基于PI3K/Akt/NF-κB 通路探討復(fù)方甘草酸苷對(duì)病毒性肺炎小鼠肺損傷的保護(hù)作用

李 梅，王 麗，夏亞飛，閻 姝*

（1.天津大學(xué)，天津 300100； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011； 3.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192； 4.天津大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，天津 300100； 5.天津市南開醫(yī)院，天津 300100）

病毒性肺炎是感染呼吸道病毒引起的肺部炎癥，是威脅人類健康的主要疾病之一。通常情況下，病毒性肺炎癥狀輕微且具有自限性，但重癥也可引起膿毒血癥、高碳酸血癥、低氧血癥、急性呼吸衰竭、循環(huán)系統(tǒng)衰竭，甚至危及生命［1］。尤其是高傳染性、致死率的病毒性肺炎，如果防控不及時(shí)，會(huì)造成重大的公共衛(wèi)生事件，對(duì)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)運(yùn)行造成長(zhǎng)期、持續(xù)的負(fù)面影響。2019 年，新型冠狀病毒（COVID-19） 來勢(shì)兇猛，迅速蔓延，全球流行，對(duì)全球的生產(chǎn)、生活產(chǎn)生了巨大影響［2］。因此尋找具有抗病毒性肺炎作用的藥物具有積極作用。

現(xiàn)代研究表明，甘草酸制劑作為傳統(tǒng)的抗炎、保肝藥，聯(lián)合應(yīng)用能夠減少重癥肺炎的滲出，降低各項(xiàng)肝功能指標(biāo)和炎癥指標(biāo)，患者病程縮短，住院時(shí)間減少［3-4］。有研究報(bào)道稱，復(fù)方甘草酸苷可以抑制傳染性非典型肺炎（SARS）病毒的復(fù)制，發(fā)揮非特異性抗炎作用，且副作用較少［5］。但復(fù)方甘草酸苷抗肺炎病毒的作用機(jī)制尚不十分明確，本研究以病毒性肺炎小鼠為研究對(duì)象，探討復(fù)方甘草酸苷對(duì)病毒性肺炎小鼠肺損傷的保護(hù)作用，初步探究其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)成年雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量（20 ±2） g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2019-0008］，在安靜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，相對(duì)濕度55% ～60%，給予充足清潔飲水，自由攝食。實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過（倫理號(hào)2021-SYDWLL-000038）。

1.2 試劑與藥物 復(fù)方甘草酸苷（日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社，批號(hào)H20181051）。POLY （I： C） （上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)S18188）； 地塞米松注射液（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H37021967）； 小鼠IL-10、IL-6、IL-4 ELISA 試劑盒 （上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)ml037873、ml063159、ml063156）； 小鼠 IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒 （上海藍(lán)基生物科技有限公司，貨號(hào)E02I0010、E02T0008）； 兔抗小鼠NF-κB p65、Akt、p-Akt、β-actin 抗體 （美國(guó)Proteintech 公司，貨號(hào)10745-1-AP、60203-2-Ig、66444-1-Ig、20536-1-AP）； 兔抗小鼠p-NF-κB p65 抗體（美國(guó)CST 公司，貨號(hào)3033）； 兔抗小鼠PI3、p-PI3 激酶抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)bs-10657R、bs-6417R）； BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)PC0020）。

1.3 儀器 Sorvall ST 16R 型高性能通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）； Nikon ECLIPSE TS100 型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon 公司）； 電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)印槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；搖床（天津歐諾儀器股份有限公司）。

2 方法

2.1 病毒性肺炎小鼠模型的建立 將造模小鼠用異氟烷麻醉后，仰臥位固定于60°傾斜的鼠板上，置于超凈臺(tái)中，保持頭部高、尾部低。充分暴露小鼠頸部并進(jìn)行消毒，逐層暴露氣管，用1 mL 注射器抽吸藥液，左手稍微固定氣管，針頭向心方向斜行刺入氣管，出現(xiàn)落空感之后，稍微平行向前伸入部分針頭，回抽無阻力并有空氣。向內(nèi)緩慢滴注POLY （I： C） 5 mg/kg （溶于50 μL PBS 中），滴注完成后注入少量空氣，使全部藥液進(jìn)入氣管后立即豎起木板，左右輕柔搖動(dòng)使藥液均勻分布在肺內(nèi)。麻醉作用消退后，小鼠恢復(fù)自主呼吸并處于清醒狀態(tài)后，放回鼠籠中，即造模完成。

2.2 分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥組和復(fù)方甘草酸苷低、高劑量組，每組10 只。除正常組外，其余組均制備病毒性肺炎小鼠模型。造模成功后，正常組、模型組小鼠腹腔注射0.5 mL 生理鹽水，每12 h 注射1 次，共給藥2 次。陽性藥物組腹腔注射地塞米松注射液5 mg/kg，共給藥1 次； 復(fù)方甘草酸苷低、高劑量組分別腹腔注射復(fù)方甘草酸苷26、52 mg/kg （臨床等效劑量的1、2 倍），每12 h 注射1 次，共給藥2 次。

2.3 肺泡灌洗液（BALF） 采集 造模及給藥24 h 后，暴露小鼠胸腔，逐層暴露頸部氣管，在小鼠氣管上做“一”字型切口，將小鼠灌胃針插入右主支氣管下端，通過手術(shù)縫合線對(duì)氣管和小鼠灌胃針進(jìn)行結(jié)扎。將小鼠左肺門使用手術(shù)縫合線結(jié)扎牢固，確保左肺處于密閉狀態(tài)。使用注射器抽取1 mL 生理鹽水，與結(jié)扎在頸部氣管的灌胃針頭連接，將生理鹽水緩緩注入小鼠右肺，生理鹽水在肺泡內(nèi)停留15～30 s 后輕柔回吸BALF，灌洗過程中密切觀察生理鹽水有無滲出。反復(fù)抽注3 次，每只小鼠共回收約2.5 mL BALF。

2.4 肺濕/干重比檢測(cè) 收集各組小鼠BALF 后，留取未被灌洗的小鼠左肺，稱量左肺濕重，隨即置于恒溫箱內(nèi)80 ℃烘干48 h，至肺組織質(zhì)量不再減少后，再次稱重，為干重，計(jì)算肺濕/干重比，衡量肺水腫嚴(yán)重程度。

2.5 BALF 總細(xì)胞數(shù)及總蛋白水平檢測(cè) 運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)BALF 總細(xì)胞數(shù)，然后將BALF 于4 ℃、3 000 r/min 條件下離心10 min，留取上清液，使用總蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)BALF 總蛋白水平。

2.6 HE 染色觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變 收集各組小鼠肺組織，用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成3 μm 切片，HE 染色，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變，評(píng)價(jià)肺損傷程度。

2.7 ELISA 法檢測(cè)BALF 中炎癥因子水平 將實(shí)驗(yàn)中收集的BALF 于4 ℃、3 000 r/min 條件下離心10 min，用相應(yīng)的ELISA 試劑盒檢測(cè)BALF 炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 水平，具體操作嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.8 肺組織勻漿液中SOD、GSH-Px 活性與MDA 水平檢測(cè) 肺組織勻漿后使用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，將各組肺組織中蛋白水平進(jìn)行均一化處理，按照試劑盒說明書檢測(cè)肺組織勻漿液中SOD、GSH-Px 活性與MDA 水平。

2.9 Western blot 檢測(cè)肺組織PI3K、Akt、NF-κB p65 蛋白表達(dá) 取小鼠肺組織，使用裂解液裂解組織，離心，留取上清。BCA 法測(cè)定總蛋白濃度，蛋白變性后取30 μg 樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗NF-κB p65 （1 ∶1 000）、p-NF-κB p65 （1 ∶ 1 000）、PI3K （1 ∶ 1 000）、p-PI3K（1 ∶1 000）、Akt （1 ∶5 000）、p-Akt （1 ∶5 000）、β-actin（1 ∶4 000），4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜后ECL 發(fā)光顯色，通過凝膠圖像分析儀成像，采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS Statistics 20.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方甘草酸苷對(duì)病毒性肺炎小鼠肺損傷的影響 如圖1 所示，與正常組比較，模型組小鼠肺濕/干重比值和BALF 中總細(xì)胞數(shù)、總蛋白水平均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組和復(fù)方甘草酸苷高劑量組小鼠肺濕/干重比值和BALF 中總細(xì)胞數(shù)、總蛋白水平均降低（P＜0.01），復(fù)方甘草酸苷低劑量組小鼠BALF 中總細(xì)胞數(shù)、總蛋白水平降低（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠肺濕干/重比值（A） 和BALF 中總細(xì)胞計(jì)數(shù)（B）、總蛋白水平（C） 變化（±s，n＝10）

如圖2 所示，正常組小鼠肺泡間隔正常，肺間質(zhì)無水腫，無明顯炎性細(xì)胞滲出； 模型組肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡腔融合，肺泡間隔增寬，塌陷，間質(zhì)水腫，以及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)； 陽性藥組和復(fù)方甘草酸苷各劑量組肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰，肺泡壁稍增厚，伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 各組小鼠肺組織HE 染色

3.2 復(fù)方甘草酸苷對(duì)病毒性肺炎小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的影響 如圖3 所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF 中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平升高（P＜0.01），IL-4 和IL-10 水平無明顯變化（P＞0.05）； 與模型組比較，陽性藥組和復(fù)方甘草酸苷各劑量組小鼠BALF 中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），陽性藥組和復(fù)方甘草酸苷高劑量組小鼠BALF 中IL-4 和IL-10 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 各組小鼠BALF 中炎癥因子水平（±s，n＝10）

3.3 甘草酸苷對(duì)病毒性肺炎小鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的影響 如表1 所示，與正常組比較，模型組小鼠肺組織SOD、GSH-Px 活性降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和復(fù)方甘草酸苷高劑量組小鼠肺組織SOD、GSH-Px 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA水平降低（P＜0.01），復(fù)方甘草酸苷低劑量組小鼠肺組織GSH-Px 活性升高（P＜0.05），MDA 水平降低（P＜0.05）。

表1 各組小鼠肺組織氧化應(yīng)激相關(guān)因子水平比較（±s，n＝10）

表1 各組小鼠肺組織氧化應(yīng)激相關(guān)因子水平比較（±s，n＝10）

注： 與正常組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別SOD/（U·mg prot-1）GSH-Px/（U·mg prot-1）MDA/（nmol·mg prot-1）正常組54.95±10.621.25±3.261.80±0.35模型組28.05±13.19＃＃8.56±4.77＃＃3.97±1.50＃＃陽性藥組40.12±11.99*15.59±5.72**2.41±0.47**復(fù)方甘草酸苷低劑量組32.04±7.1912.74±3.41*2.80±0.70*復(fù)方甘草酸苷高劑量組40.04±4.83*15.47±3.86**2.50±0.44**

3.4 甘草酸苷對(duì)病毒性肺炎小鼠肺組織PI3K/Akt/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，與正常組比較，模型組小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-p65/p65 蛋白表達(dá)比值升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組和復(fù)方甘草酸苷各劑量組小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-p65/p65 蛋白表達(dá)比值降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 各組小鼠肺組織PI3K/Akt/NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)（±s，n＝10）

4 討論

病毒性肺炎是由病毒經(jīng)呼吸道浸入肺上皮細(xì)胞引起的肺間質(zhì)實(shí)質(zhì)性炎癥，其發(fā)病機(jī)制多與炎癥風(fēng)暴、氧化應(yīng)激有關(guān)［6-7］。POLY （I： C） 是一種合成的雙鏈核糖核酸，能夠模擬病毒感染的免疫激活機(jī)制，經(jīng)常用于病毒性肺炎模型的建立［8-9］。本研究通過向氣管內(nèi)緩慢滴注POLY （I：C） 構(gòu)建病毒性肺炎小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡腔融合，肺泡間隔增寬，塌陷，間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥因子水平升高，提示模型構(gòu)建成功。

復(fù)方甘草酸苷是由甘草酸苷、甘氨酸和鹽酸半胱氨酸等成分組成的復(fù)方制劑，每1 mL 中含甘草酸苷2 mg?，F(xiàn)代研究表明，復(fù)方甘草酸苷能夠通過抑制花生四烯酸的代謝，抑制炎癥反應(yīng)，緩解大鼠肺損傷，延緩新型冠狀病毒的擴(kuò)散［10-11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方甘草酸苷干預(yù)后，小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁稍增厚，伴少量炎性浸潤(rùn)，提示復(fù)方甘草酸苷對(duì)病毒性肺炎肺損傷具有改善作用。

炎癥細(xì)胞聚集是病毒性肺炎的重要發(fā)病機(jī)制，大量的炎性細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子和趨化因子，使肺內(nèi)皮細(xì)胞活化，白細(xì)胞遷移、增殖，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分泌，募集更多炎性因子，造成過度炎癥，加重組織、器官的損壞［12-13］。現(xiàn)代研究表明，甘草提取物及甘草酸均可通過抑制NF-κB 的活性，抑制急性肺損傷小鼠炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用［14-15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方甘草酸苷能降低BALF 中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，提示復(fù)方甘草酸苷能夠抑制炎癥因子的分泌，發(fā)揮抗炎作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是病毒性肺炎的另一重要機(jī)制。病毒感染的過程中，大量的中性粒細(xì)胞聚集在炎癥部位，激活活性氧（ROS），而過量的ROS 使炎性復(fù)合體中的蛋白損傷，炎性復(fù)合體活性下降會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失衡，加重組織損傷［16］。有研究報(bào)道，甘草酸及其單銨鹽均可增加SOD、GSH-Px 活性，降低MDA 水平［17-18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方甘草酸苷可上調(diào)肺組織中SOD、GSH-Px 活性，降低MDA水平，表明其具有抗氧化應(yīng)激作用。

PI3K 信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化等多種生物功能。Akt 是PI3K 的主要下游效應(yīng)分子，活化的Akt 通過增強(qiáng)IκB 激酶的降解，使NF-κB 活化，活化的NF-κB 誘導(dǎo)炎癥因子、趨化因子的表達(dá)，使大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、聚集在炎癥部位，加速炎癥的發(fā)生、發(fā)展［19-20］。現(xiàn)代研究表明，甘草酸可以通過抑制花生四烯酸、NF-κB、PI3K 等多種代謝產(chǎn)物，使炎性遞質(zhì)（PGE2、PIG2、TXA2） 的釋放減弱，發(fā)揮抗炎作用［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方甘草酸苷干預(yù)后，小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-p65/p65 比值下降，表明復(fù)方甘草酸苷能夠抑制PI3K/Akt/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，起到保護(hù)肺損傷作用。

綜上所述，復(fù)方甘草酸苷能夠改善病毒性肺炎小鼠肺組織損傷，減輕炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/NF-κB 通路活化有關(guān)。