不同來(lái)源硒對(duì)山羊血液及睪丸抗氧化酶活性的影響

楊茹潔

（1.山西省畜牧獸醫(yī)學(xué)校，山西太原 030024；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西晉中 030801）

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）是生物體內(nèi)重要的含硒酶，是生物體內(nèi)抗氧化防御體系的重要組成之一，能夠有效的清除體內(nèi)新陳代謝所產(chǎn)生的氧自由基，防止生物大分子發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，維持組織內(nèi)的氧代謝平衡。分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究表明，GSH-Px 活性降低，可以導(dǎo)致組織細(xì)胞抗氧化損傷能力減弱，直接影響細(xì)胞的分裂、繁殖、遺傳及生長(zhǎng)，進(jìn)而干擾核酸、蛋白質(zhì)、粘多糖及酶的合成及代謝，引發(fā)多種疾病[1]。GSH-Px 還能防止精子在生長(zhǎng)過(guò)程中的突變。GSH-Px 也是反映機(jī)體硒水平的重要指標(biāo)。胡彩虹[2]報(bào)道，添加0.01～0.30μmol/L 的不同水平的蛋氨酸硒和納米硒（以硒計(jì)），能顯著提高雞肝細(xì)胞中GSH-Px 的活性。姚元枝等[3]報(bào)道日糧添加硒0.1～0.3mg/kg 時(shí)，能顯著提高全血中GSH-Px 活性。關(guān)于硒對(duì)山羊GSH-Px 的活性影響的報(bào)道甚少。

因此，本試驗(yàn)通過(guò)在羊日糧中添加蛋氨酸硒和納米硒，研究不同來(lái)源硒對(duì)波爾山羊公羔血液及組織器官內(nèi)抗氧化酶活性的影響，以期在實(shí)際生產(chǎn)上為應(yīng)用硒提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

納米硒：上海四通納米科技有限公司，濃度184mg/kg，粒徑20～60nm，平均粒徑36nm。

蛋氨酸硒（美特硒）：浙江建德維豐飼料有限公司饋贈(zèng)，濃度1500mg/kg，分子式：C20H43N4O8S4Se，分子量675。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選用山西太行山腹地貧硒地區(qū)黎城種羊場(chǎng)80 只體重相近、體格健壯的種用2 月齡斷奶的波爾山羊公羔。公羔隨機(jī)分為5 組，每組16只羊。預(yù)試2 周，正試16 周，分別飼喂基礎(chǔ)日糧（對(duì)照組）；基礎(chǔ)日糧+0.1mg/kg 蛋氨酸硒（蛋氨酸硒I 組）；基礎(chǔ)日糧+0.3mg/kg 蛋氨酸硒（蛋氨酸硒II 組）；基礎(chǔ)日糧+0.1mg/kg 納米硒（納米硒I 組）；基礎(chǔ)日糧+0.3mg/kg 納米硒（納米硒II 組），添加量以硒濃度計(jì)算?；A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)羊只進(jìn)行驅(qū)蟲和常規(guī)免疫。各組供試公羔采用舍飼高架飼養(yǎng)，在整個(gè)試驗(yàn)期每日每只公羔定量供給700g 飼料，實(shí)際干物質(zhì)量580g，分別在早7:00 和晚19:00 分兩次等量飼喂，精料在飼喂干草前30min 飼喂，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)日糧配方與主要營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 樣品采集

每個(gè)試驗(yàn)組每隔4 周隨機(jī)選取3 只公羔頸靜脈采血10mL，加肝素鈉抗凝，冷凍于-20℃，另取5mL 血 液37℃水 浴1h，3000r/min 離 心15min，分離血清保存于離心管中，-20℃保存待測(cè)。每個(gè)試驗(yàn)處理每隔4 周隨機(jī)去勢(shì)3 只公羔，取出雙側(cè)睪丸用生理鹽水沖洗3～5 次，去除血漬及脂肪，剝離表面白膜及附睪，迅速將左側(cè)睪丸切塊后置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測(cè)的項(xiàng)目及方法

1.4.1 全血、血清、睪丸組織中GSH-Px 活性的測(cè)定

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，GSH-Px 的測(cè)定測(cè)定原理為：GSH-Px 可以促進(jìn)過(guò)氧化氫與還原型谷胱甘肽反應(yīng)生成H2O 及氧化型谷胱甘肽，GSH-Px的活力可用其酶促反應(yīng)的速度來(lái)表示，測(cè)定其酶促反應(yīng)中還原型谷胱甘肽的消耗，則可求出酶的活力。由于反應(yīng)物在沒(méi)有GSH-Px 的條件下也能進(jìn)行非酶促的氧化還原反應(yīng)，因此在實(shí)驗(yàn)中設(shè)定了非酶管的反應(yīng)，在計(jì)算酶活力時(shí)用來(lái)扣除非酶促反應(yīng)所引起的GSH 減少的部分。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書配制試劑，進(jìn)行酶管與非酶管的酶促反應(yīng)與顯色反應(yīng)，最后用UV-2100 型紫外-可見分光光度計(jì)在412nm 處測(cè)定各管的OD 值。根據(jù)說(shuō)明書提供的方法來(lái)計(jì)算GSH-Px 活力，見式（1）：

1.4.2 血清中超氧化物歧化酶及丙二醛的檢測(cè)

采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的測(cè)定測(cè)定原理為：通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子（O2-），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD 時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算可以求出被測(cè)樣品中的SOD 活力。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書配制試劑并進(jìn)行反應(yīng)，最后用分光光度計(jì)在5nm 處測(cè)定各管的OD 值。根據(jù)說(shuō)明書提供的方法來(lái)計(jì)算SOD 活力，見式（2）：

丙二醛（Malonic aldehyde，MDA）含量的測(cè)定方法為TAB 法，即過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在2nm 處有最大吸收峰。按照試劑盒說(shuō)明書提供的方法進(jìn)行操作，分別設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)管，標(biāo)準(zhǔn)空白和測(cè)定空白管，用分光光度計(jì)在2nm 處測(cè)定各管吸光度值。根據(jù)式（3）計(jì)算MDA 含量：

1.4.3 睪丸組織勻漿液的制備

將待測(cè)的睪丸組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙拭干。準(zhǔn)確稱量后，置于玻璃勻漿管內(nèi)。量取9 倍于組織重的預(yù)冷的生理鹽水，將其2/3 倒入勻漿管內(nèi)，放入搗桿，用電動(dòng)勻漿機(jī)攪拌，使組織完全破碎。將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，用剩余生理鹽水反復(fù)沖洗勻漿管內(nèi)壁和搗桿，沖洗液也倒入離心管內(nèi)，制成10%的睪丸組織勻漿液。將勻漿液以3000r/min 離心10min，取上清液，4℃冷藏備用。以上整個(gè)勻漿操作過(guò)程在4℃下進(jìn)行。取適量10%的睪丸組織勻漿液，按照試劑盒說(shuō)明書的要求，在測(cè)定前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，后根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)勻漿液進(jìn)行不同濃度稀釋后，測(cè)定GSH-Px 的活力。

1.5 主要儀器與設(shè)備

數(shù)顯電熱恒溫水浴箱購(gòu)自于北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司，UV-2100 型分光光度計(jì)購(gòu)自于尤尼卡（上海）儀器有限公司，電動(dòng)勻漿機(jī)購(gòu)自于德國(guó)IKA，低溫冷凍離心機(jī)購(gòu)自于Beckman 公司，Y96000 型電子分析天平購(gòu)自于上海精密儀器公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel XP 進(jìn)行初步處理。SPSS 10.0 進(jìn)行ANOVA 統(tǒng)計(jì)處理，并用Dunnett 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對(duì)波爾山羊公羔全血、血清、睪丸中GSH-Px 活性的影響

由表2 可知，隨著日齡的增長(zhǎng)，羔羊全血中GSH-Px 的活性明顯升高。納米硒II 組GSH-Px活性在不同試驗(yàn)階段均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但相同濃度的不同硒源之間差異不顯著（P＞0.05）。蛋氨酸硒II 組和納米硒II 組在補(bǔ)硒4周后，GSH-Px 的活性迅速上升，在第12 周時(shí)達(dá)到高峰。而蛋氨酸硒I 組和納米硒I 組GSH-Px的活力則是平穩(wěn)上升，在第16 周達(dá)到高峰，高峰值略低于蛋氨酸硒II 組和納米硒II 組。

表2 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對(duì)波爾山羊公羔GSH-Px 活性的影響

納米硒II 組血清GSH-Px 的活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但與蛋氨酸硒II 組差異不顯著（P＞0.05）。日糧添加不同飼料硒源后較對(duì)照組顯著提高了血清GSH-Px 的活性，但相同濃度的不同硒源之間差異不顯著（P＞0.05）。

隨著日齡的增長(zhǎng)，羔羊睪丸中GSH-Px 的活性明顯升高。試驗(yàn)組GSH-Px 的活性在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。日糧添加不同飼料硒源后較對(duì)照組顯著提高了GSH-Px 的活性，但相同濃度的不同硒源之間差異不顯著（P＞0.05）。在試驗(yàn)前期蛋氨酸硒II 組和納米硒II組對(duì)睪丸GSH-Px 的影響效果好于蛋氨酸硒I 組和納米硒I 組，但隨著補(bǔ)硒時(shí)間的延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組GSH-Px 的活性基本一致。

試驗(yàn)組羔羊肝臟中的GSH-Px 的活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），在第16 周時(shí)蛋氨酸硒I 組和納米硒I 組的GSH-Px 活性基本一致，稍高于蛋氨酸硒II 組和納米硒II 組，對(duì)照組GSH-Px 活性最低。

2.2 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對(duì)波爾山羊公 羔血清中SOD 活性、MDA 含量的影響

由表3 可知，隨著日齡的增長(zhǎng)，羔羊血清中SOD 的活性明顯升高。試驗(yàn)組SOD 的活性在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。日糧添加不同飼料硒源后較對(duì)照組顯著提高了SOD 活性（P＜0.05），但相同濃度的不同硒源之間差異不顯著（P＞0.05）。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05）。蛋氨酸硒II 組和納米硒II 組SOD 的活性在第12 周時(shí)達(dá)到高峰，第16周時(shí)不再升高。蛋氨酸硒I 組和納米硒I 組在第12 周時(shí)增幅較大，在第16 周時(shí)稍有增長(zhǎng)。對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)期SOD 活性平穩(wěn)增長(zhǎng)，但增長(zhǎng)速度緩慢。

表3 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對(duì)波爾山羊公羔血清中SOD 活性和MDA 含量的影響

試驗(yàn)組MDA 的含量在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。日糧添加不同飼料硒源后較對(duì)照組顯著降低了MDA 的含量，但相同濃度的不同硒源之間差異不顯著（P＞0.05）。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組血清MDA 含量最高，蛋氨酸硒II 組和納米硒II 組次之，蛋氨酸硒I 組和納米硒I 組最低。

3 討論

3.1 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對(duì)波爾山羊公羔體內(nèi)GSH-Px 活性的影響

自由基是指能獨(dú)立存在的，含一個(gè)或一個(gè)以上不配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)、分子或離子。它是在有氧呼吸過(guò)程中由于O2-的連續(xù)單電子還原而產(chǎn)生的一系列有毒的中間產(chǎn)物。自由基對(duì)機(jī)體健康有著雙重作用：一方面，自由基對(duì)正常生命活動(dòng)的許多重要反應(yīng)必不可少，它參與生物活性物質(zhì)的合成、解毒反應(yīng)以及吞噬細(xì)胞、參與動(dòng)植物胚胎發(fā)育等；另一方面，過(guò)量自由基侵襲構(gòu)成細(xì)胞膜的脂質(zhì)及蛋白質(zhì)，產(chǎn)生各種不安定的自由基，給機(jī)體造成損害，成為各種疾病的病因及增惡因子，對(duì)機(jī)體危害很大。過(guò)量自由基的清除依賴于SOD、GSH-Px 和過(guò)氧化氫酶等的協(xié)同作用才能完成。GSH-Px 是生物體內(nèi)重要的含硒酶，其活性和表達(dá)都受到生物體內(nèi)硒含量與硒狀態(tài)的調(diào)節(jié)，缺硒會(huì)造成GSH-Px 活性降低，導(dǎo)致組織細(xì)胞抗氧化損傷能力減弱。有研究表明，缺硒可以引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子物質(zhì)損傷，影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)攝入硒的劑量為營(yíng)養(yǎng)劑量時(shí)，含硒酶活力隨劑量的增加而增加，而當(dāng)攝入硒劑量為超營(yíng)養(yǎng)劑量時(shí)，含硒酶的活力升高到一定程度后就不再升高，維持在一個(gè)高水平的平臺(tái)上，即含硒酶的活力達(dá)到飽和。

本試驗(yàn)結(jié)果表明不同水平的蛋氨酸硒和納米硒兩種有機(jī)硒化合物都能有效地提高公羔血液、睪丸及肝臟中的GSH-Px 活力，并且其活力隨補(bǔ)硒劑量的增加而增加，表現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間效應(yīng)，即隨著日糧中硒濃度的增加及添加時(shí)間的延長(zhǎng)，GSH-Px 的活力相應(yīng)增加，但硒劑量進(jìn)一步升高并不能增加GSH-Px 活性。不同水平的硒產(chǎn)生的功效不同，在試驗(yàn)前期高水平硒比低水平硒更有效。試驗(yàn)結(jié)果顯示在波爾山羊公羔體內(nèi)，補(bǔ)適量的硒能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)含硒酶的活性。含硒酶的活力隨著日糧中硒劑量的增加而相應(yīng)提高，但相同濃度的蛋氨酸硒和納米硒組之間差異不顯著。

本試驗(yàn)結(jié)果表明不同水平的蛋氨酸硒和納米硒均能顯著提高機(jī)體抗氧化能力，在試驗(yàn)前期蛋氨酸硒優(yōu)于同水平的納米硒。其原因可能是波爾山羊公羔在缺硒的狀態(tài)下，機(jī)體可以很快利用蛋氨酸硒合成谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，當(dāng)機(jī)體的缺硒狀況得到緩解時(shí)，蛋氨酸硒合成谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的速度變慢，而納米硒則表現(xiàn)出穩(wěn)定的增長(zhǎng)效應(yīng)。在第16 周時(shí)，相同濃度的納米硒表現(xiàn)出較蛋氨酸硒稍高的抗氧化能力。

3.2 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對(duì)波爾山羊公羔血清SOD 活性的影響

超氧化物歧化酶對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著重要的作用，該酶能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷，SOD 的含量測(cè)定結(jié)果表明：日糧中添加適量的蛋氨酸硒和納米硒可顯著升高公羔血清SOD 的活性，相同濃度的蛋氨酸硒組和納米硒組差異不顯著。納米硒組公羔血清中SOD 的活性稍高于蛋氨酸硒組。SOD 作為體內(nèi)重要的清除活性氧的金屬酶，其活性的相對(duì)穩(wěn)定對(duì)維持機(jī)體的正常生理功能極為重要。趙先英等[5]用vtiC 阻斷法測(cè)定SOD 活性研究發(fā)現(xiàn)硒濃度由0.09mg/kg 增加到0.4mg/kg 時(shí)，SOD 活性顯著升高，說(shuō)明硒具有抗氧化作用，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.3 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對(duì)波爾山羊公羔血清MDA 含量的影響

機(jī)體的組織細(xì)胞在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生自由基，而細(xì)胞膜含有大量的不飽和脂肪酸，自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生作用生成MDA 等代謝產(chǎn)物。MDA 的量可以反應(yīng)出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接的反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度，MDA 含量測(cè)定結(jié)果表明：不同水平的蛋氨酸硒和納米硒可顯著降低公羔血清MDA 含量，納米硒組公羔血清中MDA 含量稍低于蛋氨酸硒組。說(shuō)明蛋氨酸硒可能產(chǎn)失了更持久的氧化應(yīng)激。

納米硒和蛋氨酸硒相比，在生物利用度，如提高GSH-Px 的活力上具有相同的功效，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。此外，有試驗(yàn)表明納米硒和蛋氨酸硒相比，具有較低的短期毒性和亞慢毒性[3]。納米硒在純粹化學(xué)體系的試驗(yàn)中，在氧化還原能力、清除自由基能力上都表現(xiàn)出尺寸效應(yīng)，即尺寸越小，效率越高[6]。

4 結(jié)論

日糧中添加0.1～0.3mg/kg 的蛋氨酸硒和納米硒均能顯著提高波爾山羊肝臟、血液及睪丸中GSH-Px，提高血清SOD 的活性，降低血清中MDA 的含量，提高了機(jī)體的抗氧化能力，減輕了機(jī)體代謝過(guò)程中自由基所致的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。