清肺抑火片質(zhì)量評(píng)價(jià)

張 純，陳葉青，金佩芬，俞 秀，金小燕，李建國(guó)，宋喆旎

（嘉興市食品藥品與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，浙江 嘉興 314001）

清肺抑火片是以黃芩、大黃、梔子、桔梗、苦參、天花粉、知母、黃柏、前胡9 味中藥為原料加工制成的中藥復(fù)方制劑，具有清肺止嗽、降火生津等功效［1］，臨床上用于治療肺熱咳嗽、痰延壅盛等癥狀，可有效緩解急性支氣管炎患者臨床癥狀，改善其肺功能［2-4］，并且對(duì)緩解與空氣污染相關(guān)的呼吸道損傷也有一定作用［5-7］。目前，清肺抑火片執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為1990 年版《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》 中藥成方制劑第二冊(cè)（WS3-B-0418-90），檢測(cè)項(xiàng)目?jī)H包含性狀、片劑通則，缺乏更有針對(duì)性的內(nèi)容，無(wú)法全面反映藥物整體質(zhì)量，導(dǎo)致市場(chǎng)上其質(zhì)量參差不齊。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)際檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題結(jié)合現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)清肺抑火片質(zhì)量情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期建立更完善的手段來(lái)進(jìn)一步提升該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并為其市場(chǎng)監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695-2998 高效液相色譜儀，配置DAD 檢測(cè)器（美國(guó)Waters 公司）； XS205DU型電子天平 （瑞士Mettler-Toledo 公司）； Mili-Q Reference 超純水儀（德國(guó)Merck Millipore 公司）；KQ-800KDE 高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 暗箱式紫外透射儀（上海寶山顧村電光儀器廠）； 薄層色譜板（德國(guó)Merck 公司）。

1.2 藥物 清肺抑火片共39 批，源自浙江省11個(gè)地市抽檢樣品，編號(hào)S1 ～S39，其中S1 ～S16 生產(chǎn)廠家為修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司（A 廠，批號(hào) 190312、180606、170410、190102、190407、190304、190405、171017、190203、190115、171219、171214、190107、190103、190501、190210），S17～S21 生產(chǎn)廠家為云南白藥集團(tuán)大理藥業(yè)有限責(zé)任公司（B 廠，批號(hào) DBA1901、DFA1805、DDA1905、DBA1902、DJA1805），S22 ～S23 生產(chǎn)廠家為大理白族自治州中藥制藥有限公司（C 廠，批號(hào)180634、180637），S24 ～S25 生產(chǎn)廠家為云南龍發(fā)制藥股份有限公司 （D 廠，批號(hào)181201、180908、170636、190136、180853 ），S26～S28 生產(chǎn)廠家為云南騰藥制藥股份有限公司（E 廠，批號(hào)170636、190136、180853），S29 ～S39生產(chǎn)廠家為云南省曲靖藥業(yè)有限公司（F 廠，批號(hào)181112、190101、180805、181206、181201、180810、180608、181001、180604、180606、181207）。

1.3 試劑 白花前胡乙素（批號(hào)111904-201804，純度98.9%）、白花前胡甲素 （批號(hào)111711-201904，純度99.4%）、芒果苷 （批號(hào)111607-201704，純度98.1%）、漢黃芩素（批號(hào)111514-201605，純度 90.3%）、蘆薈大黃素 （ 批號(hào)110795-201609，純度98.1%）、大黃素甲醚（批號(hào)110758-201616，純度99.0%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)110713-201814，純度86.7%）、黃芩素 （批號(hào)110595-201306，純度97.8%）、大黃酚 （批號(hào)110796-201922，純度99.4%）、大黃素 （批號(hào)110756-201512，純度98.7%）、梔子苷 （批號(hào)110749-201919，純度97.1%）、漢黃芩苷 （批號(hào)112002-201501，純度98.8%）、黃芩苷 （批號(hào)110715-201821，純度95.4%）、土大黃苷 （批號(hào)110794-201909） 對(duì)照品及黃芩 （批號(hào)120955-201810）、梔子（批號(hào)120986-201610）、大黃（批號(hào)120984-201202）、黃柏（批號(hào)121510-201707）、關(guān)黃柏（批號(hào)120937-201408） 對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院； 新芒果苷 （批號(hào)ST00360120-3671，純度98.0%）、千層紙素A （批號(hào)ST23660120-6907，純度98.0%） 對(duì)照品均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。乙腈為色譜純（德國(guó)默克公司）； 其他試劑均為分析純； 水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目檢驗(yàn) 按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，包括性狀、重量差異、崩解時(shí)限、微生物限度，發(fā)現(xiàn)所有批次樣品均符合規(guī)定，表觀質(zhì)量良好。但缺少藥味組成、主要成分含量測(cè)定等重要檢測(cè)項(xiàng)目，未能全面反映清肺抑火片真實(shí)質(zhì)量，無(wú)法完全起到質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)作用。

2.2 TLC 定性鑒別 根據(jù)本品組方和工藝，對(duì)黃芩、梔子、黃柏、大黃等主要藥材進(jìn)行TLC 鑒別［8-9］，以評(píng)估該制劑投料的真實(shí)性。方中黃芩為君藥，用量最大，也是最主要原料； 梔子、黃柏為臣藥，是藥效主要貢獻(xiàn)者，針對(duì)可能存在的關(guān)黃柏代替黃柏投料問(wèn)題，有必要進(jìn)行相關(guān)檢查［10］； 大黃為佐藥，因常有偽品土大黃混入，而且2020 年版《中國(guó)藥典》［11］規(guī)定大黃及其制劑不得檢出土大黃特有成分土大黃苷，故也需加以考察。

2.2.1 黃芩 取本品粉末1 g，加30 mL 甲醇超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液； 取不含黃芩的陰性樣品粉末1 g，同法制備陰性樣品溶液； 取黃芩對(duì)照藥材0.5 g，同法制備對(duì)照藥材溶液，分別吸取5 μL，以乙酸乙酯-丁酮-醋酸-水（5 ∶10 ∶5 ∶3） 為展開劑，展開，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果見圖1。

圖1 黃芩TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatograms of Scutellariae Radix

2.2.2 梔子 取本品、不含梔子的陰性樣品粉末適量，按“2.2.1” 項(xiàng)下方法分別制備供試品、陰性樣品溶液； 取梔子對(duì)照藥材0.5 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照藥材溶液； 取梔子苷對(duì)照品適量，甲醇制成1 mg/mL 對(duì)照品溶液，分別吸取5 μL，以三氯甲烷-甲醇 （3 ∶1） 為展開劑，展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果見圖2。

圖2 梔子TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatograms of Gardeniae Fructus

2.2.3 黃柏 取本品粉末1 g，加10 mL 甲醇加熱回流提取15 min，濾過(guò)，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液； 取不含黃柏的陰性樣品粉末1 g，同法制備陰性樣品溶液； 取黃柏、關(guān)黃柏對(duì)照藥材各0.1 g，同法制備對(duì)照藥材溶液； 取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量，甲醇制成0.5 mg/mL 對(duì)照品溶液，分別吸取5 μL，以正丁醇-冰醋酸-水（7 ∶1 ∶2） 為展開劑，展開，晾干，在紫外燈（365 nm） 下檢視，結(jié)果見圖3。

圖3 黃柏TLC 色譜圖Fig.3 TLC chromatograms of Phellodendri chinensis Cortex

2.2.4 大黃 取本品粉末0.6 g，加5 mL 甲醇超聲處理10 min，濾過(guò)，作為供試品溶液； 取不含大黃的陰性樣品粉末0.6 g，同法制備陰性樣品溶液；取大黃對(duì)照藥材0.5 g，同法制備對(duì)照藥材溶液，分別吸取5 μL，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（12 ∶5 ∶0.1） 為展開劑，展開，晾干，在紫外燈（365 nm） 下檢視，結(jié)果見圖4。

圖4 大黃TLC 色譜圖Fig.4 TLC chromatograms of Rhei Radix et Rhizoma

2.2.5 土大黃苷 取土大黃苷對(duì)照品適量，甲醇制成20 μg/mL 對(duì)照品溶液，吸取它及“2.2.4”項(xiàng)下供試品、陰性樣品、對(duì)照藥材溶液各5 μL，以三氯甲烷-甲醇-甲酸-水（10 ∶3 ∶0.2 ∶0.3） 為展開劑，展開，晾干，在紫外燈（365 nm） 下檢視，結(jié)果見圖5。

圖5 土大黃苷TLC 色譜圖Fig.5 TLC chromatograms of rhaponticin

2.3 HPLC 含量測(cè)定

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取新芒果苷、芒果苷、蘆薈大黃素、漢黃芩素、千層紙素A、白花前胡甲素、白花前胡乙素對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為301.64、303.52、298.42、273.20、297.33、298.89、104.04 μg/mL 的對(duì)照品溶液1；精密稱取鹽酸小檗堿、黃芩素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為511.18、498.78、199.97、506.14、149.85 μg/mL的對(duì)照品溶液2； 精密稱取梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別803.02、2 501.39、802.65 μg/mL 的對(duì)照品溶液3。

2.3.1.2 供試品溶液 取本品10 片，研細(xì)，精密稱取粉末0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲 （350 W、40 kHz） 處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.3.1.3 陰性樣品溶液 取缺黃芩、缺大黃、缺梔子、缺知母、缺黃柏、缺前胡的陰性樣品各10片，按“2.3.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份溶液，即得。

2.3.2 色譜條件 Waters XBridgeTMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～60 min，10% ～70%A； 60～65 min，70%A）； 體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)254、322 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.3.3 系統(tǒng)適用性考察 分別精密量取“2.3.1”項(xiàng)下3 種對(duì)照品溶液0.5、1、2.5 mL，置于同一25 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成新芒果苷、芒果苷、梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、千層紙素A、大黃素、白花前胡甲素、大黃酚、大黃素甲醚、白花前胡乙素質(zhì)量濃度分別為6.04、6.07、80.30、250.14、20.45、80.27、19.95、5.97、5.46、5.95、8.00、5.98、20.25、5.99、2.08 μg/mL 的對(duì)照品溶液4，精密吸取它及供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖6。由此可知，供試品、對(duì)照品溶液對(duì)應(yīng)色譜峰的理論塔板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，陰性無(wú)干擾。

圖6 各成分HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1” 項(xiàng)下3種對(duì)照品溶液適量，甲醇制成系列質(zhì)量濃度，在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，并以信噪比 （S/N） ＝3 為檢測(cè)限，S/N＝10 為定量限，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.5 方法學(xué)考察

2.3.5.1 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1.2” 項(xiàng)下供試品溶液適量，在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得新芒果苷、芒果苷、梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、千層紙素A、大黃素、白花前胡甲素、大黃酚、大黃素甲醚、白花前胡乙素峰面積RSD 分別為 0.75%、1.26%、0.88%、0.82%、1.04%、0.80%、1.75%、2.18%、0.99%、2.20%、1.04%、0.64%、0.90%、0.94%、1.25%，表明儀器精密度良好。

2.3.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品適量，按“2.3.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新芒果苷、芒果苷、梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、千層紙素A、大黃素、白花前胡甲素、大黃酚、大黃素甲醚、白花前胡乙素含量RSD 分別為1.87%、1.60%、1.81%、2.69%、2.23%、2.09%、2.37%、2.30%、2.32%、2.38%、1.91%、2.66%、1.69%、2.40%、1.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.1.2” 項(xiàng)下供試品溶液適量，于 0、2、6、12、24、36 h 在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新芒果苷、芒果苷、梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、千層紙素A、大黃素、白花前胡甲素、大黃酚、大黃素甲醚、白花前胡乙素峰面積RSD 分別為0.52%、1.54%、2.96%、1.74%、1.45%、2.50%、1.73%、2.61%、2.69%、1.42%、1.83%、2.37%、0.59%、1.81%、1.87%，表明溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品6 片，每份0.1 g，加入對(duì)照品溶液（新芒果苷、芒果苷、梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、千層紙素A、大黃素、白花前胡甲素、大黃酚、大黃素甲醚、白花前胡乙素質(zhì)量濃度分別為6.01、17.65、119.28、406.27、77.49、100.20、138.52、4.22、38.26、15.04、8.92、12.19、23.22、4.25、4.42 μg/mL） 5 mL，按“2.3.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，新芒果苷、芒果苷、梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、千層紙素A、大黃素、白花前胡甲素、大黃酚、大黃素甲醚、白花前胡乙素平均加樣回收率分別為98.48%、101.09%、100.96%、102.34%、99.21%、98.08%、102.97%、101.17%、101.41%、102.40%、98.46%、100.20%、101.85%、98.53%、99.82%，RSD 分別為 0.86%、1.74%、1.58%、0.63%、1.47%、1.08%、1.17%、0.99%、1.05%、0.59%、0.60%、2.08%、1.03%、1.10%、1.94%。

2.3.6 樣品含量測(cè)定 取39 批樣品，按“2.3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of various constituents

3 討論

藥物中成分種類、含量會(huì)直接影響其有效性、安全性，故中藥成分分析是其質(zhì)量控制的重要模式和方法之一［12］。本實(shí)驗(yàn)從TLC 定性鑒別、主要成分含量測(cè)定2 個(gè)方面對(duì)清肺抑火片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)F 廠10 批樣品未顯示與黃芩對(duì)照藥材一致的主斑點(diǎn)，而C、F 廠樣品中黃柏藥味主斑點(diǎn)較淡，可能存在黃芩、黃柏質(zhì)量較差或投料不足的情況；不同廠家、批次樣品中各成分含量差異顯著，存在過(guò)低或未檢出現(xiàn)象，如F 廠11 批樣品中僅有4 批檢出黃芩苷，而且含量較低，同時(shí)均未檢出白花前胡甲素、白花前胡乙素。由此推測(cè)，清肺抑火片生產(chǎn)過(guò)程中可能存在以下主要質(zhì)量問(wèn)題： （1） 投料不足或低質(zhì)投料； （2） 藥材提取工藝不規(guī)范，藥味主要成分轉(zhuǎn)移率低； （3） 藥材投料批間質(zhì)量均一性較差。

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的15 種成分涉及清肺抑火片中知母等6 味主要藥材，其中新芒果苷、芒果苷為知母主要活性物質(zhì)［13-14］，梔子苷為梔子主要活性物質(zhì)［15］，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A 為黃芩主要活性物質(zhì)［16-17］，鹽酸小檗堿為黃柏主要活性物質(zhì)［18-19］，大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為大黃主要活性物質(zhì)［20-21］，白花前胡甲素、白花前胡乙素為前胡主要活性物質(zhì)［22］。另外，在單波長(zhǎng)下同時(shí)檢測(cè)出13種成分，而在雙波長(zhǎng)下同時(shí)檢測(cè)出15 種成分。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立清肺抑火片中黃芩、梔子、黃柏、大黃的TLC 定性鑒別方法，其簡(jiǎn)便高效，節(jié)能環(huán)保，而且分離度、重復(fù)性良好； 建立新芒果苷、芒果苷、梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、千層紙素A、大黃素、白花前胡甲素、大黃酚、大黃素甲醚、白花前胡乙素的HPLC 含量測(cè)定方法，其操作簡(jiǎn)便，高效經(jīng)濟(jì)，可從多角度實(shí)現(xiàn)對(duì)該制劑的質(zhì)量控制，為其科學(xué)監(jiān)管提供技術(shù)參考。針對(duì)發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)建議對(duì)清肺抑火片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，增加黃芩、梔子、黃柏、大黃的TLC 鑒別項(xiàng)目，以及芒果苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃酚、白花前胡甲素等主要成分的含量測(cè)定項(xiàng)目，從而確保該制劑質(zhì)量的有效性、穩(wěn)定性。