白色念珠菌致病機制研究進(jìn)展

駱陽，徐興偉，嵇武

1 南京醫(yī)科大學(xué)金陵臨床醫(yī)學(xué)院 東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普外科，南京 210002；

2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院結(jié)直腸外科

隨著二代測序技術(shù)的不斷發(fā)展，人們在腸道微生物組中發(fā)現(xiàn)了除細(xì)菌以外的另一重要組群的存在，即共生真菌組。共生真菌多樣性及豐度的改變已被證明與多種疾病相關(guān)，例如炎癥性腸病、結(jié)直腸癌、抗生素相關(guān)性腹瀉、腸易激綜合征以及過敏性鼻炎等［1-5］。作為一種機會性致病菌，共生真菌在機體免疫功能低下、藥物干預(yù)等多種情況下可引發(fā)疾病。對于腸道而言，定植在腸道的共生真菌會損害并突破腸黏膜屏障發(fā)生菌群易位，引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)，甚至侵入循環(huán)系統(tǒng)，造成播散性真菌病。白色念珠菌作為腸道共生真菌的優(yōu)勢菌群，其群落形態(tài)、豐度的改變可隨機體免疫狀態(tài)而發(fā)生變化，可通過形成菌絲體、分泌念珠菌溶素及分泌細(xì)胞外囊泡（EVs）等多種機制損傷機體上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及各種免疫細(xì)胞，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。然而，目前對白色念珠菌通過何種方式引發(fā)疾病以及疾病的進(jìn)展又如何影響真菌多樣性和豐度變化的認(rèn)識依舊不夠全面，導(dǎo)致臨床治療手段也較為局限。因此，深入探究白色念珠菌的致病機制對于進(jìn)一步認(rèn)識真菌，探尋新的治療方法具有重要意義?，F(xiàn)就白色念珠菌致病機制研究進(jìn)展綜述如下。

1 白色念珠菌通過形成菌絲體導(dǎo)致疾病發(fā)生

白色念珠菌具有分化成多種形態(tài)的能力，其分化形態(tài)包括但不限于單細(xì)胞酵母、假菌絲、菌絲、生物膜狀態(tài)以及獨特的孢子形態(tài)，不同狀態(tài)的白色念珠菌具有獨特的生物學(xué)作用。白色念珠菌發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)是其獨特的細(xì)胞壁組成。白色念珠菌的細(xì)胞壁具有兩層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層由幾丁質(zhì)、β-1，3-葡聚糖及β-1，6-葡聚糖組成，外層是富含N-或O-連接的甘露聚糖修飾的蛋白質(zhì)，稱為甘露糖蛋白［6］。在機體免疫功能正常時，大部分白色念珠菌以酵母形態(tài)黏附在腸黏膜上，此時低表達(dá)毒力因子，主要對機體的免疫系統(tǒng)起到塑造作用，代表著與機體共生適應(yīng)［7］。而當(dāng)受到各種刺激或生存環(huán)境改變時，白色念珠菌會從酵母狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z狀態(tài)，可造成組織入侵及免疫逃避［8］。因此，普遍認(rèn)為絲狀化是白色念珠菌的主要毒力特性之一。與白色念珠菌菌絲形成相關(guān)的基因包括ADH1、ALS3、BMH1、RBT1、UBP8、UME6 及UTR2 等［8-10］。cAMP-PKA 通路被認(rèn)為是白色念珠菌絲狀化的主要信號通路，并多次在體外試驗中被證實。但PARRINO 等［11］通過體外構(gòu)建了缺乏腺苷酸環(huán)化酶（AC）的假回復(fù)白色念珠菌株，發(fā)現(xiàn)缺乏AC 的部分白色念珠菌能夠以不依賴cAMP 的方式完成絲狀化。同樣的，WAKADE 等［12］在體內(nèi)實驗中也證實AC 缺失的白色念珠菌依舊能夠順利完成絲狀化。這提示白色念珠菌絲狀化是極其復(fù)雜的過程，有多條信號傳導(dǎo)通路。一般認(rèn)為，完成絲狀化的白色念珠菌通過菌絲以物理方式刺破吞噬體的細(xì)胞膜，但也有學(xué)者提出，菌絲形成只是白色念珠菌殺死吞噬細(xì)胞的形態(tài)基礎(chǔ)，暴露的菌體細(xì)胞壁糖基化蛋白誘導(dǎo)吞噬體程序性死亡啟動，是觸發(fā)宿主細(xì)胞死亡的更深層機制，并最終完成免疫逃逸造成播散［13］。

2 白色念珠菌通過分泌念珠菌溶素導(dǎo)致疾病發(fā)生

念珠菌溶素是由MOYES 等［14］于2016 年在白色念珠菌中發(fā)現(xiàn)的第一種真菌溶細(xì)胞肽毒素，其是白色念珠菌的致病因子之一。念珠菌溶素是由基因ECE1編碼翻譯后的產(chǎn)物，ECE1呈α-螺旋并包含7個KR（賴氨酸—精氨酸）位點，首先經(jīng)過蛋白內(nèi)切酶Kex2p 切割加工產(chǎn)生未成熟的念珠菌溶素，然后由羧肽酶Kex1p 進(jìn)一步去除C 末端的精氨酸，形成有活性的成熟念珠菌溶素［14］。

念珠菌溶素可通過多種方式導(dǎo)致細(xì)胞壞死。BLAGOJEVIC 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌菌絲可與上皮細(xì)胞頂端膜接觸形成凹陷的“侵入袋”，有利于念珠菌溶素的聚集，其C末端帶正電荷的KR殘基能夠與質(zhì)膜上帶負(fù)電荷的成分相互作用并成孔，以Ca+內(nèi)流的方式造成胞內(nèi)線粒體膜去極化并失活破裂，釋放大量活性氧，導(dǎo)致上皮細(xì)胞壞死并引發(fā)炎癥反應(yīng)。HO 等［16］發(fā)現(xiàn)，在Ca+內(nèi)流和基質(zhì)蛋白酶MMP 的協(xié)助下，念珠菌溶素可能通過EREG、EPG 和AREG等配體激活表皮生長因子受體，接著激活下游MAPK 信號傳導(dǎo)，釋放大量粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子，募集中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集，從而引發(fā)局部炎癥反應(yīng)。SWIDERGALL 等［17］研究表明，念珠菌溶素能夠通過MEK1/2 及ERK1/2誘導(dǎo)MAPK 信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致AP-1 轉(zhuǎn)錄因子 c-Jun/c-Fos 激活并上調(diào)中性粒細(xì)胞募集趨化因子CXCL8的分泌，導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞募集至感染部位，引發(fā)過度的炎癥反應(yīng)，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。而被巨噬細(xì)胞吞噬的白色念珠菌也可通過念珠菌溶素促使巨噬細(xì)胞K+外流，激活NLRP3 炎癥小體，介導(dǎo)白細(xì)胞介素1β（IL-1β）大量分泌，進(jìn)而引發(fā)巨噬細(xì)胞腫脹破裂，作為白色念珠菌逃避吞噬的機制之一［18］。

當(dāng)白色念珠菌隨血流播散至腸外時，可能引發(fā)更為嚴(yán)重的疾病。近年來發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌與過敏性哮喘之間存在極為密切的關(guān)聯(lián)。WU 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，念珠菌溶素能夠通過VWF受體GP1bα激活血小板以釋放Wnt 拮抗劑Dkk-1，啟動依賴Th2 和Th17細(xì)胞的抗真菌反應(yīng)，但當(dāng)這種真菌感染不能及時控制時，就會引發(fā)哮喘等嚴(yán)重過敏反應(yīng)。念珠菌屬的大部分菌種都能夠分泌念珠菌溶素，但不同菌種分泌的念珠菌溶素也存在差異。RICHARDSON 等［19］發(fā)現(xiàn)，都柏林念珠菌和熱帶念珠菌分泌的念珠菌溶素也是一種由ECE1 編碼的α-螺旋肽毒素，但引起Ca+內(nèi)流造成上皮損傷的能力比白色念珠菌更強。同時，該研究團隊認(rèn)為可以把念珠菌溶素看作一個新的功能活性肽毒素家族，作為人類致病真菌中第一個溶細(xì)胞肽毒素家族。

3 白色念珠菌通過分泌EVs導(dǎo)致疾病發(fā)生

EVs是由各種組織和細(xì)胞分泌的被脂質(zhì)雙層膜所包裹的膜囊泡總稱，其中包含各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、聚糖、核酸以及mRNA 等生物活性物質(zhì)［20］。美國科學(xué)家ANDERSON 在1990 年首次通過電鏡技術(shù)觀察到白色念珠菌分泌的一種不透明丘疹樣囊泡，并發(fā)現(xiàn)囊泡中的酸性蛋白酶是白細(xì)胞的10 倍以上。但限于當(dāng)時的技術(shù)，無法對囊泡結(jié)構(gòu)、功能和分泌機制展開深入研究。直到2008 年人們發(fā)現(xiàn)白色念珠菌分泌的囊泡與其他子囊菌一樣，都屬于EVs。隨著研究的深入，學(xué)者們逐漸揭示了白色念珠菌EVs 的組成和功能，并且發(fā)現(xiàn)EVs 是白色念珠菌的致病因素之一。

VARGAS 等［21］在兩種白色念珠菌菌株ATCC 90028、ATCC 11 分泌的EVs 中共鑒定出57 種蛋白，分布上，64%的蛋白定位于細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)；功能上，24%的蛋白與致病相關(guān)，23%的蛋白與脂質(zhì)、糖和蛋白質(zhì)等代謝相關(guān)，22%的蛋白與細(xì)胞組織和生物發(fā)生相關(guān)。該研究還通過高效薄層色譜法對EVs的脂質(zhì)成分進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)麥角甾醇、中性鞘糖脂和葡糖神經(jīng)酰胺（G1cCer）為主要成分，而G1cCer 最近被發(fā)現(xiàn)為白色念珠菌的關(guān)鍵毒力因子。GIL-BONA等［22］在白色念珠菌分泌的EVs 中共鑒定出75 種蛋白，其中53%與細(xì)胞壁和跨膜蛋白相關(guān)，如甘露糖蛋白Mp65、黏附樣蛋白Sim1、細(xì)胞壁糖苷酶Sun41、Tos1、Scw11、Xog1 及幾丁質(zhì)酶Cht3，提示EVs 的分泌與菌體細(xì)胞壁的關(guān)系十分密切。內(nèi)吞體運輸必需分選復(fù)合物（ESCRT）是一類與細(xì)胞中膜結(jié)構(gòu)重構(gòu)有關(guān)的重要蛋白復(fù)合物，在膜蛋白降解、信號傳導(dǎo)、病毒出芽、細(xì)胞分裂、膜損傷修復(fù)等諸多重要過程中發(fā)揮作用。而ZARNOWSKI 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，ESCRT 對于真菌EVs從胞內(nèi)到胞外的轉(zhuǎn)運有重要作用。

為了更好地模擬疾病狀態(tài)下宿主—病原體相互作用，KONE?Ná 等［24］在營養(yǎng)有限（缺乏氨基酸）的培養(yǎng)基上種植白色念珠菌（ATCC 90028和一例臨床患者分離出的菌株），檢測到3 種只存在于ATCC 90028 菌株中的毒力相關(guān)蛋白：凝集素樣蛋白3（Als3）、分泌型天冬氨酸蛋白酶8（SAP8）和細(xì)胞表面超氧化物歧化酶銅—鋅6（SOD6），而相較于在營養(yǎng)豐富情況下培養(yǎng)的菌株ATCC 90028，SAP 家族蛋白只在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，這提示營養(yǎng)條件改變會影響真菌EVs 的組成。MARTíNEZLóPEZ 等［25］對比分析了白色念珠菌（ATCC SC5314）菌絲態(tài)與酵母態(tài)EVs 的差異，雖然酵母態(tài)EVs（YEVs）體積普遍大于菌絲態(tài)EVs（HEVs），但HEVs中包含的蛋白遠(yuǎn)多于YEVs，在HEVs 中鑒定出的1 598 種蛋白，其中大部分與細(xì)胞壁組成、蛋白轉(zhuǎn)運和代謝蛋白相關(guān)，這可能是為了更好地黏附免疫細(xì)胞進(jìn)而與之相互作用。并且，研究者還在HEVs 中發(fā)現(xiàn)了一種獨特的20 S 蛋白酶體復(fù)合物，這種復(fù)合物具有高度水解酶的活性，同樣也提示菌絲態(tài)的菌株具有高度侵襲性和致病性。以上研究表明，白色念珠菌在不同環(huán)境中、不同形態(tài)下分泌的EVs，其組成和功能具有高度差異性。

白色念珠菌分泌的EVs 具有免疫原性，能夠引起機體免疫細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞在吞噬EVs后，產(chǎn)生大量一氧化氮、IL-1、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）及IL-10 等炎癥因子。同樣，經(jīng)EVs 處理后的樹突樣細(xì)胞（DC），IL-12、IL-10、TGF-β 及腫瘤壞死因子α 的合成顯著增加，EVs 還可誘導(dǎo)DC 表面CD86 和主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ的上調(diào)［20］。一項研究使用蛋白酶K、核酸酶及核糖核酸酶A 水解馬爾尼菲籃狀菌分泌的EVs，發(fā)現(xiàn)只有蛋白酶K 水解后的EVs與免疫細(xì)胞作用后未能引起上述炎癥因子的釋放［26］。雖然沒有關(guān)于白色念珠菌此方面的研究，但我們可以推測EVs 中包含的大量蛋白質(zhì)是與宿主免疫細(xì)胞作用的主要成分。

此外，HALDER 等［27］發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌亦可利用單核細(xì)胞分泌的EVs 來減輕機體免疫反應(yīng)，從而逃避吞噬。白色念珠菌細(xì)胞壁中β-葡聚糖通過與單核細(xì)胞膜上的補體受體b3（CR3）結(jié)合，誘導(dǎo)單核細(xì)胞TGF-β1轉(zhuǎn)運EVs 的產(chǎn)生，包含TGF-β1的EVs 可結(jié)合其他單核細(xì)胞上的TGF-βRⅡ，增加SMAD2/3磷酸化，上調(diào)SMAD7 及下游NF-κB 抑制劑的表達(dá)，導(dǎo)致促炎因子IL-1β 表達(dá)減少。同時，包含TGF-β1的EVs還可與內(nèi)皮細(xì)胞上的TGF-βRⅡ結(jié)合，上調(diào)包括TGF-β1在內(nèi)的多種抗炎因子，從而進(jìn)一步放大信號，發(fā)揮抗炎作用，減輕免疫反應(yīng)，有利于白色念珠菌的存活及逃逸。該研究團隊在后期實驗中再次發(fā)現(xiàn)白色念珠菌細(xì)胞壁上β-葡聚糖與甘露聚糖可分別結(jié)合單核細(xì)胞上的CR3 及TLR4 受體，進(jìn)而導(dǎo)致單核細(xì)胞分泌包含has-miR-24-3p 的EVs，同時白色念珠菌通過C3b/iC3b與EVs 表面的CR1 結(jié)合，利用EVs 中的has-miR-24-3p 抑制自身細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白SOL1 mRNA翻譯，從而導(dǎo)致白色念珠菌大量生長并絲狀化［28］。由上可見，白色念珠菌不僅可以通過自身分泌包含大量致病蛋白的EVs導(dǎo)致機體嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，還可以誘導(dǎo)一些免疫細(xì)胞分泌有利于自身生長的EVs 從而躲避免疫，增加感染風(fēng)險。

綜上所述，白色念珠菌可通過形成菌絲體、分泌念珠菌溶素及分泌EVs 等多種機制導(dǎo)致疾病發(fā)生。多種信號傳導(dǎo)通路導(dǎo)致菌絲狀態(tài)的白色念珠菌是其與機體內(nèi)細(xì)胞相互作用并分泌念珠菌溶素、細(xì)胞外囊泡等毒力因子的基礎(chǔ)。由此引發(fā)了我們的思考：是否可以通過藥物靶向抑制白色念珠菌菌絲形成轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路，在致病源頭對其進(jìn)行控制；念珠菌溶素作為一種毒素，是否可以研制中和毒素的血清，減輕炎癥反應(yīng)；EVs中包含大量菌體相關(guān)蛋白，是否可以分離出囊泡中的致病蛋白抗原，制備免疫制劑預(yù)防真菌感染。SINGH 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠體內(nèi)接種白色念珠菌細(xì)胞壁蛋白ALS3、HYR1 抗原制劑后再次感染白色念珠菌的病死率顯著降低，雖然此方法應(yīng)用于臨床患者依然還需克服諸多困難，但動物實驗取得的初步成功至少證明了理論的可行性。