黃芪總苷通過(guò)調(diào)控SIRT1 表達(dá)對(duì)膽汁淤積性肝纖維化小鼠的影響

周 群，高思琦，張霖璋，張 華，劉 偉，劉 平*，陳佳美*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院，上海市中醫(yī)藥化學(xué)生物學(xué)前沿基地，上海 201203）

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病的共同病理過(guò)程，慢性肝炎病毒感染、酒精和膽汁淤積等長(zhǎng)期損害均可導(dǎo)致肝纖維化的進(jìn)展，最終發(fā)展為肝硬化和肝癌［1］。膽汁淤積性肝纖維化是由于肝細(xì)胞或毛細(xì)膽管中膽汁流合成、分泌和排泄異常，肝內(nèi)或肝外膽管阻塞，誘發(fā)持續(xù)性膽汁淤積所致［2］。目前用于治療膽汁淤積性肝纖維化的藥物為熊去氧膽酸和奧貝膽酸，但均面臨部分患者療效不佳和較高的不良事件發(fā)生率等問(wèn)題［3-4］。因此，探求膽汁淤積性肝纖維化的有效治療手段，阻止疾病的進(jìn)程，是當(dāng)前研究需攻克的主要目標(biāo)和方向。

中醫(yī)藥以其多靶點(diǎn)、多途徑、多層次的藥理作用，在肝纖維化治療領(lǐng)域展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪湯及其有效組分黃芪總苷具有良好的抗肝纖維化作用，可通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC） 活化［5］、抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β （transforming growth factor β，TGF-β） 和Notch 信號(hào)通路的活化［6-7］，改善膽管結(jié)扎和二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清肝功能異常變化和肝纖維化程度［8-10］。本研究通過(guò)建立外源性和內(nèi)源性的膽汁淤積性肝纖維化小鼠模型——化合物3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫-2，4，6-三甲基吡啶 （3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydro-2，4，6-collidine，DDC） 喂養(yǎng)和多藥耐藥蛋白2 （multidrug resistance protein 2，Mdr2） 基因敲除，觀察黃芪總苷對(duì)膽汁淤積性肝纖維化的干預(yù)作用，并探索其部分作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量（22±2） g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （滬） 2017-0011］； SPF 級(jí)雄性Mdr2-/-小鼠，體質(zhì)量（22±2）g，購(gòu)自賽業(yè)模式生物研究中心（太倉(cāng)） 有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （蘇） 2018-0003］。所有小鼠均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，恒溫恒濕，晝夜節(jié)律，環(huán)境溫度22 ～24 ℃，相對(duì)濕度30% ～60%，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn) （倫理號(hào)PZSHUTCM200731007）。

1.2 藥物與試劑 DDC （美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，貨號(hào)137030）； 黃芪總苷（本課題組采用大孔樹(shù)脂柱層析法制備，乙醇回流提取2 次，濃縮干燥所得）； 奧貝膽酸（大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號(hào) MB6084）。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素 （total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素 （direct bilirubin，DBIL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL） 生化檢測(cè)試劑盒（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，批號(hào)AUZ7214、AUZ7031、AUZ7121、AUZ7101、AUZ7103、AUZ7105）； 總膽汁酸生化檢測(cè)試劑盒（上海執(zhí)誠(chéng)生物科技有限公司，批號(hào)ZCFEBT009）； 蘇木素-伊紅染色試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號(hào)D006-1-4）； 免疫組化試劑盒［基因科技（上海） 有限公司，貨號(hào)GK500705］； 總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real Time PCR Master Mix （日本TOYOBO 公司，貨號(hào)NPK-201、FSQ-301、QPK-201）； RIPA 裂解液、蛋白蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、30% 丙烯酰胺溶液、Tris-HCl 溶液 （pH 6.8）、Tris-HCl 溶液（pH 8.8）、BSA、一抗稀釋液、10%SDS、過(guò)硫酸銨（APS）、5×蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)P0013B、P1045、P0010、ST003、ST768、ST789、ST023、P0256、ST628、ST005、P0015）； 預(yù)染蛋白Marker（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，貨號(hào)26616）；GAPDH 抗體（美國(guó)Proteintech 公司，貨號(hào)60004-1-Ig）； α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 （alpha smooth muscle actin，α-SMA）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1 （silent information regulator 1，SIRT1） 抗體（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào) Ab124964、Ab110304）； I 型膠原（collagen type I alpha 1，Col1a1） 抗體（武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，貨號(hào)A1352）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 儀器 Synchron DXC800 型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）； JXFSTPRP-24 型全自動(dòng)快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；F200 PRO 型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）； Vii7 型PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）； 041BR127719 型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀、Thermal Cyxler 型cDNA 逆轉(zhuǎn)錄儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）； Odyssey CLX 型雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR 公司）； ASP300 型封閉式組織脫水機(jī)、EG1160 型組織包埋機(jī)、RM2035 型石蠟切片機(jī)、HI1220 型組織病理學(xué)用烘片儀、SCN400 型數(shù)據(jù)切片掃描機(jī)（德國(guó)Leica 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 8 周齡雄性C57BL/6 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、黃芪總苷112 mg/kg 組、黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸（10 mg/kg） 組，每組8 只。對(duì)照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余組給予0.1% DDC 喂養(yǎng)8 周，第5周起各組按相應(yīng)給藥劑量每天灌胃給藥1 次，連續(xù)4周，對(duì)照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。

8 周齡雄性Mdr2-/-小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成模型組、黃芪總苷56 mg/kg 組、黃芪總苷28 mg/kg組和奧貝膽酸（10 mg/kg） 組，以同窩雄性野生型為對(duì)照組，每組8 只。各組按相應(yīng)給藥劑量每天灌胃給藥1 次，連續(xù)3 周，對(duì)照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。

取材前12 h 小鼠禁食不禁水，取材當(dāng)日以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采集血液，靜置3 h，3 000 r/min 離心15 min （離心半徑10 cm） 獲取血清，并收集肝組織樣本用于后續(xù)檢測(cè)。

2.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 血清生化指標(biāo)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科協(xié)助檢測(cè)，檢測(cè)ALT、AST、ALP 活性及TBA、TBIL、DBIL、IBIL水平。

2.3 肝組織病理學(xué)染色及觀察 取材當(dāng)日留取肝臟大葉同一部位，于10%中性甲醛緩沖液中固定，封閉式組織脫水機(jī)自動(dòng)脫水，組織包埋機(jī)石蠟包埋，切片，分別行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE） 染色和天狼猩紅（sirus red，SR） 染色，封片后用數(shù)字切片掃描機(jī)自動(dòng)掃描，觀察肝細(xì)胞損傷、纖維化程度等。

2.4 免疫組化染色觀察肝組織α-SMA 和Col1a1表達(dá) 肝組織石蠟切片充分脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，滴加3%過(guò)氧化氫溶液室溫避光孵育15 min 以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加10% 山羊血清封閉30 min 以清除非特異性背景染色，滴加一抗（α-SMA、Col1a1，稀釋比例1 ∶1 000、1 ∶200） 4 ℃過(guò)夜，次日PBS 洗滌3 次，滴加二抗37 ℃孵育30 min，辣根過(guò)氧化物酶顯色，蘇木素染核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片，數(shù)字切片掃描機(jī)自動(dòng)掃描，觀察肝組織α-SMA 和Col1a1表達(dá)。

2.5 RT-qPCR 法檢測(cè)肝組織α-SMA、Col1a1、Col4a1、TGF-β1 mRNA 表達(dá) 稱(chēng)取約30 mg 肝組織，提取總RNA 后測(cè)定其濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為5 μL SYBR PCR Master Mix、3.6 μL DEPC、0.2 μL 正向引物、0.2 μL 反向引物； 反應(yīng)條件為50 ℃2 min，95 ℃1 min、95 ℃變性15 s、60 ℃延伸退火1 min，擴(kuò)增45 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

2.6 Western blot 法檢測(cè)肝組織α-SMA、SIRT1 蛋白表達(dá) 稱(chēng)取約30 mg 肝組織，加入600 μL 含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，勻漿后離心取上清液，即得總蛋白，根據(jù)BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定總蛋白濃度，制備上樣緩沖液。蛋白樣本經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至膜，5% BSA 封閉后孵育一抗α-SMA （1 ∶1 000）、SIRT1 （1 ∶ 1 000）、GAPDH （1 ∶5 000），洗膜后孵育二抗，ECL 法顯影，使用Odyssey 紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜，獲取蛋白條帶圖片，通過(guò)Image J 軟件分析條帶的灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著差數(shù)法LSD-t檢驗(yàn)； 若數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布或方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪總苷對(duì)膽汁淤積性肝纖維化小鼠肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響 與同期對(duì)照組比較，DDC 模型組小鼠肝質(zhì)量與肝臟系數(shù)均升高（P＜0.01）； 與DDC 模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 和奧貝膽酸組小鼠肝質(zhì)量與肝臟系數(shù)均降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 黃芪總苷對(duì)DDC 模型小鼠肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響（±s，n＝8）Tab.2 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in DDC-treated mouse models （±s，n＝8）

表2 黃芪總苷對(duì)DDC 模型小鼠肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響（±s，n＝8）Tab.2 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in DDC-treated mouse models （±s，n＝8）

注： 與同期對(duì)照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別劑量/（mg·kg-1）肝質(zhì)量/g肝臟系數(shù)/%對(duì)照組—1.10±0.044.38±0.28模型組—3.08±0.23** 12.90±0.62**黃芪總苷組1122.90±0.1612.07±0.29 562.72±0.54＃11.52±1.28＃奧貝膽酸組102.75±0.19＃11.77±0.45＃

與同期對(duì)照組比較，Mdr2-/-模型組小鼠肝質(zhì)量與肝臟系數(shù)均升高（P＜0.01）； 與Mdr2-/-模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 組小鼠肝質(zhì)量與肝臟系數(shù)均降低（P＜0.01），黃芪總苷28 mg/kg 組小鼠肝質(zhì)量降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 黃芪總苷對(duì)Mdr2-/-模型小鼠肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響（±s，n＝8）Tab.3 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in Mdr2-/- mouse models （±s，n＝8）

表3 黃芪總苷對(duì)Mdr2-/-模型小鼠肝質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響（±s，n＝8）Tab.3 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in Mdr2-/- mouse models （±s，n＝8）

注： 與同期對(duì)照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg-1）肝質(zhì)量/g肝臟系數(shù)/%對(duì)照組—1.01±0.084.19±0.24模型組—1.61±0.07**6.46±0.35**黃芪總苷組561.44±0.06＃＃5.69±0.31＃＃281.52±0.06＃6.13±0.25奧貝膽酸組101.65±0.076.46±0.30

3.2 黃芪總苷對(duì)膽汁淤積性肝纖維化小鼠血清肝功能的影響 與同期對(duì)照組比較，DDC 模型組小鼠血清 ALT、AST、ALP 活性和 TBA、TBIL、DBIL、IBIL 水平均升高（P＜0.01）； 與DDC 模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸組小鼠血清ALT、AST、ALP 活性和TBA、TBIL、DBIL、IBIL 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），黃芪總苷112 mg/kg 組小鼠血清ALP 活性和TBA、TBIL、DBIL、IBIL 水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表4～5。

表4 黃芪總苷對(duì)DDC 模型小鼠血清ALT、AST、ALP 活性的影響（U/L，±s，n＝8）Tab.4 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in DDC-treated mouse models （U/L，±s，n＝8）

表4 黃芪總苷對(duì)DDC 模型小鼠血清ALT、AST、ALP 活性的影響（U/L，±s，n＝8）Tab.4 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in DDC-treated mouse models （U/L，±s，n＝8）

注： 與同期對(duì)照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg-1）ALTASTALP對(duì)照組—31.57±6.50136.57±24.4935.43±6.37模型組—966.33±89.48**541.83±50.21**246.17±65.99**黃芪總苷組112870.00±104.21484.67±68.47178.00±19.05＃56807.67±74.30＃＃440.17±78.92＃162.17±9.20＃奧貝膽酸組10685.67±76.97＃＃371.83±40.08＃＃153.00±18.12＃＃

表5 黃芪總苷對(duì)DDC 模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影響（μmol/L，±s，n＝8）Tab.5 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in DDC-treated mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

表5 黃芪總苷對(duì)DDC 模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影響（μmol/L，±s，n＝8）Tab.5 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in DDC-treated mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

注： 與同期對(duì)照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg-1）TBATBILDBILIBIL對(duì)照組—1.08±0.151.05±0.170.23±0.050.83±0.21模型組—119.58±51.19**50.03±37.05**32.77±24.71**17.30±12.37**黃芪總苷組11218.28±3.92＃＃3.26±3.43＃＃1.29±1.80＃＃1.71±1.49＃＃5616.18±2.71＃＃1.98±0.74＃＃0.85±0.35＃＃1.13±0.42＃＃奧貝膽酸組1012.82±9.21＃＃1.84±0.73＃＃0.81±0.84＃＃1.15±0.33＃＃

與同期對(duì)照組比較，Mdr2-/-模型組小鼠血清ALT、AST、ALP 活性和TBA、TBIL、DBIL 和IBIL水平均升高（P＜0.01）； 與Mdr2-/-模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 組小鼠血清ALT、AST、ALP活性和IBIL 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），黃芪總苷28 mg/kg 組小鼠血清ALP 活性降低 （P＜0.05），奧貝膽酸組小鼠血清ALP 活性和TBA 水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表6～7。

表6 黃芪總苷對(duì)Mdr2-/-模型小鼠血清ALT、AST 和ALP 活性的影響（U/L，±s，n＝8）Tab.6 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in Mdr2-/- mouse models （U/L，±s，n＝8）

表6 黃芪總苷對(duì)Mdr2-/-模型小鼠血清ALT、AST 和ALP 活性的影響（U/L，±s，n＝8）Tab.6 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in Mdr2-/- mouse models （U/L，±s，n＝8）

注： 與同期對(duì)照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg-1）ALTASTALP對(duì)照組—40.71±10.37127.86±21.21104.57±11.01模型組—279.17±125.75**429.00±242.21**171.00±21.14**黃芪總苷組56165.43±58.06＃217.57±83.37＃126.86±16.48＃＃28193.14±30.81271.00±24.72141.00±18.08＃奧貝膽酸組10212.33±94.93293.50±62.44139.67±43.33＃

表7 黃芪總苷對(duì)Mdr2-/-模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影響（μmol/L，±s，n＝8）Tab.7 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in Mdr2-/- mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

表7 黃芪總苷對(duì)Mdr2-/-模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影響（μmol/L，±s，n＝8）Tab.7 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in Mdr2-/- mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

注： 與同期對(duì)照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別劑量/（mg·kg-1）TBATBILDBILIBIL對(duì)照組—0.87±0.422.30±0.180.29±0.072.01±0.13模型組—19.37±13.27**4.50±1.63**1.05±0.81**3.47±0.82**黃芪總苷組569.85±4.043.40±0.770.79±0.272.51±0.62＃2813.08±3.273.93±0.510.96±0.353.09±0.36奧貝膽酸組105.11±2.45＃3.44±1.140.72±0.272.66±0.81

3.3 黃芪總苷對(duì)膽汁淤積性肝纖維化小鼠肝組織病理學(xué)變化及膠原沉積的影響 肝組織HE 染色可見(jiàn)同期對(duì)照組小鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)及中央靜脈無(wú)擴(kuò)大，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)； DDC 模型組可見(jiàn)肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，含有廣泛的卟啉沉積物，大量膽管上皮細(xì)胞異常增生，節(jié)段性膽管堵塞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)； 黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組病理變化均有不同程度減輕，肝臟損傷明顯改善。SR染色結(jié)果顯示，與同期對(duì)照組比較，DDC 模型組可見(jiàn)匯管區(qū)膠原纖維大量沉積，纖維間隔明顯，陽(yáng)性著色較深，肝組織膠原陽(yáng)性面積和HYP 水平均增加（P＜0.01）； 與DDC 模型組比較，黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組陽(yáng)性染色均有不同程度減少，膠原纖維變細(xì)，肝組織膠原陽(yáng)性面積和HYP水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪總苷對(duì)DDC 模型小鼠肝組織病理學(xué)變化及膠原沉積的影響（±s，n＝8）Fig.1 Effects of astragalosides on hepatic pathological changes and collagen deposition in DDC-treated mouse models （±s，n＝8）

肝組織HE 染色可見(jiàn)同期對(duì)照組小鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)及中央靜脈無(wú)擴(kuò)大，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)； Mdr2-/-模型組肝組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膽管上皮細(xì)胞異常增生，膽管周?chē)世w維化改變； 黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組病理變化均有不同程度減輕，肝臟損傷明顯改善。SR 染色結(jié)果顯示，與同期對(duì)照組比較，Mdr2-/-模型組可見(jiàn)匯管區(qū)膠原纖維大量沉積，纖維間隔明顯，形成假小葉，肝組織膠原陽(yáng)性面積和HYP 水平均增加（P＜0.01）； 與Mdr2-/-模型組比較，黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組陽(yáng)性染色均有不同程度減少，膠原纖維變細(xì)，黃芪總苷56 mg/kg 組膠原陽(yáng)性面積和肝組織HYP 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），奧貝膽酸組肝組織HYP 水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

3.4 黃芪總苷對(duì)膽汁淤積性肝纖維化小鼠肝組織纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示，與同期對(duì)照組比較，DDC 模型組小鼠肝組織α-SMA 和Col1a1 免疫組化陽(yáng)性表達(dá)減少，α-SMA 蛋白及mRNA 表達(dá)、Col1a1 和Col4a1 mRNA 表達(dá)均升高（P＜0.01）； 與DDC 模型組比較，黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組小鼠肝組織α-SMA 和Col1a1 免疫組化陽(yáng)性表達(dá)增加，α-SMA、Col1a1 和Col4a1 mRNA 表達(dá)均降低（P＜0.01），黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸組小鼠肝組織α-SMA 蛋白降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 黃芪總苷對(duì)DDC 模型小鼠肝組織纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響（×200，±s，n＝8）Fig.3 Effects of astragalosides on hepatic fibrosis related indicators in DDC-treated mouse models （×200，±s，n＝8）

免疫組化染色結(jié)果顯示，與同期對(duì)照組比較，Mdr2-/-模型組小鼠肝組織α-SMA 和Col1a1 免疫組化陽(yáng)性表達(dá)、α-SMA 蛋白及mRNA 表達(dá)、Col1a1和Col4a1 mRNA 表達(dá)均升高 （P＜0.01）； 與Mdr2-/-模型組比較，黃芪總苷各劑量組和奧貝膽酸組小鼠肝組織α-SMA 和Col1a1 免疫組化陽(yáng)性表達(dá)均減少，α-SMA、Col4a1 mRNA 表達(dá)均降低（P＜0.05，P＜0.01），黃芪總苷56 mg/kg 組小鼠肝組織Col1a1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸組小鼠肝組織α-SMA 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 黃芪總苷對(duì)Mdr2-/-模型小鼠肝組織纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響（×200，±s，n＝8）Fig.4 Effects of astragalosides on hepatic fibrosis related indicators in Mdr2-/- mouse models （×200，±s，n＝8）

3.5 黃芪總苷對(duì)膽汁淤積性肝纖維化小鼠肝組織SIRT1 蛋白和TGF-β1 mRNA 表達(dá)的影響 與同期對(duì)照組比較，DDC 模型組小鼠肝組織SIRT1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），TGF-β1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）； 與DDC 模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸組小鼠肝組織SIRT1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），TGF-β1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），黃芪總苷112 mg/kg 組小鼠肝組織TGF-β1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 黃芪總苷對(duì)DDC 模型小鼠肝組織SIRT1 蛋白和TGF-β1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝8）Fig.5 Effects of astragalosides on hepatic expressions of SIRT1 protein and TGF-β1 mRNA in DDCtreated mouse models （±s，n＝8）

與同期對(duì)照組比較，Mdr2-/-模型組小鼠肝組織SIRT1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），TGF-β1 mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）； 與Mdr2-/-模型組比較，黃芪總苷56 mg/kg 組和奧貝膽酸組小鼠肝組織SIRT1 蛋白表達(dá)升高 （P＜0.01），TGF-β1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.01），黃芪總苷28 mg/kg 組小鼠肝組織TGF-β1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 黃芪總苷對(duì)Mdr2-/-模型小鼠肝組織SIRT1 蛋白和TGF-β1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝8）Fig.6 Effects of astragalosides on hepatic expressions of SIRT1 protein and TGF-β1 mRNA in Mdr2-/-mouse models （±s，n＝8）

4 討論

黃芪總苷是中藥黃芪的重要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)及多器官保護(hù)等多種藥理作用［11］。課題組前期研究表明，黃芪總苷可減輕膽管結(jié)扎、二甲基亞硝胺或四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化，其作用機(jī)制與TGF-β1 和Notch信號(hào)通路有關(guān)［6-7，12］，其中160 mg/kg 黃芪總苷具有顯著療效?；诖耍ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間的藥物等效劑量換算得到本研究DDC 模型小鼠給藥劑量為112 mg/kg，并設(shè)置56 mg/kg 的劑量以探索量效關(guān)系，結(jié)果提示56 mg/kg 黃芪總苷對(duì)DDC 模型小鼠的療效更佳。為了進(jìn)一步證明56 mg/kg 黃芪總苷是否是抗膽汁淤積性肝纖維化的最佳劑量，在Mdr2-/-模型中設(shè)置了56、28 mg/kg 2 個(gè)劑量，結(jié)果顯示在Mdr2-/-模型小鼠中56 mg/kg 黃芪總苷同樣具有更顯著的藥效。以上結(jié)果提示56 mg/kg 黃芪總苷具有顯著的抗小鼠膽汁淤積性肝纖維化作用。

SIRT1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)的組蛋白去乙?；?，具有高度保守性，參與調(diào)節(jié)廣泛的生物學(xué)功能如轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、DNA 損傷修復(fù)、代謝、細(xì)胞凋亡和自噬［13］。近年來(lái)，SIRT1 在膽汁淤積性肝纖維化中的作用受到重視，認(rèn)為其在HSC 活化和肝纖維化的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［14］。在肝纖維化動(dòng)物模型、患者肝臟和活化的HSC 中均可觀察到SIRT1 表達(dá)的下調(diào)，而激活SIRT1 可阻斷HSC 活化，抑制肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化［15］。SIRT1 可與TGF-β/Smad 信號(hào)通路上的Smad3 結(jié)合，使其去乙?；⒁种芓GF-β1 的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抗纖維化作用［16］。體外研究也證實(shí)，用TGF-β1 刺激人肝星狀細(xì)胞系LX-2 細(xì)胞可導(dǎo)致SIRT1 蛋白表達(dá)下調(diào)，其過(guò)表達(dá)可降低α-SMA 和Col1a1 的表達(dá)，促進(jìn)活化的LX-2 凋亡和向靜息態(tài)逆轉(zhuǎn)［17］。本研究結(jié)果顯示，與同期對(duì)照組比較，DDC 和Mdr2-/-模型小鼠肝組織中SIRT1 表達(dá)均被抑制，而黃芪總苷可改善這一異常表達(dá)，提示黃芪總苷可能通過(guò)上調(diào)SIRT1 表達(dá)發(fā)揮抗膽汁淤積性肝纖維化的作用。

小鼠喂養(yǎng)肝毒性化合物DDC 會(huì)導(dǎo)致膽管內(nèi)卟啉栓塞、膽道梗阻，從而造成慢性膽汁淤積，誘發(fā)肝纖維化［18-19］。Mdr2-/-小鼠由于體內(nèi)膽小管磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)體被靶向破壞，膽磷脂分泌障礙，膽汁中非膠束結(jié)合的游離膽汁酸濃度增加，高濃度膽汁酸滲漏到門(mén)脈中，誘發(fā)炎癥和膽管增生，最終導(dǎo)致膽管周?chē)w維沉積［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪總苷可改善這2種膽汁淤積性肝纖維化模型小鼠肝組織病理變化，減少肝組織膠原陽(yáng)性面積和HYP 水平，抑制肝組織α-SMA、Col1a1、Col4a1 和TGF-β1 的表達(dá)，以56 mg/kg 劑量效果更佳。

綜上所述，黃芪總苷可發(fā)揮抗膽汁淤積性肝纖維化的作用，其初步作用機(jī)制與促進(jìn)SIRT1 表達(dá)，抑制下游TGF-β1 表達(dá)相關(guān)。