雞滑液囊支原體病的診斷及防控技術(shù)研究進(jìn)展

劉廷江，張文婷，廖衛(wèi)東，郭云清，胡 巧，翟新國(guó)，羅青平，3

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；3.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是介于病毒與細(xì)菌之間的單細(xì)胞原核微生物，其外形多樣，質(zhì)地柔軟，直徑為0.2～0.4 μm［1］，能通過細(xì)胞濾器，革蘭氏染色陰性［2］，低倍鏡下觀察菌落呈“煎蛋樣”。MS 耐低溫不耐高溫，最適環(huán)境是37 ℃，pH 在7.5 左右［3］。

雞（Gallus gallusf.domestic）感染MS 后會(huì)損傷呼吸道、關(guān)節(jié)腔和生殖系統(tǒng)［4］。MS 侵入呼吸道后可引起咳嗽、流淚、氣管啰音，嚴(yán)重時(shí)有氣囊炎［5］。關(guān)節(jié)腫脹型病雞表現(xiàn)為關(guān)節(jié)和腳墊腫脹、跛行、胸部囊腫，腫脹處有乳酪色或灰白色膿性滲出物，后期形成干酪樣物［6］。雞生殖系統(tǒng)受到損傷后，會(huì)導(dǎo)致卵泡、輸卵管發(fā)育不良，產(chǎn)蛋性能低下，產(chǎn)出軟殼蛋，蛋殼尖端缺陷［7］。

滑液囊支原體的易感動(dòng)物為雞、火雞和珍珠雞，此外鴿、鴨、鵝、鵪鶉和麻雀也可感染［7］，第1 個(gè)感染高峰在7～12 周，第2 個(gè)感染高峰在產(chǎn)蛋期，感染后幾乎終生帶菌，但不一定發(fā)?。?］。該病既可通過呼吸道、消化道直接接觸水平傳播又可通過精液、輸卵管垂直傳播［9］。一年四季都可以發(fā)生，冬春季節(jié)發(fā)病概率較高［10］。此外，MS 還可以與禽流感病毒、新城疫病毒、大腸桿菌、巴氏桿菌和傳染性支氣管炎等病原體混合感染，加重病情，增加死亡率［11］。

在世界范圍內(nèi)，非洲和南美洲的MS 感染率較高，歐洲、亞洲、北美洲和大洋洲的感染率也在逐年上升，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，支原體的感染率平均為70%～80%［12］。在中國(guó)，隨著家禽養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，MS 的流行也呈上升趨勢(shì)，2014 年后擴(kuò)散至全國(guó)。MS 只有一個(gè)血清型，但基于vlhA基因5′末端的保守區(qū)域可將MS 分為17 個(gè)基因型（A-K）［10］。2016—2019 年，謝迪［13］對(duì)中國(guó)8 個(gè)省份進(jìn)行了MS 的分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在中國(guó)的MS流行基因型是K型。隨朝鴿［14］于2017—2019 年在華中地區(qū)的MS 分型鑒定中確定了新的L 基因型。王晨燕等［15］于2018—2020 年在福建省對(duì)非免疫雞群針對(duì)MS 進(jìn)行了檢測(cè)，雞群病原總陽性率為49.62%，且陽性率隨著雞群日齡增加而升高。傳播途徑多樣化和傳播范圍廣泛給滑液囊支原體病的防治帶來了較大挑戰(zhàn)，研究簡(jiǎn)便、高效、精準(zhǔn)的診斷技術(shù)及有效的預(yù)防、治療方法對(duì)控制該病在中國(guó)的流行具有重要意義。

1 診斷方法

1.1 臨床診斷

在實(shí)驗(yàn)室診斷之前，可通過對(duì)病雞病理剖檢進(jìn)行初步診斷。若病雞關(guān)節(jié)處有黃色膿性滲出物，胸部腫脹有黃色奶酪樣物質(zhì)或褐色分泌物可懷疑為滑液囊支原體感染［16］。在診斷時(shí)需將滑液囊支原體病與其他有相似癥狀的疾病區(qū)分開［17］，如沙門氏菌病、病毒性關(guān)節(jié)炎、維生素B 族缺乏癥等。MS 病雞表現(xiàn)為食欲下降，生長(zhǎng)停滯，關(guān)節(jié)腫脹，跛行喜臥，排綠色稀便，剖檢有腱鞘炎［18］。沙門氏菌引起的雞白痢和雞傷寒會(huì)導(dǎo)致病雞不能站立，排白色稀便，剖檢體內(nèi)臟器有白色壞死灶。病毒性關(guān)節(jié)炎會(huì)導(dǎo)致病雞跛行甚至癱瘓，無死亡，食欲和精神狀態(tài)尚可［19］。維生素B 族缺乏癥會(huì)使病雞角弓反張呈觀星姿勢(shì)，神經(jīng)痙攣，體溫下降。

1.2 MS 的分離鑒定

無論是活禽還是死禽，若需運(yùn)輸，應(yīng)在采集完病料加入冰袋或其他制冷措施保持低溫［20］。將病雞解剖，取病料（喉頭、氣管、關(guān)節(jié)液、氣囊等）與PBS 緩沖液混合后破碎離心，取上清液過濾到液體培養(yǎng)基中，37 ℃溫箱培養(yǎng)3～5 d，觀察生長(zhǎng)情況，若培養(yǎng)基顏色變黃無渾濁沉淀，則說明生長(zhǎng)情況良好，可以將菌液涂布在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d，顯微鏡下觀察菌落狀態(tài)是否為煎蛋樣。這種方法比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求也比較高，雖準(zhǔn)確，但不利于快速檢測(cè)。

1.3 血清學(xué)方法

MS 的血清學(xué)診斷方法有平板凝集試驗(yàn)（SPA）、血凝抑制試驗(yàn)（HI）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。平板凝集試驗(yàn)（SPA）可以用于MS 感染早期的檢測(cè)，主要檢測(cè)IgM 抗體，這種檢測(cè)方法成本低、操作快捷、反應(yīng)靈敏，缺點(diǎn)是非特異性反應(yīng)較強(qiáng)，準(zhǔn)確率有待提高。血凝抑制試驗(yàn)（HI）是指利用血清中的抗凝集抗體與抗原結(jié)合而導(dǎo)致血凝被抑制的現(xiàn)象，主要檢測(cè)IgM 抗體，這種檢測(cè)方法特異性較好，但必須注意抗原的選擇和制備，所以比較費(fèi)時(shí)，靈敏性也較低［21］。

MS 的商品化ELISA 檢測(cè)試劑盒以檢測(cè)抗體為主，如Synbiotics 公司的禽敗血/滑液囊支原體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒、江西江藍(lán)純生物試劑有限公司的雞滑液囊支原體抗體（MS-Ab）ELISA 試劑盒等，這些試劑盒主要是以血凝素vlhA 蛋白為抗原檢測(cè)抗體。除此之外，溫政［22］制備并鑒定了LP78 蛋白單克隆抗體，選用的LP78 是一種免疫原性很強(qiáng)的膜蛋白。劉曉涵等［23］制備了滑液囊支原體NADH 氧化酶（NADH oxidase，NOX）的單克隆抗體。連麗燕等［24］對(duì)MS 糖酵解的關(guān)鍵酶磷酸丙糖異構(gòu)酶（Tpi）和丙酮酸激酶（PK）的研究也為后續(xù)制備抗體提供了參考。ELISA 檢測(cè)效率高、靈敏度高、特異性好，適合大量樣品的檢測(cè)，也可用于卵黃抗體的檢測(cè)。綜合來看，間接ELISA 靈敏度不如SPA，特異性不如HI。以上3 種方法都不能做到完全的準(zhǔn)確，可以選擇不同的方法綜合驗(yàn)證，初步篩選時(shí)可以選擇間接ELISA 或者SPA，復(fù)檢時(shí)可用HI。

1.4 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，可以直接檢測(cè)樣品中MS 的核酸，結(jié)果準(zhǔn)確率較高，但也有可能存在一定比例的假陽性和假陰性。常用于檢測(cè)MS 的分子生物學(xué)方法主要為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和熒光定量PCR（qPCR）［25］，微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ITA）是新技術(shù)，在臨床應(yīng)用上還較少。

PCR 鑒定是實(shí)驗(yàn)室鑒定MS 常用的分子生物學(xué)方法，通過擴(kuò)增MS 特異性的16S rRNA 片段或vlhA基因即可快速檢測(cè)，對(duì)比分離培養(yǎng)，PCR 鑒定更加快速可靠，便捷靈敏。熒光定量PCR 技術(shù)在MS 診斷方面已經(jīng)有了很大的發(fā)展，比普通PCR 有更高的靈敏度和特異性［26］。徐彬等［27］在鑒定出的17 個(gè)MS特有基因中選取了保守基因VY93_RS02885作為標(biāo)靶基因，建立了SYBR green qPCR 檢測(cè)方法，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性高、可重復(fù)性強(qiáng)。已有商品化的MS熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒，如IDEXX 公司的RealPCR MS DNA 檢測(cè)預(yù)混液、上海炎熙生物科技有限公司的探針法滑液支原體實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒。此外，韓勇等［28］針對(duì)雞毒支原體的pvpA基因和滑液囊支原體的vlhA基因建立了TaqMan-MGB 雙重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)方法，結(jié)果與商品熒光PCR 試劑盒的符合率達(dá)100%。

數(shù)字PCR 是在熒光定量PCR 之后發(fā)展起來的核酸定量分析技術(shù)，先將反應(yīng)體系均分到大量獨(dú)立的微反應(yīng)單元中，然后再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，最后根據(jù)泊松分布原理和陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例計(jì)算核酸拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn)定量分析［29］。謝志勤等［30］針對(duì)vlhA基因的保守區(qū)域建立了ddPCR 檢測(cè)方法，驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)這種方法特異性強(qiáng)、敏感性好，為絕對(duì)定量MS 提供了合適的技術(shù)。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ITA）是基于恒溫?cái)U(kuò)增的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)（CPA）、重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RAA）和依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）等［31］?？芷G利［32］基于MS 基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物后建立了LAMP 檢測(cè)方法，試驗(yàn)證實(shí)有較好的敏感性和特異性。卞紅春等［33］基于vlhA基因保守序列建立了RAA 檢測(cè)方法，不需要昂貴設(shè)備，有望應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室。

2 飼養(yǎng)管理

預(yù)防MS 首先需要提高雞場(chǎng)的管理水平和飼養(yǎng)人員的生物安全意識(shí)。應(yīng)定期培訓(xùn)、講解MS 以及其他傳染疫病的防控要點(diǎn)。人員需嚴(yán)格遵守進(jìn)出及消毒程序，注意滅鼠防蚊蟲，防飛禽進(jìn)入，及時(shí)清理排泄物，減少應(yīng)激因素，密切觀察雞群狀態(tài)［34］。雞群飼養(yǎng)密度不宜過大，確保棟舍通風(fēng)良好，減少塵埃顆粒懸浮時(shí)間，溫度濕度適宜，為雞群建造一個(gè)干凈適宜的生長(zhǎng)環(huán)境［35］。同時(shí)把控飼喂流程的各方面，場(chǎng)區(qū)實(shí)行全進(jìn)全出，不同批次分開飼養(yǎng)。進(jìn)行種源進(jìn)化，建立純凈的雞群是防控MS 最好的方法［36］。雞群一旦發(fā)生垂直傳播，傳播范圍變大，損失也將更大，發(fā)現(xiàn)MS 癥狀應(yīng)第一時(shí)間隔離診斷。在減抗限抗的背景下，治療用藥時(shí)可以減少抗生素的使用，加入黃芪多糖、維生素、微生物制劑等添加劑，提高雞群免疫力。也可以在預(yù)防MS 時(shí)在飼料中添加中藥，增強(qiáng)雞群體質(zhì)，抵御外邪。整個(gè)MS 發(fā)病過程中，肝、腎2 個(gè)臟器很重要，可以選用淫羊藿、益母草、黃芪、當(dāng)歸和女貞子等補(bǔ)肝益腎的藥物［37］。

3 疫苗接種

接種疫苗可以有效降低雞群的發(fā)病率，控制傳播范圍，在條件允許的情況下，應(yīng)該提前接種，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)MS 疫苗展開了研究，使用的疫苗主要是弱毒活疫苗和滅活疫苗［38］。雞滑液囊支原體弱毒活疫苗有MS-H 株和MS1 株。MS1 株弱毒疫苗是體外傳代培養(yǎng)突變得來，但該疫苗在中國(guó)未注冊(cè)［39］。弱毒活疫苗主要有MS-H 株，該疫苗株分離自澳大利亞，2017 年在中國(guó)注冊(cè)，MS-H 株對(duì)溫度敏感，需要在合適的溫度下運(yùn)輸，解凍后2 h 內(nèi)要完成接種。MS-H 株弱毒活疫苗可采用點(diǎn)眼和噴霧兩種方法接種，以點(diǎn)眼為主。經(jīng)過評(píng)估，該疫苗可以有效地減輕MS 的臨床癥狀，安全系數(shù)較高，MS-H 株弱毒活疫苗運(yùn)輸保存條件苛刻，免疫要求高，中國(guó)的雞群大部分是MS 陽性雞群，也不利于雞群的凈化，所以該疫苗在中國(guó)應(yīng)謹(jǐn)慎使用［40］。國(guó)內(nèi)注冊(cè)的滅活疫苗有青島易邦生物工程有限公司的雞滑液支原體滅活疫苗（YBF-MS1 株），該疫苗頸部皮下注射21 日齡及以上的雞，種雞和商品蛋雞可以在開產(chǎn)前一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次，屠宰前21 d 禁止使用，禁止冷凍，體質(zhì)瘦弱的雞禁止使用，接種后28 d 產(chǎn)生免疫力，免疫期為6 個(gè)月。也有其他滅活疫苗被學(xué)者評(píng)估過，例如雞滑液囊支原體WVU1853株和雞滑液囊支原體CHNJ2-2016 株［41］。滅活疫苗可以刺激雞機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，降低MS 的感染率，接種滅活疫苗后需要評(píng)估雞群的生產(chǎn)性能，同時(shí)還要選擇合適的佐劑。除上述之外，基因工程疫苗因?yàn)榘踩愿?、生產(chǎn)成本低，已經(jīng)成為疫苗研究的主要方向。宋春等［42］對(duì)MS 貴州株的膜蛋白EF-Tu、pdhβ 進(jìn)行了免疫原性分析，EF-Tu、pdhβ 重組蛋白都可以與MS 陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合。劉佳等［43］對(duì)MS WVU1853株的dnaK基因進(jìn)行了原核表達(dá)，間接ELISA 和Western-blot 的結(jié)果表明，rMSDnaK 具有良好的免疫原性，為進(jìn)一步研究MS DnaK 的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

4 藥物治療

疫苗接種效果有限，所以藥物治療也是防控MS的重要手段。該病遵循早發(fā)現(xiàn)、早治療的原則［44］，密切觀察雞群，發(fā)病后，如果有癥狀嚴(yán)重的一定要及時(shí)淘汰，無害化處理，癥狀較輕的及時(shí)藥物治療控制傳播［45］，對(duì)該病敏感有效的藥物有泰樂菌素、泰妙菌素、泰萬菌素、林可霉素、強(qiáng)力霉素、土霉素、四環(huán)素、萬古霉素和恩諾沙星等［46］。藥物治療時(shí)不建議大劑量和長(zhǎng)期用藥，同時(shí)應(yīng)該選用穿透力較強(qiáng)、敏感度較高的藥物［47］。張輝等［48］選用了中藥復(fù)方治療MS，以泰樂菌素作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥組效果明顯優(yōu)于對(duì)照組。張孝寧［49］研究了芩苓湯對(duì)滑液囊支原體病的治療作用，發(fā)現(xiàn)芩苓湯可以顯著降低IL-6、IL-8、TNF-αm RNA 的相對(duì)表達(dá)量，治愈率達(dá)53.3%，有效率達(dá)66.7%，對(duì)滑液囊支原體病有良好的治療效果。

5 展望

滑液囊支原體（MS）感染在全國(guó)范圍內(nèi)的流行日趨嚴(yán)重，給中國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成較大的損失，對(duì)MS 的防控是長(zhǎng)期和艱巨的任務(wù)，需要研發(fā)更加精準(zhǔn)、快速、便捷的MS 診斷方法，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，從源頭控制MS的傳播。已有藥物預(yù)防與治療的方法很多，但缺乏科學(xué)規(guī)范系統(tǒng)的綜合防控措施，疫苗和藥物的使用也缺乏科學(xué)的指導(dǎo)，導(dǎo)致的免疫效率低、耐藥、藥物殘留等問題不容忽視。研發(fā)更安全有效的MS 疫苗，篩選研制針對(duì)性更強(qiáng)的抗生素及中草藥替抗藥物迫在眉睫。