chǎn)生sRNA抑制Am4′CGT的表達(dá)，使得蜜導(dǎo)更為醒目，以此吸引授粉者［91］。Liang等［92］在猴面花花冠中發(fā)現(xiàn)顯性的YUPL（YELLOW UPPER）等位基因能夠產(chǎn)生靶向MYB轉(zhuǎn)錄因子RCP2（reduced carotenoid pigmentation 2）的siR?RCP2，抑制花冠中的類胡蘿卜素積累，而RCP1可能位于YUP的上游抑制siRNA的產(chǎn)生并在蜜導(dǎo)中特異表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)也證明siRNA可能通過控制MYB轉(zhuǎn)錄因子參與花斑形成中的層級(jí)調(diào)控。

miRNA是一類18-25 nt的非編碼小分子，來源于具有堿基對(duì)折疊結(jié)構(gòu)的初級(jí)miRNA（pri?miRNA），成熟的miRNA組成RISC復(fù)合體，抑制靶基因的表達(dá)［93］。miRNA?mRNA模塊參與植物著色模式的形成，miR156能夠靶向SPL（SQUAMOSA）基因的啟動(dòng)子序列，而SPL轉(zhuǎn)錄因子通過破壞MBW復(fù)合體的穩(wěn)定來抑制花青素的合成，在擬南芥［94］和芍藥（P.lactiflora）［95］中發(fā)現(xiàn)，miR156?SPL模塊能夠影響花青素在擬南芥莖稈或側(cè)枝上的定位積累?，F(xiàn)有研究顯示，miRNA也影響花斑的形成，蝴蝶蘭品種‘Panda’中PeMYB7和PeMYB11控制花瓣紫色斑點(diǎn)的形成，而靶向這兩個(gè)MYB基因的miR156g和miR858在非斑點(diǎn)區(qū)域積累，抑制了花青素的合成［96］。百合LhMYB12是花青素的激活子，在很多雙色花中均能檢測到其表達(dá)［57］，Yamagishi等［97］發(fā)現(xiàn)miR828在百合雙色花中的下半部分的積累高于上半部分，并且通過靶向LhMYB12的mRNA降解其轉(zhuǎn)錄本積累，導(dǎo)致花被片的下部呈現(xiàn)為白色。牡丹‘島錦’中鑒定出2個(gè)可能參與雙色花形成的miRNA（miR858和miR156a?5p），推測其可能通過調(diào)控PsMYB12來影響花瓣中花青素的差異積累［98］。

5.2 翻譯后調(diào)控

泛素化（ubiquitination）是常見的翻譯后修飾，是指泛素信號(hào)被26S蛋白酶體識(shí)別，從而降解靶向蛋白質(zhì)的過程［99］。泛素化參與植物的多種代謝途徑并影響花斑的形成，牡丹‘和諧’E3泛素連接酶PhRING?H2（ring domain?containing protein）與PhCHS相互作用，通過降解PhCHS抑制花發(fā)育后期花瓣中色素的積累，參與斑塊的形成［100］。菊花‘Noble Wine’（NW）粉色舌狀花上帶有紫色斑紋，與純紫色品種相比，NW中編碼F?box（泛素化途徑中特異識(shí)別底物的蛋白）的基因高表達(dá)［101］。

5.3 DNA甲基化

DNA甲基化是指在甲基化轉(zhuǎn)移酶（methyltrans?ferase）的作用下，基因組的核苷酸對(duì)的胞嘧啶上結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)，形成5?甲基胞嘧啶（5?methylcy?tosine），植物中甲基化位點(diǎn)一般為對(duì)稱的CG位點(diǎn)、CNG位點(diǎn)和不對(duì)稱的CHH位點(diǎn)3種，甲基化能夠在不改變DNA序列的情況下，通過改變DNA或組蛋白（histone）的結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性來調(diào)控基因表達(dá)［102］，甲基化往往會(huì)使得基因失去原本的功能，主要參與不規(guī)則型花斑的形成。文心蘭（Oncidium spp.）CHS基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化導(dǎo)致基因失活，使得蜜導(dǎo)區(qū)域喪失了紅色的色素斑點(diǎn)［103］；牡丹‘島錦’bHLH1的甲基化是其花瓣呈紅白雙色的原因［104］；而桃花雜色花蕾的形成是因?yàn)長DOX的甲基化降低了基因活性，花青素的合成減少［105］。紫斑牡丹花瓣中PrF3H和PrANS啟動(dòng)子處于高度甲基化狀態(tài)，而隨著花瓣發(fā)育，其在斑部區(qū)域的甲基化水平顯著降低，非斑部依舊維持較高水平，進(jìn)而導(dǎo)致了花青素的差異積累［106］。

6 展望

花斑促進(jìn)了自然界中花色表型的多樣化，顯著增加了花卉的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)也折射出被子植物在適應(yīng)環(huán)境變化和提升生存能力過程中的進(jìn)化趨勢。因此，探究花斑形成的機(jī)理對(duì)生物多樣性形成和生物進(jìn)化具有重要意義。已報(bào)道的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制主要圍繞類黃酮代謝通路，MYB轉(zhuǎn)錄因子仍然是大多數(shù)植物花斑形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而一些發(fā)育類基因也逐漸被鑒定出具備調(diào)控花青素合成的新功能。雖然現(xiàn)今的研究無法提出一個(gè)完整的具有普適性的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但在不同植物中發(fā)現(xiàn)的多種調(diào)控模式極大地促進(jìn)了花斑研究的進(jìn)程（圖2）。新的轉(zhuǎn)錄因子挖掘、轉(zhuǎn)錄因子的層級(jí)調(diào)控、生物代謝的協(xié)同選擇以及套用數(shù)學(xué)模型（位置效應(yīng)和“反應(yīng)-擴(kuò)散”等）解析花斑形成［107］都是后續(xù)研究的諸多方向，有望能從不同角度不同層次解析并完善觀賞植物花斑形成的分子機(jī)理。