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    大孔樹脂分離純化茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯工藝優(yōu)化

    2023-11-23 10:58:20
    中成藥 2023年11期
    關(guān)鍵詞:大孔兒茶素茶多酚

    曹 敏

    (廣西輕工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院有限公司,廣西 南寧 530031)

    茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱,主要由兒茶素類、花色素類、花黃素類、縮酸、縮酚酸類物質(zhì)組成。其中,表沒食子兒茶素沒食子酸酯是兒茶素中含量最高、活性最強(qiáng)的成分,常占后者總量的50%[1],具有特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)、很強(qiáng)的抗氧化活性,在抗腫瘤、抗突變、抗衰老、抗炎、抗病毒等方面有著出色表現(xiàn)[2-6],尤其是在治療艾滋病方面,該成分能通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)對HIV 感染的抑制[7-9],并且它可作為腫瘤多耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑,改善癌細(xì)胞對化療的敏感性,并減輕對心臟的毒性[10]。

    目前,表沒食子兒茶素沒食子酸酯高純品售價(jià)一直居高不下,主要是由于其生產(chǎn)成本過高,故需優(yōu)化其生產(chǎn)工藝以降低成本,從而更廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化妝品等行業(yè)。因此,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化大孔樹脂分離純化茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯工藝,以期為該成分進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    Waters 515/2489 高效液相色譜儀,配置紫外吸收檢測器(美國Waters 公司); VWD 紫外檢測器(美國安捷倫科技公司); N4S 紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司); AP135W 分析天平(十萬分之一,日本島津公司); ZHWY-211B 恒溫?fù)u床(常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司); DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司); KQ3200DB 超聲波提取儀(昆山市超聲儀器有限公司); CCT-3300 超純水器(重慶力德高端水處理設(shè)備研發(fā)有限公司); 玻璃層析柱(30 mm×600 mm,海門市三和新華玻璃試驗(yàn)儀器廠)。

    表沒食子兒茶素沒食子酸酯對照品 (美國Cato Research Chemicals Inc 公司); 98%茶多酚(四川暢維生物科技有限公司)。D101、HZ801、HZ816、HZ818 大孔樹脂(上海華震科技有限公司); AB-8、X-5 大孔樹脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。甲醇為色譜純[默克化工技術(shù)(上海)有限公司]; 冰醋酸為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司); 其他試劑均為分析純; 水為高純水(自制)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 供試品溶液制備 在茶多酚粉末中加入適量純水或乙醇,50 ℃水浴10 min,制成相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù),即得。

    2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取表沒食子兒茶素沒食子酸酯對照品4.88、3.90、2.93、2.20、1.10、0.55、0.28、0.14、0.07、0.03 mg,無水乙醇溶解并定容至5 mL量瓶中,搖勻,即得。

    2.3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量測定 采用HPLC 法。

    2.3.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[11] 報(bào)道,Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm); 流動(dòng)相甲醇-水-醋酸(24 ∶75 ∶1); 體積流量1.0 mL/min; 柱溫35 ℃;檢測波長276 nm; 進(jìn)樣量10 μL; 運(yùn)行時(shí)間14 min。

    2.3.2 線性關(guān)系考察 取對照品溶液適量,0.22 μm 微孔濾膜過濾,在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度(Y) 對峰面積(X) 進(jìn)行回歸,得方程為Y=0.000 000 068X-0.000 79 (r=0.999 95),在0.006~0.976 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.3.3 測定方法 取“2.1” 項(xiàng)下供試品溶液0.2 mL,無水乙醇定容至10 mL,在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算含量[12],公式為含量=C×V1×V2/V3,其中C為表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度,V1為供試品溶液總體積,V2為待測液體積,V3為供試品溶液取樣體積。

    2.4 大孔樹脂篩選

    2.4.1 預(yù)處理 各大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h,先用洗脫液洗至加入純水不渾濁,再用純水洗至無醇味。另外,由于上述樹脂較干凈,并且結(jié)合廠家提供的預(yù)處理方法,故均不使用酸或堿進(jìn)行預(yù)處理,從而更環(huán)保。

    2.4.2 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[12] 報(bào)道,并根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。按“2.1” 項(xiàng)下方法制備含10%茶多酚的供試品溶液(表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度為36.59 mg/mL),準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的6 種大孔樹脂各10.0 g (瀝干水分),置于錐形瓶中,加入30 mL 供試品溶液,封口,在恒溫?fù)u床(25 ℃、70 r/min) 上振蕩吸附4 h,取出,濾過,少量純水清洗表面附著的供試品溶液,合并濾液和清洗液,測定原液、合并液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量,計(jì)算吸附量、吸附率,公式分別為吸附量=M1-M2、吸附率= [(M1-M2) /M1] ×100%,其中M1為原液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量,M2為合并液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量。吸附后的大孔樹脂用500 mL 50%乙醇洗脫,收集洗脫液,測定表沒食子兒茶素沒食子酸酯洗脫量,計(jì)算解吸率,公式為解吸率=[M3/ (M1-M2)] ×100%,其中M3為洗脫液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量。結(jié)果見表1。

    表1 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)結(jié)果

    由此可知,弱極性大孔樹脂對表沒食子兒茶素沒食子酸酯的吸附率、解吸率都比非極性大孔樹脂低,這可能與該成分具有一定極性,較難被弱極性大孔樹脂吸附,并且吸附后由于結(jié)合較牢,中等體積分?jǐn)?shù)(50%左右) 乙醇不易洗脫有關(guān); X-5 吸附量雖然達(dá)740.96 mg,僅次于HZ816,但其解吸率僅為25.53%; HZ818 解吸率雖然達(dá)91.75%,但其吸附率僅為49.61%; HZ816 吸附率、解吸率最高,在很大程度上保證了表沒食子兒茶素沒食子酸酯回收率、樹脂使用壽命,故選擇其進(jìn)行后續(xù)考察。

    2.4.3 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)研究 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的HZ816大孔樹脂10.0 g (瀝干水分),置于錐形瓶中,加入30 mL含10%茶多酚的供試品溶液,封口,在恒溫?fù)u床(25 ℃、70 r/min) 上振蕩吸附4 h,每20 min 取樣1 次,測定吸附前后表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量,計(jì)算樹脂對該成分的比吸附量[公式為比吸附量= (C0-C1) ×V/M,其中C0為吸附前供試品溶液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度,C1為吸附后供試品溶液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量,V為供試品溶液體積,M為大孔樹脂濕重],以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo),比吸附量為縱坐標(biāo)繪制靜態(tài)動(dòng)力曲線[13],見圖1。由此可知,樹脂比吸附量在前30 min 內(nèi)升高程度較快,40 min 后趨于穩(wěn)定,基本達(dá)到吸附平衡。

    圖1 靜態(tài)吸附動(dòng)力曲線

    2.5 分離純化工藝優(yōu)化

    2.5.1 單因素試驗(yàn)

    2.5.1.1 上樣量確定 準(zhǔn)確稱取HZ816 大孔樹脂80.0 g(瀝干水分) 共5 份,濕法裝入玻璃層析柱(30 mm×600 mm) 中,分別以10%、20%、30%、40%、50% 乙醇溶解茶多酚粉末,制成5%乙醇溶液(表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度為20.93 mg/mL),以0.6 BV/h 速率上層析柱,收集流出液(5.0 mL/管),測定流出液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度,以流出體積為橫坐標(biāo),流出液、上樣液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度的比值(C/C0) 為縱坐標(biāo)繪制動(dòng)態(tài)吸附穿透曲線,見圖2 (當(dāng)C/C0=0.1 時(shí),樹脂吸附達(dá)到滲透點(diǎn)[14-15],此時(shí)應(yīng)停止上樣)。由此可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)越高,吸附能力越弱,滲透點(diǎn)越提前,這是由于乙醇具有一定的洗脫能力所致; 10%、20%、30%、40%、50%乙醇溶解的供試品溶液達(dá)到滲透點(diǎn)時(shí),流出體積分別為208、178、167、138、93 mL,比吸附量分別為54.42、46.57、43.69、36.10、24.33 mg/g。再以比吸附量平均值41.02 mg/g 為上樣量計(jì)算基數(shù),為了保證分離效果,上樣量應(yīng)為樹脂用量的10%左右,故其計(jì)算公式為上樣量=41.02×樹脂用量×10%。

    圖2 動(dòng)態(tài)吸附滲透曲線

    2.5.1.2 洗脫體積確定 配制含10% 茶多酚的水溶液5份,每份3 mL,經(jīng)HZ816 大孔樹脂層析柱(瀝干水后樹脂質(zhì)量為80.0 g),分別以20%、25%、30%、40%、50%、60%乙醇洗脫,洗脫速率為0.6 BV/h。以洗脫體積為橫坐標(biāo),洗脫液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線[16],結(jié)果見圖3。由此可知,洗脫至4.0 BV時(shí)除了25%乙醇未能完全洗脫表沒食子兒茶素沒食子酸酯外,其他體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫后該成分質(zhì)量濃度均為0,綜合考慮試劑節(jié)約及后續(xù)濃縮成本,洗脫體積以4.0 BV 為宜。

    圖3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯洗脫曲線

    2.5.1.3 茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響 以30%乙醇為溶劑,配制5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20% 茶多酚乙醇溶液,分別取樣3 mL,經(jīng)HZ816 大孔樹脂層析柱(瀝干水后樹脂質(zhì)量為100 g),以0.6 BV/h 速率洗脫,收集洗脫液(4 mL/管),洗脫體積為4.0 BV,測定洗脫液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度,再合并洗脫液,測定該成分質(zhì)量濃度,計(jì)算洗脫率,結(jié)果見圖4。

    圖4 茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響

    “2.5.1.1” 項(xiàng)下結(jié)果顯示,30% 乙醇配制的供試品溶液比吸附量在43.69 mg/g 左右,而上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)茶多酚乙醇溶液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度分別為18.58、29.27、38.29、46.98、54.96、64.47、75.43 mg/mL。由此可知,表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度低于43.69 mg/mL 時(shí),樹脂吸附未飽和,純度、洗脫率隨著茶多酚質(zhì)量濃度增加而升高; 超過43.69 mg/mL 時(shí),樹脂吸附飽和,未被吸附的溶液向下擴(kuò)散吸附,使得分離區(qū)產(chǎn)生交叉混合,純度、洗脫率隨著茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而降低。

    2.5.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響 配制10%茶多酚溶液9 份,每份3 mL,經(jīng)HZ816 大孔樹脂層析柱(瀝干水后樹脂質(zhì)量為80.0 g),分別以20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%乙醇洗脫,洗脫速率為0.6 BV/h,洗脫體積為4.0 BV,收集洗脫液(4 mL/管),測定洗脫液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度,再合并洗脫液,測定該成分質(zhì)量濃度,計(jì)算洗脫率,結(jié)果見圖5。

    圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響

    “2.5.1.2” 項(xiàng)下結(jié)果顯示,乙醇體積分?jǐn)?shù)越高,洗脫越集中,濃度越高,后續(xù)濃縮越節(jié)能。由此可知,20% 乙醇無法洗脫; 25%乙醇洗脫時(shí)表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度雖然較高,但其洗脫率僅為30%左右; 乙醇體積分?jǐn)?shù)大于30%時(shí),表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度呈降低趨勢,在30% ~45%范圍內(nèi)更明顯,大于45%后趨于穩(wěn)定,而洗脫率在乙醇體積分?jǐn)?shù)大于30%后趨于穩(wěn)定。

    2.5.1.5 洗脫速率對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響 配制10%茶多酚乙醇溶液(30%乙醇溶解),分別取樣3 mL,經(jīng)HZ816 大孔樹脂層析柱(瀝干水后樹脂質(zhì)量為80.0 g),4.0 BV 30% 乙醇分別以0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 BV/h 速率洗脫,收集洗脫液(4 mL/管),測定洗脫液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度,再合并洗脫液,測定該成分質(zhì)量濃度,計(jì)算洗脫率,結(jié)果見圖6。

    圖6 洗脫速率對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響

    洗脫速率越大,洗脫時(shí)間、純化時(shí)間越短,但純度也會有所降低。由此可知,洗脫速率對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響較小,大于0.6 BV/h 后兩者基本趨于穩(wěn)定。

    2.5.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、洗脫速率(C) 為影響因素,按L16(45) 正交表[17]進(jìn)行試驗(yàn),因素水平見表2。

    表2 因素水平

    再以表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度(X)、洗脫率(Y) 的綜合評分為評價(jià)指標(biāo),結(jié)合工藝特點(diǎn),設(shè)定兩者權(quán)重系數(shù)分別為0.6、0.4,計(jì)算綜合評分,公式為綜合評分= (0.6X/98.48+0.4Y/95.98) ×100,并進(jìn)行直觀分析、方差分析[18]。

    直觀分析(表3) 顯示,各因素影響程度依次為B>C>A; 最優(yōu)工藝為A3B2C2,即12.5%茶多酚乙醇溶液,上樣量41.02 mg/g,4.0 BV 30%乙醇洗脫,洗脫速率0.6 BV/h。

    表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

    方差分析(表4) 顯示,各因素影響程度依次為B>C>A; 因素A有顯著影響(P<0.05),B、C無顯著影響(P>0.05); 最優(yōu)工藝為A3B2C2,與直觀分析結(jié)果一致。

    表4 方差分析

    2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.5.2” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表5,可知該工藝穩(wěn)定可行。

    表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

    2.6 樹脂使用壽命測試 采用模擬移動(dòng)床連續(xù)分離技術(shù),對表沒食子兒茶素沒食子酸酯進(jìn)行連續(xù)分離純化中試試驗(yàn),歷時(shí)337 d、八千多個(gè)小時(shí)。到最后停機(jī)時(shí),HZ816 大孔樹脂一次分離得到的表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度達(dá)95.11%,回收率達(dá)78.99%,充分證明了該樹脂具有優(yōu)越的分離性能、較長的使用壽命,為其工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)旨在篩選出可將模擬移動(dòng)床分離技術(shù)應(yīng)用于表沒食子兒茶素沒食子酸酯分離純化的大孔樹脂,它應(yīng)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯有著高吸附率、高解吸率,一次分離純度高,使用壽命長。董海勝等[19]篩選出的ADS-7、NKA-Ⅱ大孔樹脂對表沒食子兒茶素沒食子酸酯的吸附能力分別只有19.06、17.02 mg/g,雖然兩者解吸率較高(分別為88%、92%),但由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過高(分別為60%、70%),導(dǎo)致該成分一次分離純度只能達(dá)到67.9%,工業(yè)上需多步反復(fù)分離才能得到高純度,而且樹脂使用壽命未作進(jìn)一步研究,故無論是吸附能力,還是富集表沒食子兒茶素沒食子酸酯的純度,這2 種樹脂都不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究最終篩選出的HZ816 大孔樹脂對表沒食子兒茶素沒食子酸酯的吸附能力達(dá)41.02 mg/g,在單柱分離純化試驗(yàn)中可將該成分純度提高至93.13%,洗脫率達(dá)94.14%,一次性洗脫基本無殘留,在一定程度上保證了該樹脂可反復(fù)使用; 經(jīng)過連續(xù)337 d 的模擬移動(dòng)床中試分離試驗(yàn)后,該樹脂仍可使表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度達(dá)95.11%,結(jié)晶后產(chǎn)品純度達(dá)98.80%,一次分離回收率達(dá)78.99%,充分證明了其優(yōu)越的分離性能,而且吸附容量高(處理能力強(qiáng)),分離所用的乙醇體積分?jǐn)?shù)低(30%),最大程度降低了成本,可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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