多殺性巴氏桿菌診斷技術(shù)及防控策略研究進(jìn)展

李 昕，張正剛，郭亞男，宗亮澤，梁小軍

（1.寧夏獸藥飼料監(jiān)察所，銀川 750002；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，銀川 750002；3.寧夏大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，銀川 750021；4.寧夏回族自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，銀川 750002）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）是條件致病菌，可引起多種家畜和野生動(dòng)物及人類的感染［1］。由Louis Pasteur 于1887 年在禽霍亂病例中分離得到，命名為巴斯德氏菌。其主要存在于動(dòng)物的口腔、鼻咽和上呼吸道，通過呼吸道分泌物和飛沫進(jìn)行傳播，致使宿主的呼吸道系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)等發(fā)生感染，從而致病，是一種重要的人畜共患疾病。但其對人的感染報(bào)道較少，在人體中主要通過動(dòng)物咬傷傳播，感染后可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)感染，引發(fā)敗血癥、腦膜炎等。1994 年起列為3 個(gè)亞種，即多殺亞種（P.multocidassp.multicida）、敗血亞種（P.multocidassp.Septzca）及殺禽亞種（P.multocidassp.Gallicida）［2］。

1 巴氏桿菌的特性

1.1 巴氏桿菌的結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性

P.multocida是小型、非運(yùn)動(dòng)兼性厭氧革蘭氏陰性球桿菌，無鞭毛，無芽孢，常以單個(gè)或成雙分布。中央微凸，寬度為0.3～1.0 μm，長度為1.0～2.0 μm。P.multocida菌株對培養(yǎng)條件營養(yǎng)要求苛刻，可以在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如在胰蛋白酶大豆瓊脂、巧克力瓊脂或腦心浸液瓊脂上生長良好，在5%無菌脫纖維羊血平板上可生長形成直徑約1 mm 灰白色、黏稠狀菌落，無溶血環(huán)產(chǎn)生［3］。在普通培養(yǎng)基和麥康凱（MacConkey）瓊脂培養(yǎng)基上不生長［4］。P.multocida在培養(yǎng)過程中可分解果糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖，產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣體；對過氧化氫酶、氧化酶、吲哚和鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)呈陽性，但對脲酶、甲基紅試驗(yàn)和VP 試驗(yàn)均為陰性，不液化明膠、石蕊牛乳無變化，能產(chǎn)生硫化氫［5］。

1.2 巴氏桿菌的發(fā)病機(jī)制

P.multocida作為重要的呼吸道病原體，可通過誘發(fā)宿主上皮屏障的功能障礙，從而導(dǎo)致細(xì)菌入侵以及氣道和肺炎癥性疾病的發(fā)展［6］。其發(fā)病機(jī)制的分子基礎(chǔ)主要涉及莢膜、脂多糖（LPS）、鞭毛、粘附素、多殺性巴氏桿菌毒素（P.multocidatoxin，PMT）和外膜蛋白等毒力因子［7］，編碼P.multocida特征的基因包括exbB、exbD、fimA、fur、hgbA、hgbB、hsf1、hsf2、nanB、nanH、oma87、ompA、ompH、pfhA、plpB、plpE、pmHAS、psl、ptfA、sodA、sodC、tadD、tbpA、tonB和toxA。這些編碼毒力因子基因?qū)Π褪蠗U菌的粘附、入侵和抗殺傷至關(guān)重要［8］。呼吸道疾病是一種多因素疾病，其特征是細(xì)菌病原體侵入下呼吸道，誘發(fā)因素是病毒合并感染、斷奶應(yīng)激、管理不善、飲食改變、天氣變化、運(yùn)輸和拍賣市場的混合等［9］。P.multocida感染主要為急性呼吸道疾病，臨床癥狀為高熱、鼻涕，并伴有大量流涎，隨后迅速出現(xiàn)呼吸窘迫、膿毒性休克伴有出血，幾天內(nèi)死亡。尸檢顯示氣管、肺、小腸和肝臟極度充血［10］。潛伏期一般為2～5 d，幼畜抵抗力較弱，較為易感。多種微生物感染比單一物種感染表現(xiàn)出更為復(fù)雜的病理特征［11］。

2 多殺性巴氏桿菌診斷技術(shù)

2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，可看作是生物體外的特殊DNA 復(fù)制，其最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。PCR 與凝膠電泳等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合使用，越來越多地用于細(xì)菌的分離與鑒定，能夠擴(kuò)增和檢測來自一個(gè)或幾個(gè)靶分子的特定核苷酸序列，提高檢測效率。與單次PCR 相比，多重PCR可以同時(shí)檢測多種病原體，具有節(jié)省時(shí)間、提高效率和成本低等優(yōu)點(diǎn)，為鑒別診斷提供了很好的選擇。DNA 檢測包括4 個(gè)步驟：DNA 提取、DNA 擴(kuò)增、電泳和凝膠圖像分析，此過程非常耗時(shí)并且分析通量較低。此外，在轉(zhuǎn)移擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測和分析的過程中，由于殘留污染，假陽性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)較高。PCR 按原理和用途可分為常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等，是多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的重要分子生物學(xué)技術(shù)［12］。施少華等［13］建立了檢測禽多殺性巴氏桿菌的PCR 法，唐先春等［14］分別針對kmt和toxA基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，能夠同時(shí)檢測并區(qū)分產(chǎn)毒素型與非產(chǎn)毒素型多殺性巴氏桿菌。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR）是一種在DNA 擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA 序列進(jìn)行定量分析的方法。該分子技術(shù)被廣泛用于微生物學(xué)和臨床診斷研究，可以實(shí)時(shí)檢測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的量，與常規(guī)方法相比，具有分析時(shí)間更短的特點(diǎn)［15，16］。1991 年，Holland 等［17］描述了一種技術(shù)，通過監(jiān)測TaqDNA 聚合酶的5′→3′核酸內(nèi)切酶活性對特異性寡探針/靶DNA 雙鏈體的影響來檢測擴(kuò)增子，為使用熒光寡探針進(jìn)行均相PCR 奠定了基礎(chǔ)。該技術(shù)需要平臺(tái)激發(fā)、檢測熒光以及執(zhí)行熱循環(huán)。1992 年，Nakayama 等［18］描述了一種電荷耦合裝置，用于定量傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR 產(chǎn)物。1993 年，Higuchi等［19］將該技術(shù)與熱循環(huán)儀相結(jié)合，產(chǎn)生了第一個(gè)實(shí)時(shí)PCR 熒光激發(fā)和檢測平臺(tái)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 因其快速性、靈敏度高、重復(fù)性高并且結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用，根據(jù)與核酸的結(jié)合方式熒光定量PCR 被分為染料法和探針法。

熒光定量PCR 探針法就是在反應(yīng)體系中除加入1 對特異性引物外，再加入1 條特異性熒光探針，此探針可與上下游引物之間的模板序列相匹配，最常用的就是TaqMan 探針。Real-timePCR 是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號對PCR 進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。由于在PCR 擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。定量分為相對定量、絕對定量。相對定量描述了目標(biāo)序列量與其在相關(guān)基質(zhì)中的水平相比的變化，絕對定量說明了樣品中存在的核酸靶標(biāo)相對于特定單位的確切數(shù)量［20］，通常因?yàn)橄鄬Χ刻峁┝俗銐虻男畔?，所以更容易開發(fā)。TaqMan 熒光定量PCR 是一種快速工具，每形成1 條DNA 雙鏈，就有1個(gè)單位熒光信號產(chǎn)生，熒光信號強(qiáng)度變化與PCR 產(chǎn)物濃度變化呈正相關(guān)。根據(jù)Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算這些生物的豐度值，從而為臨床提供額外的數(shù)據(jù)。由于TaqMan 探針與模板的結(jié)合同樣遵循堿基互補(bǔ)配對原則，1 條探針對應(yīng)1 條模板鏈，因此，TaqMan 探針法比染料法有更高且有不同波長類型的熒光基團(tuán)以供選擇，可實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒舛縋CR［21］。

熒光染料法中最常用的染料是SYBR Green I，利用SYBR Green I 與雙鏈DNA 結(jié)合的特性，可以檢測PCR 反應(yīng)過程中所有的雙鏈DNA，但無法區(qū)分不同雙鏈DNA，還需要特異性較強(qiáng)的引物防止非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生［22］。在高溫下，雙鏈DNA 擴(kuò)增子開始轉(zhuǎn)化為單鏈（熔體），因此熒光的振幅下降。當(dāng)50%的DNA 從雙鏈熔化為單鏈時(shí)，此時(shí)的溫度被稱為解鏈溫度（TM）［23］。

2.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）

2006 年，Piepenburg 等［24］利用參與細(xì)胞DNA 合成、重組和修復(fù)的蛋白質(zhì)開發(fā)了重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA），RPA 是高靈敏度和高選擇性的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可在37～42 ℃操作，整個(gè)過程進(jìn)行得非?？?，只需少量的樣品就能在1 min 內(nèi)擴(kuò)增至10～20個(gè)DNA 靶拷貝［25］。在RPA 中，重組酶與引物結(jié)合，所得復(fù)合物的引物與DNA 模板的同源序列結(jié)合，然后，鏈置換DNA 聚合酶延伸引物，單鏈DNA 結(jié)合蛋白（SSB）與未纏繞的鏈結(jié)合。因不需要熱循環(huán)儀，RPA 比PCR 更適合在田間使用［26］。其擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過凝膠電泳、側(cè)流色譜或熒光進(jìn)行分析［27］。RPA對技術(shù)和設(shè)備的要求相對較低，具有使用方便、靈敏度高、耗時(shí)少、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［28］。Zhao 等［29］將RPA 檢測和側(cè)流試紙（LFD）二者相組合，建立了鑒定多殺性巴氏桿菌保守基因Kmt1的RPA-LFD 檢測方法，利用建立的方法和實(shí)時(shí)定量PCR 方法分別對來自62 個(gè)奶牛場的33 個(gè)鼻拭子和17 個(gè)新鮮肺樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，RPA-LFD檢測方法的臨床特異性和靈敏度更高。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification ，LAMP）是由Notomi 等［30］在2000年開發(fā)的可在等溫條件下以高特異性、高效率和快速性擴(kuò)增DNA 的新方法。LAMP 經(jīng)常用于檢測人類、牲畜和植物的傳染病，反應(yīng)終點(diǎn)有多種檢測方法，包括濁度法、瓊脂糖凝膠電泳法和紫外光檢測法［31］。LAMP 具有檢測閾值低、速度快、檢測所需設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)可與逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合使用，也適用于RNA 的擴(kuò)增（RT-LAMP）［32］。缺點(diǎn)是污染、序列相似性和引物二聚體引起擴(kuò)增過程中的假陽性［33，34］。Bhimani 等［35］在2015 年對疑似禽霍亂和出血性敗血癥的死禽和動(dòng)物（牛、水牛、綿羊和山羊）的不同組織中獲得22 株P(guān).multocida分離株，使用新設(shè)計(jì)的KMT1基因引物序列對Loop 介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）進(jìn)行鑒定，同時(shí)與PCR 檢測方法相比較，結(jié)果表明LAMP 比PCR 更靈敏。Moustafa 等［36］開發(fā)了2 種LAMP 方法用來檢測水牛出血性敗血癥（HS）相關(guān)菌株的多殺性巴氏桿菌DNA，對LAMP 檢測結(jié)果與專為特異性檢測HS 相關(guān)菌株的B∶2 血清型而設(shè)計(jì)的傳統(tǒng)PCR 檢測進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，HSLAMP 檢測方法具有較高的敏感性和特異性。Pascual-garrigos 等［37］設(shè)計(jì)了一種LAMP 檢測方法，使用具有89%分析特異性和99%分析靈敏度的熒光報(bào)告基因檢測牛鼻標(biāo)本中多殺性巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌和嗜血組織素的存在，結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室對相同樣品進(jìn)行的PCR 測定有60%～100%的一致性。

3 多殺性巴氏桿菌的防控策略

P.multocida是一種高度傳染性疾病，幾乎影響所有的動(dòng)物物種，控制措施昂貴且效果十分有限。牛巴氏桿菌病的診斷主要是臨床表現(xiàn)、尸檢和傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)技術(shù)，但是這些技術(shù)被認(rèn)為耗時(shí)且缺乏可靠性［38］。獲得及時(shí)和準(zhǔn)確的診斷具有挑戰(zhàn)性［39］，因?yàn)椴淮_定從樣本中回收的病原體是否具有致病性。使用抑制微生物傳播的消毒劑定期清潔宿主環(huán)境是預(yù)防該病原體引起的疾病的最佳方法。

用滅活細(xì)菌（細(xì)菌素）或減毒活細(xì)菌接種疫苗是預(yù)防和保護(hù)動(dòng)物免受多殺性巴氏桿菌感染的有效和經(jīng)濟(jì)的方法［40］。對于多殺性巴氏桿菌病臨床治療的主要手段是使用廣譜抗生素，治療P.multocida的抗生素有多種，包括β-內(nèi)酰胺類（最常見的是第3 代頭孢菌素）、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氟苯尼考和磺胺類［41，42］。在澳大利亞，當(dāng)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物有巴氏桿菌感染的臨床癥狀且無耐藥性時(shí)，建議將四環(huán)素和替米考星作為呼吸道疾?。˙RD）治療的一線抗菌藥物，當(dāng)一線藥物無效時(shí)，推薦將托拉霉素作為呼吸道疾病治療的二線抗菌藥物。然而，在商業(yè)實(shí)踐中，現(xiàn)場獸醫(yī)經(jīng)常使用托拉霉素作為一線藥物治療?？股刂委熆赡苡捎诙喾N原因失敗，包括誤診、藥物選擇不當(dāng)、給藥率不當(dāng)、脫水等。同時(shí)，抗生素濫用被認(rèn)為是細(xì)菌耐藥的主要原因，隨著時(shí)間的推移，問題會(huì)惡化。由耐藥細(xì)菌引起的治療失敗導(dǎo)致P.multocida發(fā)病率和死亡率增加。因此，對多殺性巴氏桿菌病和耐藥性菌株的快速診斷有助于多殺性巴氏桿菌病的及時(shí)預(yù)防、控制和治療。