UPLC-MS/MS 法分析小兒感冒顆粒中白薇投料情況

李 沁，嚴璐佳，黃曉姍，陳在敏

（福建省食品藥品質量檢驗研究院，福建 福州 350000）

小兒感冒顆粒由白薇、菊花等10 味中藥組成，是治療小兒風熱感冒的常用中成藥，用于急性上呼吸道感染、流感病毒感染等［1-5］，目前關于該制劑質量的研究大多集中在采用氣相或液相色譜法控制廣藿香、薄荷、板藍根、大青葉、菊花、連翹等藥味［6-15］，鮮有涉及白薇，并且尚無其專屬性成分測定的報道。課題組前期對全國范圍內小兒感冒顆粒的生產企業(yè)進行調研，發(fā)現(xiàn)一部分企業(yè)提供的白薇與2020 年版《中國藥典》 規(guī)定的性狀特征不一致［16］，經鑒定為蘿藦科鵝絨藤屬植物老瓜頭CynanchumkomaroviiAl.Iljinski 的干燥根和根莖，也是目前市場上白薇最常見、最易混淆的偽品，但其全株有毒，相關成分主要是揮發(fā)油、生物堿，對動物心、腎、肺部都有不同程度的毒性作用［17-19］，故以其替代投料時將會嚴重影響小兒感冒顆粒臨床有效性，并給患兒帶來極大的安全隱患。

前期報道，穆向榮等［20］在女金丸中發(fā)現(xiàn)了疑似老瓜頭摻偽白薇的現(xiàn)象，并采用HPLC-QE-Orbitrap-MS 高分辨質譜確認其特征性成分為6-芥子?；崽恰１緦嶒炘诖嘶A上建立UPLC-MS/MS 法檢查小兒感冒顆粒中白薇投料情況，一方面以對羥基苯乙酮檢查是否白薇投料正確，另一方面以6-芥子?；崽菣z查是否使用混淆品老瓜頭投料，從而為該制劑質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 AB Sciex 5500 超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質譜聯(lián)用儀（美國AB Sciex 公司）； XPR105 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； Milli-QA 超純水機（美國默克密理博公司）； Elmasonic S150 超聲波清洗器（德國艾瑪公司）。

1.2 試劑與藥物 對羥基苯乙酮（批號111897-201602，純度99.9%）、6-芥子?；崽牵ㄅ?12074-202201） 對照品及白薇（白薇，批號121518-202105； 蔓生白薇，批號121755-202101） 對照藥材均購于中國食品藥品檢定研究院。老瓜頭由生產企業(yè)寄送，經福建省食品藥品質量檢驗研究院金鳴主任藥師鑒定為蘿藦科鵝絨藤屬植物老瓜頭CynanchumkomaroviiAl.Iljinski 的干燥根和根莖。缺白薇陰性樣品由太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司提供，標準制劑、老瓜頭陽性樣品均由實驗室自制，統(tǒng)一按小兒感冒顆粒處方、工藝模擬制備。小兒感冒顆粒來自31 家藥品生產企業(yè)或經營企業(yè)，共91 批，均源于2022 年度國家藥品抽檢行動，覆蓋全國除港澳臺地區(qū)以外的31 個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市），歷時5 個月，具有代表性，基本可反映該制劑本年度質量情況。乙腈、乙酸銨為色譜純； 其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取對羥基苯乙酮、6-芥子?；崽菍φ掌愤m量，甲醇溶解稀釋，制成每1 mL 分別含兩者19.90、22.16 μg/mL 的母液，分別精密吸取0.5、5 mL，置于100 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得。

2.1.2 供試品溶液 取本品適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 甲醇，密塞，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz） 處理30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 藥材溶液 取藥材（白薇、蔓生白薇、老瓜頭）粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 甲醇，超聲（功率250 W，頻率40 kHz） 處理30 min，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置于100 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得。

2.1.4 陰性樣品、陽性樣品、標準制劑溶液 取缺白薇陰性樣品、老瓜頭陽性樣品、標準制劑適量，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 UPLC-MS/MS 分析條件

2.2.1 色譜 Waters BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動相乙腈（A） -1 mmol/L 乙酸銨（B），梯度洗脫（0 ～9 min，6% ～18.5% A）； 體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃； 進樣量1 μL。

2.2.2 質譜 電噴霧離子源； 負離子掃描； 多反應監(jiān)測模式； 電離電壓（IS） -4 500 V； 氣簾氣（CUR） 35.0 psi（1 psi＝6.895 kPa）； 碰撞氣（CAD） 7 psi； 輔助加熱氣（GS1） 55.0 psi； 干燥氣 （GS2） 60.0 psi； 離子化溫度600 ℃，其他參數(shù)見表1。

表1 各成分質譜參數(shù)

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取對照品、藥材、缺白薇陰性樣品、老瓜頭陽性樣品、標準制劑溶液適量，在“2.2” 項條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，對羥基苯乙酮作為白薇專屬性成分，同時在藥材（白薇、蔓生白薇）、標準制劑溶液中檢出，可用于檢查制劑是否為正品投料； 6-芥子?；崽亲鳛槔瞎项^專屬性成分，同時在藥材（老瓜頭）、老瓜頭陽性樣品溶液中檢出，可用于檢查制劑是否為該偽品替代投料。

圖1 各成分UPLC-MS/MS 提取離子流圖

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.1.1” 項下母液適量，甲醇稀釋成系列質量濃度，在“2.2” 項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，并分別以信噪比（S/N） ＝10、3 為定量限、檢出限，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.3.3 精密度試驗 取本品（生產企業(yè)AA，批號201213）適量，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定6 次，測得對羥基苯乙酮、6-芥子?；崽欠迕娣eRSD 分別為1.04%、1.10%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（生產企業(yè)AA，批號201213），室溫下于0、5、10、15、20、25 h 在“2.2” 項條件下進樣測定，測得對羥基苯乙酮、6-芥子?；崽欠迕娣eRSD 分別為1.97%、1.98%，表明溶液在25 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取本品（生產企業(yè)AA，批號201213）6 份，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項條件下進樣測定，測得對羥基苯乙酮、6-芥子酰基蔗糖含量RSD 分別為1.52%、1.80%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取各成分含量已知（對羥基苯乙酮5.98 μg/g、6-芥子?；崽?5.18 μg/g） 的本品（生產企業(yè)AA，批號201213） 9 份，每份約0.25 g，精密稱定，平均分成3 組，分別精密加入對羥基苯乙酮（1.99 μg/mL）對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL 及6-芥子?；崽牵?2.16 μg/mL） 對照品溶液0.5、0.6、0.8 mL，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項條件下進樣測定，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝9）

2.3.7 基質效應考察 精密吸取“2.1.1” 項下母液適量，分別用甲醇、缺白薇陰性樣品溶液稀釋成含對羥基苯乙酮0.019 9、0.398、1.99 μg/mL，6-芥子?；崽?.055 4、1.108、5.54 μg/mL 的溶液，在“2.2” 項條件下進樣測定，計算基質效應。結果，不同質量濃度對羥基苯乙酮基質效應分別為104.1%、100.5%、99.0%，6-芥子酰基蔗糖分別為103.5%、100.3%、98.9%，表明其影響較小。

2.4 樣品含量測定 取31 家生產企業(yè)91 批樣品，按“2.1.2” 項下方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.2” 項條件下進樣測定，計算含量，結果見表4。由此可知，有32 批樣品存在投料問題，總不合格率為35.2%，來自14 家生產企業(yè)，占總數(shù)的45.2%； 投料情況分為4 種，分別為未投料 （1 批，占比1.1%）、正品投料 （59 批，占比64.8%）、摻雜投料（10 批，占比11.0%）、全偽投料（21批，23.1%），表明老瓜頭替代白薇投料是一種普遍現(xiàn)象，其原因可能是兩者性狀相近，極易混淆，部分生產企業(yè)藥材鑒定水平較低，無法分辨而導致誤買誤用，另外老瓜頭分布廣泛，資源豐富，價格低廉，也不排除部分生產企業(yè)存在為節(jié)約成本以其代替白薇投料的可能。

表4 各成分含量測定結果（n＝3）

各成分含量分布見圖2，可知對羥基苯乙酮含量分布較集中，表明正品投料時其差異較小，制劑質量穩(wěn)定； 6-芥子?；崽呛坎町愝^大，可能是由于老瓜頭摻偽量不同，或6-芥子酰基蔗糖在老瓜頭中含量差異較大所致。

圖2 各成分含量分布

3 討論

本實驗考察了提取溶劑50% 甲醇、70% 甲醇、甲醇、70%乙醇、乙醇，提取方式超聲、加熱回流，以及提取時間20、30、40 min，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)提取條件為甲醇超聲提取30 min。另外，流動相中加入適量乙酸銨可加強離子響應，并且其效果優(yōu)于甲酸銨、甲酸、乙酸，但其濃度過大時會產生離子抑制效果，在1 mmol/L 時最佳。

對羥基苯乙酮作為白薇特征性成分，在廣東、四川、山東公布的白薇配方顆粒的標準中均有收錄； 6-芥子?；崽亲鳛槔瞎项^特征性成分，在文獻［20］ 中首次報道，研究表明該藥材冒充白薇經原粉投料時，可通過液相色譜-紫外檢測器在女金丸中檢查出該成分。本實驗發(fā)現(xiàn)，投料用的藥材經提取后藥味較多，成分復雜，僅使用紫外檢測器時特征峰容易受到其他色譜峰的干擾，影響判定結果。

4 結論

為了避免檢測出現(xiàn)假陽性，增加檢查方法的專屬性、準確性、靈敏性，提高特征性成分檢查的適用性，本實驗建立UPLC-MS/MS 方法檢查小兒感冒顆粒中白薇投料情況，并且同時使用了白薇專屬性成分、混淆品老瓜頭標志性成分，該方法簡便快速，準確靈敏，兼顧定性、定量分析，能科學準確地反映上述情況，并可為含白薇制劑的摻偽檢查提供參考。