川芎嗪通過(guò)抑制NLRP3 炎性小體活化對(duì)腎結(jié)石大鼠腎臟的保護(hù)作用

王 振，楊秀書(shū)，陳衛(wèi)紅，田 野，王曉東，儲(chǔ)鑄鋼，羅光恒

（貴州省人民醫(yī)院泌尿外科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

腎結(jié)石通常指結(jié)石出現(xiàn)于腎盞、腎盂及腎盂與輸尿管之間的結(jié)石［1］。近幾年，國(guó)內(nèi)約5% ～15%的人群遭受該疾病的困擾，且有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)［2-3］。腎結(jié)石的發(fā)病多與環(huán)境和飲食習(xí)慣等因素相關(guān)［4-5］。腎鈣質(zhì)沉積癥會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腎損傷，血清中肌酐、尿素氮水平，尿液中的尿肌酐、尿微量白蛋白水平異常［6-7］。草酸鈣晶體的沉積也會(huì)誘使NLRP3 炎癥小體的激活進(jìn)而誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞IL-1β 的分泌，最終導(dǎo)致腎內(nèi)炎癥反應(yīng)［8］。炎癥小體介導(dǎo)caspase-1 參與細(xì)胞焦亡為一種炎性細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞焦亡能夠加重腎損傷的病理?yè)p害［9-10］。

川芎嗪是川芎的生物堿類活性成分［11］。川芎嗪能通過(guò)調(diào)控NLRP3 抑制炎癥因子的產(chǎn)生，對(duì)急性肺損傷大鼠具有保護(hù)作用［12］。NLRP3 炎癥小體是分布于細(xì)胞胞漿內(nèi)的蛋白復(fù)合體，包括NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1 （caspase-1），能識(shí)別內(nèi)外環(huán)境中刺激信號(hào)，激活caspase-1，促進(jìn)白介素1β （IL-1β） 等細(xì)胞因子的分泌［13］。但川芎嗪是否能通過(guò)調(diào)控NLRP3 的激活減輕腎結(jié)石誘導(dǎo)的腎損傷，還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)建立大鼠腎結(jié)石模型探究川芎嗪對(duì)腎結(jié)石導(dǎo)致的腎臟損傷的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 試劑與藥物 川芎嗪（編號(hào)DR10670），純度≥98%，購(gòu)自鼎瑞化工（上海） 有限公司。NGAL、IL-1β、IL-18 試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司； IL-1β、IL-18、NLRP3 抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司； HRP 標(biāo)記的IgG 山羊抗小鼠二抗、cleaved-caspase1 抗體均購(gòu)自生工生物工程（上海） 股份有限公司； DAPI 封片劑（貨號(hào)40727ES10）、TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)40307ES20）、蘇木精-尹紅染料（貨號(hào)60502ES50） 均購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司； β-肌動(dòng)蛋白（β-actin） 抗體（批號(hào)TA-09）、DAB 顯色液（批號(hào)k175914A） 均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司； 尿微量白蛋白酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè) （ELISA） 試劑盒（批號(hào)GR201802-1） 購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司。氯化銨購(gòu)自上海瀚香生物科技有限公司； 乙二醇購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠24 只，體質(zhì)量195～210 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （川） 2020-0030］。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12 h/12 h 明暗交替，溫度20 ～26 ℃，相對(duì)濕度40% ～70%，自由飲水進(jìn)食。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模 將大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，川芎嗪低、高劑量組，每組6 只?？瞻捉M大鼠正常飼喂，每天灌胃給予蒸餾水2 mL。其余各組大鼠給予添加1.25%乙二醇的水，自由飲用，持續(xù)14 d，同時(shí)每天灌胃給予1%氯化銨2 mL 建立大鼠腎結(jié)石模型。實(shí)驗(yàn)第2 天起，空白組和模型組大鼠每天灌胃給予生理鹽水2 mL，川芎嗪低、高劑量組大鼠每天灌胃給予50、100 mg/kg 川芎嗪，持續(xù)4周。給藥結(jié)束后，收集大鼠24 h 尿液用于生化指標(biāo)檢測(cè)。處死大鼠收集血液以及腎臟組織用于后續(xù)各指標(biāo)檢測(cè)。

2.2 川芎嗪對(duì)腎結(jié)石大鼠血清、尿液生化指標(biāo)影響 各組大鼠靜脈取血，3 000 r/min 離心10 min，收集上清，采用半自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)大鼠血清尿素、血肌酐水平。取“2.1” 項(xiàng)下各組大鼠24 h 尿液，采用半自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)大鼠尿肌酐水平。

2.3 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清NGAL、IL-1β、IL-18、尿微量白蛋白的水平 取“2.1” 項(xiàng)下各組大鼠血液，4 ℃下放置1 h，4 ℃、3 000 r/min 離心5 min，收集上清液備用。嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)大鼠尿微量白蛋白的水平。用洗滌液或樣品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至所需濃度，按排列順序依次加入50～100 μL/孔稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)液、各組大鼠血清上清液、去離子超純水，室溫或孵育30 ～60 min。采用多功能酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值，根據(jù)各個(gè)孔的吸光度值分析大鼠血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平。

2.4 HE 染色觀察大鼠腎組織病理變化 取各組大鼠腎組織，用提前預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH 7.4） 和生理鹽水沖洗。腎組織用4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE 染色。評(píng)估腎組織病理改變的嚴(yán)重程度，對(duì)雙腎結(jié)石數(shù)目進(jìn)行評(píng)分（無(wú)結(jié)石、結(jié)晶形成為1 分； 少量結(jié)石、結(jié)晶形成，每個(gè)視野3 個(gè)以下為2 分； 較多結(jié)石、結(jié)晶形成，每個(gè)視野3～5 個(gè)為3 分； 較多結(jié)石、結(jié)晶形成，每個(gè)視野6～10 個(gè)為4 分）。

2.5 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組大鼠腎組織，PBS清洗，多聚甲醛固定過(guò)夜，石蠟包埋，切片，水化，脫蠟，37 ℃避光孵育30 min，使細(xì)胞膜變通透，用100 μL 1×Equilibration Buffer 固定10 ～30 min，吸出上清液用Alexa Flour 488-dUTP Labeling Mix 37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌，用含DAPI 封片劑封閉細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下采集圖像進(jìn)行分析。

2.6 Western blot 法檢測(cè)腎組織NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá) 將各組大鼠腎組織切成小塊，稱取相同質(zhì)量，加入300 μL 蛋白裂解液，冰上超聲裂解10 min，100 ℃金屬浴10 min，于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。采用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液后加熱變性，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法將蛋白轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，與兔抗鼠NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18、β-actin 一抗稀釋液在4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST 清洗4 次，與山羊抗兔IgGHRP 二抗稀釋液室溫孵育1 h，TBST 清洗4 次，ECL 顯色，定影，將膠片進(jìn)行掃描，通過(guò)Image J 圖像分析軟件分析條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 川芎嗪對(duì)腎結(jié)石大鼠腎功能和炎癥水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中尿素、肌酐及尿液中24 h 尿蛋白水平升高（P＜0.01），尿肌酐水平降低（P＜0.01），血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，川芎嗪各劑量組大鼠24 h 尿蛋白水平降低（P＜0.05，P＜0.01），川芎嗪高劑量組大鼠血清肌酐水平降低（P＜0.01），尿肌酐水平升高（P＜0.01），血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 川芎嗪對(duì)腎結(jié)石大鼠腎功能和炎癥水平的影響（±s，n＝6）

3.2 川芎嗪對(duì)腎結(jié)石大鼠腎臟病理的影響 空白組大鼠腎臟組織被膜較為完整，未見(jiàn)變性、壞死和脫落，未見(jiàn)明顯病理改變； 模型組大鼠出現(xiàn)部分腎小管有所擴(kuò)張，伴隨上皮細(xì)胞扁平化，部分腎皮質(zhì)和髓質(zhì)腎小管管腔內(nèi)見(jiàn)不著色、帶折光性的透明結(jié)晶沉積，亦可見(jiàn)細(xì)胞管型，腎小管變性壞死區(qū)域間質(zhì)內(nèi)見(jiàn)少量纖維組織增生，以核呈長(zhǎng)梭形的纖維細(xì)胞增生為主，部分伴有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)； 川芎嗪各劑量組大鼠部分腎皮質(zhì)和髓質(zhì)腎小管管腔內(nèi)見(jiàn)透明結(jié)晶沉積，腎小管變性壞死區(qū)域間質(zhì)內(nèi)見(jiàn)少量纖維組織增生，提示川芎嗪能改善大鼠腎組織的病變，見(jiàn)圖2A。與空白組比較，模型組大鼠腎結(jié)石評(píng)分升高（P＜0.01）； 與模型組比較，川芎嗪各劑量組大鼠腎結(jié)石評(píng)分降低（P＜0.01），見(jiàn)圖2B。與空白組比較，模型組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01），腎組織凋亡陽(yáng)性細(xì)胞增加； 與模型組比較，川芎嗪各劑量組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.01），氯化銨晶體結(jié)石造成的腎臟細(xì)胞凋亡現(xiàn)象則幾乎消失，提示川芎嗪能夠減弱結(jié)石造成的細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖2C～2D。

圖2 川芎嗪對(duì)腎結(jié)石大鼠腎臟病理的影響（±s，n＝6）

3.3 川芎嗪對(duì)腎結(jié)石大鼠腎組織 NLRP3、cleavedcaspase1、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠腎組織NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，川芎嗪各劑量組大鼠腎組織IL-18 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），川芎嗪高劑量組大鼠腎組織NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 川芎嗪對(duì)腎結(jié)石大鼠腎組織NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）

4 討論

腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的疾病，其中泌尿系結(jié)石能夠引起尿路損傷和感染甚至泌尿系的梗阻，治療不及時(shí)或長(zhǎng)期的存在，還會(huì)影響腎臟功能，增加泌尿系腫瘤的發(fā)生概率［14］。腎結(jié)石通常也會(huì)伴隨腎損傷、腎功能異常等其他常見(jiàn)并發(fā)癥［15］。因此，尋找新的藥物對(duì)腎結(jié)石造成的腎損傷進(jìn)行修復(fù)能有效改善患者的生活質(zhì)量，降低腎結(jié)石的治療成本。本研究利用氯化銨建立腎結(jié)石大鼠模型，并探究川芎嗪對(duì)腎臟NLRP3 炎癥小體的抑制作用以及對(duì)腎臟功能的改善作用。結(jié)果表明，腎結(jié)石大鼠血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平升高，血清肌酐、尿素和尿肌酐、24 h 尿蛋白水平出現(xiàn)異常，表明腎結(jié)石大鼠出現(xiàn)腎功能異常。川芎嗪可降低腎結(jié)石大鼠血清肌酐和尿素氮水平，同時(shí)也能抑制炎癥因子IL-1β、IL-18 的產(chǎn)生，提示其能緩解腎結(jié)石造成的腎損傷并減弱腎結(jié)石造成的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腎臟的保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)是腎臟損傷的重要因素，NLRP3 是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵啟動(dòng)因子［16-18］。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體在各類腎病所導(dǎo)致的腎損傷過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的作用。NLRP3 炎癥小體能通過(guò)誘導(dǎo)caspase-1 活化，促使IL-1β、IL-18 的產(chǎn)生，使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。腎結(jié)石造成的腎功能異常會(huì)出現(xiàn)NLRP3 炎癥小體的激活，導(dǎo)致腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生，影響腎臟的功能［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可降低腎結(jié)石大鼠腎臟IL-1β、TNF-α 水平，同時(shí)減弱cleavedcaspase1 蛋白表達(dá)，提示川芎嗪可抑制腎結(jié)石誘導(dǎo)的NLRP3 炎癥小體的活化，從而抑制炎癥因子水平，起到保護(hù)腎臟的作用。本研究初步探討川芎嗪對(duì)腎結(jié)石大鼠的保護(hù)作用，對(duì)于其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。