山竹皮單寧提取與純化工藝

蔣紅芝，韋林雙

（廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)食品藥品工程學(xué)院，南寧 530007）

山竹（Garcinia mangostanaL.）是藤黃科藤黃屬植物。一般在熱帶地區(qū)生長(zhǎng)，分布于泰國(guó)、馬來(lái)西亞以及中國(guó)廣東省、海南省等地。新鮮的山竹顏色為暗紅色，鮮艷有光澤。放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)后顏色會(huì)變成棕色，果皮會(huì)變硬，果肉會(huì)變黑色或黃色，口感變差。山竹皮性寒、味苦、澀，具有清熱解毒的功效，皮內(nèi)含有單寧酸，能與微生物的蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，使蛋白質(zhì)達(dá)到凝固的效果，幫助身體殺死細(xì)菌。山竹皮中的單寧具有抗氧化活性、抗菌活性、抗炎作用、增強(qiáng)免疫及抗腫瘤作用等功效，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品飲料、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域。山竹皮中的多酚提取工藝研究雖有報(bào)道［1］，但對(duì)山竹皮中單寧的提?。?］和純化研究較少。本研究對(duì)山竹皮中單寧的提取與純化工藝進(jìn)行分析，采用乙醇為提取溶劑，大孔樹(shù)脂分離純化，旨在為山竹皮單寧提取與分離純化提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器

材料：山竹購(gòu)買(mǎi)于超市，大孔樹(shù)脂為AB-8、D101（安徽三星樹(shù)脂科技有限公司），ADS-21、HPD826、NKA-9（上海一基實(shí)業(yè)有限公司）。

試劑：?jiǎn)螌幩幔兌取?8%，上海源葉生物科技有限公司）、無(wú)水乙醇，分析純。

儀器：AS 220.R2 型電子天平（蘇州培科實(shí)驗(yàn)室儀器科技有限公司）；2500Y 型高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；SB-5200D 型超聲波清洗機(jī)（功率200 W，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；TU-1901 型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；HP-B500 型電子天平（福建莆田市華杰電子儀器有限公司）；層析柱、HL-2B 型恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）；DBS-100 型電腦全自動(dòng)部分收集器（上海滬西分析儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山竹皮單寧的提取工藝流程 山竹皮→清洗→烘干（50 ℃干燥24 h）→粉碎→過(guò)篩（60 目）［3，4］→稱取一定量山竹皮粉加入一定體積的乙醇溶液→在超聲波清洗機(jī)中按一定的溫度和時(shí)間進(jìn)行振蕩→冷卻→真空泵抽濾→收集濾液→定容→取一定量濾液加純化水定容至刻度線→測(cè)定吸光度，平行提取2份。

1.2.2 單寧酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及曲線方程 單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制：準(zhǔn)確稱取單寧酸0.050 5 g，用純化水溶解并定容至100 mL，濃度為505 μg/mL［2］。

單寧光譜掃描吸收曲線繪制：吸取上述溶液2.5 mL，加純化水至100 mL，于波長(zhǎng)200～400 nm 處掃描，測(cè)定吸光度，確定最大吸收波長(zhǎng)，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 的單寧標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL 容量瓶中，加純化水至刻度，搖勻，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 紫外分光光度法對(duì)山竹皮單寧的含量測(cè)定根據(jù)下面的算式計(jì)算單寧的提取率。

式中，c為提取液稀釋液濃度（μg/mL）；n為稀釋倍數(shù)；m為山竹皮粉末質(zhì)量（g）；V為提取液的體積（mL）。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹皮單寧提取效果的影響。分別精密稱定8 份0.25 g 山竹皮粉，分別放入100 mL 具塞錐形瓶中，按料液比1∶200（g∶mL，下同）分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%的乙醇溶液50 mL，50 ℃超聲輔助提取40 min。

2）提取時(shí)間對(duì)山竹皮單寧提取效果的影響。分別精密稱定8 份0.25 g 山竹皮粉，按料液比1∶200，各加入50%乙醇溶液50 mL，溫度控制在50 ℃，超聲波輔助分別提取25、35、45、55 min。

3）提取溫度對(duì)山竹皮單寧提取效果的影響。分別精密稱定8 份0.25 g 山竹皮粉，按料液比1∶200，各加入50%乙醇溶液50 mL，分別設(shè)置水浴溫度為40、50、60、70 ℃，超聲波輔助提取45 min。

4）料液比對(duì)山竹皮單寧提取效果的影響。分別精密稱定1.00、0.50、0.33、0.25、0.20 g 山竹皮粉，分別放入100 mL 具塞錐形瓶中，各加入50%乙醇溶液50 mL，即料液比為1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250，60 ℃超聲輔助提取45 min。

1.2.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以單寧的提取率為考察指標(biāo)，確定提取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比為影響因素，每個(gè)因素取3 個(gè)水平，取各因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍［5，6］。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平設(shè)計(jì)L9（34）試驗(yàn)進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定山竹皮單寧提取的最佳工藝。

1.2.6 山竹皮單寧的純化

1）大孔樹(shù)脂預(yù)處理。稱取適量5 種大孔吸附樹(shù)脂AB-8、D101、NAK-9、ADS-21、HPD826，分別裝到燒杯內(nèi)，加入95%乙醇浸泡24 h 后，用純化水沖洗至無(wú)醇味，處理好的樹(shù)脂加純化水浸泡，備用。

2）大孔樹(shù)脂的篩選。靜態(tài)吸附：取減壓濃縮（50～60 ℃）后的山竹皮單寧濃縮液，稀釋一定倍數(shù)，測(cè)定其吸光度為0.471，計(jì)算出其質(zhì)量濃度為0.33 mg/mL。量取30 mL 山竹皮單寧濃縮液，分別加入盛有10.00 g 已處理好的5 種大孔吸附樹(shù)脂AB-8、D101、NAK-9、ADS-21、HPD826 的燒杯中進(jìn)行靜態(tài)吸附，分別在30、60 min 移取各吸附液1 mL 至50 mL 容量瓶中，用純化水定容、搖勻，測(cè)定吸光度。計(jì)算吸附量及吸附率［7］。

靜態(tài)洗脫：使用純化水洗滌大孔樹(shù)脂2 次，濾干。以乙醇作為洗脫劑，每種樹(shù)脂各稱取2.00 g，各3 份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為55%、75%、95%的乙醇溶液10 mL，洗脫30 min 取樣分析，洗脫60 min，過(guò)濾洗脫液，用純化水定容至50 mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算洗脫率。計(jì)算式如下。

式中，m為單寧量（μg），c為濃度（μg/mL）；V為體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)。

式中，m0為單寧初始總量（μg）；m1為吸附后的剩余量（μg）；m2為洗脫的單寧量（μg）；c0為原始濃度（μg/mL）；c1為吸附后剩余的單寧濃度（μg/mL）；c2為洗脫的乙醇含單寧的濃度（μg/mL）；V為提取液的體積（V0為原始的提取液體積、V1為加入吸附的提取液體積、V2為加入洗脫的乙醇體積）（mL）；n為稀釋倍數(shù)。

3）動(dòng)態(tài)吸附和洗脫。單寧樣品的動(dòng)態(tài)吸附：取適量處理好的ADS-21、HPD826大孔樹(shù)脂（各25.00 g）放入250 mL 的燒杯中，分別加入75 mL 的山竹皮濃縮液進(jìn)行超聲振蕩（常溫，30、60 min）測(cè)定吸光度。通過(guò)吸附可以觀察到白色的大孔樹(shù)脂顆粒因吸附山竹單寧而變色，并帶有山竹皮本身的粉色。

單寧樣品的洗脫：將吸附好的大孔樹(shù)脂經(jīng)處理后上柱，靜置一段時(shí)間，讓吸附有單寧的大孔樹(shù)脂充分填充。使用75%乙醇作為洗脫液，將樹(shù)脂中的單寧洗脫。用全自動(dòng)部分收集器收集16 管洗脫液（3 min/管，恒流泵流速60 mL/min），可以觀察到流出的洗脫液第2 至第6 管均帶有顏色［8］，后面流出的變淺至無(wú)色。

4）純化的單寧產(chǎn)品。對(duì)洗脫液進(jìn)行減壓濃縮得到純化的山竹皮單寧液，再經(jīng)真空干燥即得純化后的單寧產(chǎn)品。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧吸收曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

單寧酸的光譜掃描吸收曲線如圖1 所示。單寧在波長(zhǎng)275 nm 處具有最大吸收峰。山竹皮提取液光譜掃描吸收曲線如圖2 所示，在波長(zhǎng)276 nm 處具有最大吸收峰。與單寧酸對(duì)比，說(shuō)明山竹皮提取液中含有單寧酸。于固定波長(zhǎng)275 nm 處測(cè)定山竹皮提取液稀釋后的吸光度，計(jì)算山竹皮提取液中單寧的含量。在TU-1901 型雙光束紫外分光光度計(jì)定量分析界面，設(shè)置參數(shù)，輸入濃度，以純化水為參比溶液，依次測(cè)出不同濃度的吸光度［2］，儀器自動(dòng)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為c=25.889 89A+0.128 82，R＝0.999 139。

圖1 單寧酸的光譜掃描吸收曲線

圖2 山竹皮提取液光譜掃描吸收曲線

2.2 單因素試驗(yàn)對(duì)山竹皮單寧提取率的影響

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹皮單寧提取率的影響在波長(zhǎng)275 nm 處測(cè)定溶液的吸光度，以提取率代表山竹皮中單寧的含量。經(jīng)過(guò)平行試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)［9］，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹皮單寧提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%時(shí)曲線呈上升趨勢(shì)，單寧含量增加。乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%時(shí)曲線呈下降趨勢(shì)，單寧含量減少。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，山竹皮中單寧的含量最高。故最優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹皮單寧提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)山竹皮單寧提取率的影響 提取時(shí)間對(duì)山竹皮單寧提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。提取時(shí)間45 min 時(shí)，山竹皮中單寧的提取率最高，45 min后基本不變。有研究表明，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使得單寧中的酚羥基經(jīng)氧化反應(yīng)變成酮基，從而使得提取量下降［10］。加熱時(shí)間為45 min 時(shí)提取山竹皮中單寧的含量最高，故提取時(shí)間選擇45 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)山竹皮單寧提取率的影響

2.2.3 提取溫度對(duì)山竹皮單寧提取率的影響 提取溫度對(duì)山竹皮單寧提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。提取溫度在40、50、60 ℃時(shí)，隨著溫度的提高，山竹皮中單寧的提取率呈上升趨勢(shì)，60 ℃后呈下降趨勢(shì)。故提取溫度為60 ℃時(shí)效果較好。

圖5 提取溫度對(duì)山竹皮單寧提取率的影響

2.2.4 料液比對(duì)山竹皮單寧提取率的影響 料液比對(duì)山竹皮單寧提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。料液比為1∶50、1∶100 時(shí)曲線下降，單寧提取率下降。料液比為1∶100 后曲線上升，單寧提取率增加，但料液比越大成本越高，故選擇了料液比為1∶200。

圖6 料液比對(duì)山竹皮單寧提取率的影響

2.3 山竹皮單寧提取的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以單寧的提取率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）試驗(yàn)［11-13］。正交設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1，通過(guò)比較極差可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山竹皮中單寧的提取率影響最大，其次為提取溫度及料液比，提取時(shí)間對(duì)山竹皮中單寧的提取率影響最小。從正交試驗(yàn)中可得A2B3C3D3均值最高，并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其提取率為10.78%。故提取山竹皮中單寧含量的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶225，提取溫度65 ℃，提取時(shí)間50 min。

表1 正交結(jié)果及分析

2.4 大孔吸附樹(shù)脂純化結(jié)果

2.4.1 靜態(tài)吸附、動(dòng)態(tài)吸附結(jié)果 選取5 種不同的大孔樹(shù)脂分別對(duì)山竹皮中的單寧進(jìn)行靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，靜態(tài)吸附比動(dòng)態(tài)吸附效果要好，吸附60 min 后基本達(dá)到平衡。綜合靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附的效果，NAK-9、ADS-21、HPD826 大孔樹(shù)脂吸附較好。

2.4.2 靜態(tài)洗脫結(jié)果 靜態(tài)洗脫結(jié)果見(jiàn)表3。用75%乙醇洗脫時(shí)，洗脫率最高，20 min 時(shí)間較短洗脫率不高，40 min 時(shí)洗脫率較高，60 min 后洗脫率下降。75%乙醇洗脫率比55%、95%的乙醇洗脫率要高。即75%乙醇洗脫率的數(shù)值較大，洗脫出來(lái)的單寧較多，所以選擇75%乙醇作為柱層析洗脫液進(jìn)行洗脫。

表3 乙醇洗脫率結(jié)果

55%、95%乙醇洗脫時(shí)，NAK-9 大孔樹(shù)脂洗脫效果較差，HPD826、AB-8、D101 洗脫效果較好，但洗脫率均不高。75%乙醇洗脫時(shí)，40 min 時(shí)AB-8 樹(shù)脂洗脫率最高，60 min 后洗脫率最低，分析原因有可能是出現(xiàn)重新吸附造成的，ADS-21、NAK-9、HPD826洗脫效果較好，D101 穩(wěn)定性較差。總體來(lái)看，ADS-21、HPD826 大孔樹(shù)脂洗脫效果較好。

由以上分析可知，ADS-21、HPD826、NAK-9 大孔樹(shù)脂吸附較好，但ADS-21、HPD826 大孔樹(shù)脂洗脫效果較好，綜合考慮吸附率和洗脫率2 個(gè)因素，得出ADS-21、HPD826為該試驗(yàn)適宜的純化大孔樹(shù)脂。

2.4.3 動(dòng)態(tài)洗脫（柱層析）結(jié)果 動(dòng)態(tài)洗脫（柱層析）結(jié)果如圖7 所示，山竹皮單寧經(jīng)ADS-21、HPD826 大孔樹(shù)脂吸附柱層析分離后，均出現(xiàn)1 個(gè)洗脫峰。與HPD826 大孔樹(shù)脂相比，ADS-21 大孔樹(shù)脂吸附柱層析的洗脫峰較窄，洗脫出來(lái)的單寧比較集中，即分離洗脫的效果較好［4］，所以選擇ADS-21 大孔樹(shù)脂對(duì)山竹皮單寧進(jìn)行洗脫。

圖7 ADS-21、HPD826 柱層析結(jié)果對(duì)比

3 小結(jié)

1）以山竹皮為原料通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)確定山竹皮中單寧最優(yōu)提取工藝為50%乙醇，料液比1∶225，提取溫度65 ℃，提取時(shí)間為50 min，提取率可達(dá)10.78%。

2）從5 種大孔樹(shù)脂中篩選出吸附和洗脫效果較好的ADS-21、HPD826 大孔樹(shù)脂，根據(jù)ADS-21、HPD826 大孔樹(shù)脂靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附，靜態(tài)、動(dòng)態(tài)洗脫試驗(yàn)結(jié)果，得出ADS-21 大孔樹(shù)脂為分離純化山竹皮中單寧的最佳樹(shù)脂。