二肽激肽酶4抑制劑對帕金森病模型細胞形態(tài)和增殖的干預(yù)作用及其機制

伊木然江·蘇布哈提，艾尼瓦爾·吾買爾，木塔力甫·艾買提

1 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，烏魯木齊 830017；2 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室

帕金森?。≒D）是一種慢性進行性神經(jīng)退行性疾病，與年齡相關(guān)，可被定義為環(huán)境因素與遺傳易感性相互作用的多因素疾?。?］。多項研究顯示，PD 及其他神經(jīng)退行性疾病與2 型糖尿?。═2DM）之間存在一定程度的相關(guān)性［2］。T2DM 在細胞代謝、神經(jīng)元活力及神經(jīng)行為等方面對神經(jīng)細胞產(chǎn)生影響，其病理生理機制包括胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、神經(jīng)炎癥和蛋白質(zhì)折疊異常等，可導(dǎo)致神經(jīng)元細胞功能障礙或死亡，從而觸發(fā)PD等神經(jīng)退行性病變［3-4］。二肽激肽酶4（DPP-4）抑制劑是一種新型抗糖尿病藥物，能夠通過抑制體內(nèi)DPP-4 酶的活性增強腸促胰島素效應(yīng)，進而促進胰島β 細胞分泌胰島素和抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素來達到降低血糖的目的。目前，DPP-4 抑制劑西格列汀、利格列汀、維格列汀、沙格列汀及阿格列汀等已在我國上市并列入醫(yī)保藥品目錄［5-6］。管雅文等［7］研究顯示，在原有治療方案基礎(chǔ)上給予T2DM 合并PD 患者利格列汀治療24 周可明顯改善患者的運動功能?，F(xiàn)有研究大多對某一個DPP-4抑制劑對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用進行探討，而DPP-4抑制劑改善PD 的作用機制及潛在治療靶點等問題尚未明確。2021 年8 月—2023年2月，本研究通過體外實驗結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，初步探討了DPP-4 抑制劑對PD 的干預(yù)作用及其相關(guān)機制，以期為DPP-4抑制劑在PD 治療中的應(yīng)用提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 DPP-4抑制劑對PD體外模型的干預(yù)作用觀察

1.1.1 主要材料 神經(jīng)細胞株P(guān)C-12 購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所細胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基、馬血清和特級胎牛血清均購自以色列Biological Industries，胰蛋白酶購自美國Gibco，DMSO 購自美國Sigma，魚藤酮（ROT）購自美國MedChemExpress，二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜及酶標儀均購自美國Thermo Fisher Scientific，電熱恒溫水槽購自上海一恒，倒置顯微鏡購自日本Nikon，低溫高速離心機購自美國Sigma。

1.1.2 細胞培養(yǎng)及分組 PC-12 細胞置于含10%胎牛血清、5%馬血清、100 U/mL青霉素及100 g/mL鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)增長期后，以5×103/孔接種到96孔板中，在CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2、飽和濕度）中常規(guī)培養(yǎng)16～18 h。將細胞分為對照組、模型組、模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組。

1.1.3 PD 體外模型建立及藥物干預(yù)處理 待細胞貼壁后，去掉原培養(yǎng)基，除對照組外各組均使用ROT 建立PD 體外模型。結(jié)合前期預(yù)實驗結(jié)果及參考文獻報道，選擇0.2 μmol/L 的ROT 作為PD 模型的造模濃度。模型組加入含0.2 μmol/L ROT 的完全培養(yǎng)基，模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組同時加入含0.2 μmol/L 的 ROT 及20 μmol/L 的西格列汀、5 μmol/L 的利格列汀、10 μmol/L的維格列汀含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，對照組常規(guī)培養(yǎng)不做任何處理。

1.1.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察 去除處理24 h 后的各組細胞原培養(yǎng)液，用37 ℃提前預(yù)熱的PBS 輕輕沖洗2～3 次，利用倒置顯微鏡觀察各組細胞間的形態(tài)差異，并拍照記錄。

1.1.5 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8 法。各組細胞處理24 h后，去掉原含藥培養(yǎng)液，每孔加入200 μL新鮮培養(yǎng)基，在避光條件下每孔加入20 μL的CCK-8試劑溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h 后，用酶標儀檢測各組在450 nm處的吸光度（A）值。計算各組細胞存活率，以此表示細胞增殖能力。細胞存活率=目的組A值/對照組A值×100%。

1.2 DPP-4抑制劑作用于PD的機制分析

1.2.1 DPP-4 抑制劑作用于PD 的相關(guān)靶點收集利用Swiss Target Prediction、SEA、Super-Pred 及PharmMapper 等數(shù)據(jù)庫分別獲取DPP-4 抑制劑西格列汀、利格列汀、維格列汀、沙格列汀及阿格列汀的藥物靶點，在“Select Species”中選擇“Homo Sapiens”，下載人源靶點，并將5 種藥物靶點信息利用UniProt 數(shù)據(jù)庫進行標準化處理、合并去重復(fù)等操作后得到藥物作用靶點。以“Parkinson's Disease”為疾病關(guān)鍵詞，通過DisGeNet、OMIM 和GeneCards 等數(shù)據(jù)庫獲得PD 相關(guān)的疾病靶點。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫將疾病靶點名轉(zhuǎn)換為相對應(yīng)的基因名稱，合并去重后最終得到PD 相關(guān)的疾病靶點。最后將篩選得到的5 種DPP-4 抑制劑治療靶點和PD 疾病靶點輸入到韋恩圖制作平臺，比對取交集后得到DPP-4 抑制劑治療PD的潛在作用靶點。將每個藥物與PD的交集靶點再取交集，得到DPP-4抑制劑作用于PD 的相關(guān)靶點。

1.2.2 DPP-4 抑制劑作用于PD 關(guān)鍵靶點篩選 將DPP-4 抑制劑作用于PD 的相關(guān)靶點輸入到String 數(shù)據(jù)庫中，生物種類選定為“Homo sapiens”構(gòu)建蛋白—蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。然后將其.TSV格式文件導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中，利用NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，選取基因滿足度（Degree）值＞平均值的基因作為DPP-4 抑制劑對PD 產(chǎn)生作用的關(guān)鍵靶點。

1.2.3 DPP-4 抑制劑作用于PD 的關(guān)鍵靶點GO 基因功能與KEGG 作用通路分析 將DPP-4 抑制劑作用于PD 的關(guān)鍵靶點基因輸入到DAVID 數(shù)據(jù)庫中，限定物種為“Homo Sapiens”，得到GO 基因功能和KEGG 作用通路分析結(jié)果。從GO 基因功能分析P＜0.05 的數(shù)據(jù)中按Count 值大小排序，選擇前15 的數(shù)據(jù)；從KEGG 通路分析P＜0.05 的數(shù)據(jù)中選擇最相關(guān)的20個通路進行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用微生信數(shù)據(jù)平臺進行可視化。

1.2.4 DPP-4抑制劑作用于PD的核心靶點篩選分別將DPP-4 抑制劑治療PD 的關(guān)鍵靶點以及KEGG 信號通路導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“藥物—疾病—靶點—通路”網(wǎng)絡(luò)，篩選與PD相關(guān)信號通路關(guān)系最為密切的靶點作為DPP-4抑制劑治療PD的核心靶點。

1.2.5 DPP-4 抑制劑與核心靶點的分子對接驗證 為了初步預(yù)測和研究目標蛋白和配體在分子水平上的關(guān)系，采用CB-Dock 2 對接平臺進行分子對接實驗。首先將核心靶點的UniProt ID 輸入到AlphaFold 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫下載靶點蛋白的PDB格式文件。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫下載5 種DPP-4 抑制劑3D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件，將藥物和核心靶點的文件上傳到CB-Dock 2 數(shù)據(jù)庫中獲取對接結(jié)果。CB-Dock 2可以自動識別目標蛋白質(zhì)的結(jié)合位點、計算中心位置、制定對接盒尺寸，并使用對接程序AutoDock Vina進行對接。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prisim 9.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk 法行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以-x±s表示，多組間比較行單因素方差分析，兩組間比較行獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞形態(tài)學(xué)比較 對照組細胞形態(tài)完整，增長狀態(tài)良好，細胞呈多角形，細胞之間類似突觸樣連接且突觸較長；模型組細胞密度減少，細胞皺縮，細胞與細胞間的突觸樣連接斷裂，且觀察到較多圓形的損傷細胞；模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組較模型組細胞形態(tài)得到改善，恢復(fù)到正常狀態(tài)下的細長、多角形態(tài)。見OSID碼圖1。

2.2 各組細胞增殖能力比較 對照組、模型組、模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組細胞存活率分別為100.00% ± 0.00%、81.85% ±0.64%、96.04% ± 2.43%、90.74% ± 1.32%、88.59% ± 0.76%；模型組細胞存活率低于對照組、模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組（P均＜0.05），對照組、模型+西格列汀組、模型+利格列汀組、模型+維格列汀組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 DPP-4 抑制劑作用于PD 的相關(guān)靶點收集結(jié)果 共收集西格列汀藥物靶點486 個、利格列汀藥物靶點665 個、維格列汀藥物靶點524 個、沙格列汀藥物靶點507個、阿格列汀藥物靶點408個，PD 疾病相關(guān)靶點1 121 個。將5 種DPP-4 抑制劑的靶點分別與PD 疾病相關(guān)靶點取交集分別得到80、76、88、77、62 個交集靶點，將交集靶點進行二次取交集，共得到DPP-4 抑制劑作用于PD 的36 個相關(guān)靶點。見OSID碼圖2。

2.4 DPP-4 抑制劑作用于PD 的關(guān)鍵靶點篩選結(jié)果 PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，DPP-4 抑制劑作用于PD 相關(guān)靶點中Degree 值＞平均值（12.7）的關(guān)鍵靶點共有16個，分別為ALB、IGF1、STAT3、CASP3、EGFR、ESR1、MAPK14、PPARG、MAPK1、HMOX1、NOS3、REN、MMP3、IL2、AR、IGF1R。見OSID碼圖3。

2.5 DPP-4 抑制劑作用于PD 的關(guān)鍵靶點GO 基因功能與KEGG 作用通路分析結(jié)果 GO 分析結(jié)果顯示，DPP-4 抑制劑作用于PD 的關(guān)鍵靶點共同涉及的生物過程主要包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞遷移的正向調(diào)控和細胞凋亡的負向調(diào)控等，細胞組分主要包括細胞質(zhì)、細胞質(zhì)膜、細胞核和大分子配合物等，分子功能主要包括酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等。KEGG 通路富集分析共得到20 條信號通路，與PD 較為相關(guān)的信號通路為PI3KAKT 信號通路、FoxO 信號通路、MAPK 信號通路等。見OSID碼圖4、5。

2.6 DPP-4 抑制劑作用于PD 的核心靶點篩選結(jié)果 藥物—疾病—靶點—通路網(wǎng)絡(luò)圖顯示，在PI3KAKT、FoxO 及MAPK 信號通路中均有富集的靶點為IGF1、EGFR、IGF1R及MAPK1。見OSID碼圖6。

2.7 核心靶點的分子對接驗證結(jié)果 分子對接結(jié)果顯示，5 種DPP-4 抑制劑均與PD 相關(guān)核心靶點蛋白有較好的結(jié)合，其結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol。見OSID碼圖7。

3 討論

PD 是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，在中老年人中多發(fā)并呈現(xiàn)年輕化趨勢［8］。DPP-4 抑制劑是新型T2DM 治療藥物，而T2DM 與PD 之間存在一定聯(lián)系。有研究顯示，T2DM 不僅是PD 發(fā)病的危險因素，而且是PD 運動及非運動癥狀的改變因素［9］。并且，存在糖尿病并發(fā)癥的人群罹患PD的風(fēng)險也會升高［10］。一項病例對照研究顯示，服用DPP-4 抑制劑的病例展現(xiàn)出較低的PD發(fā)病率［11］；一項回顧性研究也發(fā)現(xiàn)，服用DPP-4抑制劑的糖尿病PD 患者顯示出更高的多巴胺轉(zhuǎn)運體基線和更好的運動功能［12］。基于T2DM 與PD 之間的聯(lián)系，理論上降糖藥物或抗糖尿病的方法可能成為治療或者改善PD 或糖尿病合并PD 的新選擇。DPP-4 抑制劑是近幾年上市的新型口服降糖藥物，其通過增加腸促胰素水平間接刺激胰島β細胞分泌胰島素來發(fā)揮降糖作用。近期一項病例對照研究結(jié)果表明，接受DPP-4 抑制劑治療與T2DM 及T2DM 合并PD 患者的未來PD 發(fā)展風(fēng)險呈負相關(guān)［13］。因此，評估現(xiàn)有的抗糖尿病藥物在神經(jīng)退行性疾病中的作用，并且基于PD和糖尿病的相關(guān)性及共同病理機制，權(quán)衡抗糖尿病藥物修飾或改善PD 進展的可能性具有重要意義［12］。探討DPP-4抑制劑對PD的干預(yù)作用及其相關(guān)機制或可為PD的治療提供新的方向。

為了在細胞水平上初步驗證DPP-4 抑制劑對PD 的保護作用，我們選用大鼠PC-12 細胞作為本研究的實驗細胞。PC-12 細胞能表達酪氨酸羥化酶并合成多巴胺，是國內(nèi)外神經(jīng)退行性疾病研究中常用的體外實驗細胞，具有增長速度塊、傳代穩(wěn)定、對細胞生長環(huán)境要求不高等優(yōu)點，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的較為成熟的模擬實驗對象［14］。PD 的體外建模方法有很多種，其中利用ROT 建立損傷模型是較為成熟的方法。ROT 導(dǎo)致PD 的毒性機制受多因素的影響，如α 突觸核蛋白異常聚集、線粒體功能異常、活性氧產(chǎn)生增加、抗氧化防御系統(tǒng)受損及細胞異常凋亡等［15］。本研究選擇ROT 作為PC-12 細胞PD 模型建立的造模藥物，結(jié)合前期預(yù)實驗結(jié)果和參考文獻報道，選擇0.2 μmol/L 的ROT 濃度作為PD 模型的造模濃度。通過細胞形態(tài)學(xué)觀察、CCK-8 法觀察西格列汀、維格列汀和利格列汀與ROT 共同干預(yù)后的PC-12 細胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組細胞增殖受到抑制、細胞形態(tài)受損，提示0.2 μmol/L的ROT 建立PD 體外模型造模成功。在ROT 基礎(chǔ)上，同時加入西格列汀、利格列汀和維格列汀后，與模型組比較，細胞存活率升高，細胞形態(tài)更為完整。皺縮變形的細胞群體占比例更小，細胞形態(tài)接近對照組細胞，同時細胞存活率也得到了改善。這些結(jié)果進一步提示DPP-4 抑制劑組能夠提高細胞存活率，阻斷ROT對PC-12細胞的損傷，起到保護細胞形態(tài)完整和增殖能力的作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以網(wǎng)絡(luò)靶標作為核心要點，在藥物發(fā)現(xiàn)、藥物解析及治療疾病方面發(fā)揮獨特優(yōu)勢，可以作為單體藥物、中醫(yī)藥領(lǐng)域藥理作用靶點解釋方面很好的工具［16］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法得到了5 種DPP-4 抑制劑作用于PD 的36 個相關(guān)靶點及16個關(guān)鍵靶點。GO富集結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點可能主要通過酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等方式在細胞質(zhì)、細胞質(zhì)膜、細胞核等處發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞遷移的正向調(diào)控和細胞凋亡的負向調(diào)控等生物行為。對關(guān)鍵作用靶點的KEGG 通路分析結(jié)果表明，DPP-4 抑制劑作用于PD 產(chǎn)生干預(yù)作用的主要機制很可能與PI3KAKT、FoxO、MAPK 等信號通路有關(guān)。建立藥物—疾病—靶點—通路網(wǎng)絡(luò)顯示，IGF1、EGFR、IGF1R 和MAPK1 這4 個靶點除了Degree 值較高外，均富集在PI3K-AKT、FoxO 和MAPK 信號通路，且分子對接結(jié)果也顯示，IGF1、EGFR、IGF1R 和MAPK1 與DPP-4抑制劑之間主要通過氫鍵相結(jié)合，其結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，提示以上靶點可能是DPP-4 抑制劑在PD治療方面發(fā)揮重要作用的靶點。

研究表明，胰島素/IGF1 信號通路受損可能與PD 的病理生理過程有關(guān)。PD 患者中胰島素/IGF1信號發(fā)生改變，可表現(xiàn)為黑質(zhì)致密部嚴重變性，胰島素受體底物1 表達增加［17-18］。在DPP-4 抑制劑治療PD 的靶點中，IGF1 和IGF1R 具有較高的Degree 值，在二次交集靶點的KEGG信號通路結(jié)果也顯示，5種DPP-4抑制劑通過這兩個通路發(fā)揮作用。因此DPP-4抑制劑改善PD 的作用可能是通過調(diào)節(jié)IGF1 來實現(xiàn)。此外，MAPK1 也參與多種細胞過程，如細胞周期、細胞凋亡、細胞存活等，在PD病程進展過程中發(fā)揮一定作用［19］。在PD 病理生理過程中，激活PI3K/AKT 信號通路能夠促進內(nèi)皮細胞存活，限制神經(jīng)元損傷，并阻斷炎癥神經(jīng)元死亡。研究顯示，AKT 可通過抑制促凋亡細胞因子同時激活抗凋亡細胞因子來調(diào)節(jié)促凋亡和抗凋亡之間的平衡，從而影響神經(jīng)元存活［20］。這提示DPP-4 抑制劑很可能通過介導(dǎo)PI3K/AKT 信號通路和凋亡通路來保護神經(jīng)元。由上可見，DPP-4 抑制劑治療PD 的過程是一個多靶點，多通路共同作用的結(jié)果，其中PI3K-AKT 通路和胰島素抵抗通路可能發(fā)揮主要的作用。

綜上所述，前述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)DPP-4 抑制劑對PD 體外模型具有積極地干預(yù)作用，其可能通過IGF1、EGFR、IGF1R 及MAPK1 等核心靶點作用于PI3K-AKT、FoxO、MAPK 等信號通路發(fā)揮作用。PD 的病理生理過程是復(fù)雜的，因此應(yīng)被視為一種全身性疾病，而不僅僅是一種神經(jīng)退行性疾病，包括DPP-4 抑制劑等用于治療T2DM 的手段有望在單純T2DM 中預(yù)防或者降低PD 的發(fā)生概率，且在T2DM合并PD中治療或改善PD癥狀。