基于代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示郫縣豆瓣中兩株優(yōu)勢(shì)產(chǎn)風(fēng)味菌株Bacillus amyloliquefaciens與Candida versatilis互作機(jī)制

劉欣寧,盧云浩,何強(qiáng)*

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院,成都 610065;2.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,成都 610106)

郫縣豆瓣,亦稱為“四川豆瓣醬”,具有鮮辣醇厚、紅棕油亮、黏稠絨實(shí)、醬香濃郁的特點(diǎn)[1-2],是川菜中必不可少的發(fā)酵調(diào)味品,被譽(yù)為“川菜之魂”[3]。近年來,隨著川菜的風(fēng)靡,郫縣豆瓣產(chǎn)業(yè)逐步擴(kuò)大,目前其年產(chǎn)值已近200億元,在我國(guó)調(diào)味醬產(chǎn)業(yè)中占比高達(dá)20%,為促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)發(fā)揮了重要作用[4]。郫縣豆瓣的制備主要包括辣椒發(fā)酵、制曲-蠶豆發(fā)酵和混合后熟發(fā)酵3個(gè)階段[5],并通過獨(dú)特的“翻、曬、露”傳統(tǒng)發(fā)酵工藝,最終形成獨(dú)特的風(fēng)味特征[6]。在此過程中,醬醅中的微生物群落在多相界面發(fā)生復(fù)雜的相互作用[7],從而實(shí)現(xiàn)信息傳遞、能量代謝、物質(zhì)降解和分子轉(zhuǎn)化等,為郫縣豆瓣的風(fēng)味形成作出了巨大貢獻(xiàn)。

微生物間存在多種相互作用關(guān)系,包括互利共生、偏利共生、偏害共生、競(jìng)爭(zhēng)等[8]。例如,在傳統(tǒng)酸面團(tuán)發(fā)酵中,Lactobacillussanfranciscensis和Kazachstaniaexigua可以相互協(xié)作利用麥芽糖,穩(wěn)定微生物菌群,進(jìn)而影響面團(tuán)的品質(zhì)[9]。在黃酒釀造過程中,Saccharomycescerevisiae的胞外代謝產(chǎn)物乙醇和有機(jī)酸會(huì)抑制Aspergillusflavus的生長(zhǎng),而添加A.flavus可促進(jìn)S.cerevisiae的增殖,顯著提高其產(chǎn)酯能力[10-11]。此外,濃香型白酒窖泥中Clostridiumfermenticellae生成的甲酸可被Novisyntrophococcusfermenticellae通過Wood-Ljungdahl途徑利用,促進(jìn)后者分泌乙酸,乙酸可進(jìn)一步被C.fermenticellae通過逆β-氧化途徑利用,從而積累丁酸和己酸[12]。前期研究表明[13-14],Bacillusamyloliquefaciens和Candidaversatilis是郫縣豆瓣內(nèi)源性優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和酵母菌,能夠高產(chǎn)呈醬香和果香的揮發(fā)性風(fēng)味化合物,且在不同接種條件下,產(chǎn)品的風(fēng)味具有顯著差異,表明兩株菌的互作可引起一系列代謝物的變化,但其互作機(jī)制仍需進(jìn)一步揭示。

本文分析了體系中代謝物的變化及相關(guān)基因的差異表達(dá),代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)可揭示生物體調(diào)控機(jī)制,是生物學(xué)研究中的重要技術(shù)手段。因此,本文以B.amyloliquefaciens和C.versatilis為研究對(duì)象,基于非靶向代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),探究?jī)芍昃诠才囵B(yǎng)條件下代謝物和基因水平的變化,以揭示兩株菌的互作機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

B.amyloliquefaciensMK063714、C.versatilisMK063708:分離自郫縣豆瓣;甲醇、甲酸、醋酸銨(均為色譜純)、Trizol RNA提取試劑盒、Ribo-Zero試劑盒:美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;其他試劑(均為分析純):成都市科隆化學(xué)品有限公司。

LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;1736R高速冷凍離心機(jī) 丹麥LaboGene公司;VanquishTMUHPLC色譜儀、Q ExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備

添加50 g蠶豆粉、200 mL蒸餾水于500 mL錐形瓶中,混合均勻后滅菌,作為培養(yǎng)基備用。以活化后的B.amyloliquefaciens和C.versatilis制備4種發(fā)酵液:對(duì)照組(不接菌),單獨(dú)接種B.amyloliquefaciens(BA組),單獨(dú)接種C.versatilis(CV組),同時(shí)接種B.amyloliquefaciens和C.versatilis(CO組);菌株接種量均為2×107CFU/g。將培養(yǎng)基于30 ℃、150 r/min培養(yǎng)1 d后,加入30 g氯化鈉,快速混勻后置于相同條件下培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)完成后,在4 ℃下以5 000 r/min離心10 min,分別收集上清液及沉積物,然后用液氮速凍后于-80 ℃保存并盡快用于后續(xù)分析。上清液用于代謝產(chǎn)物測(cè)定,沉積物用于RNA提取。

1.2.2 非靶向代謝組學(xué)分析

100 μL液體樣本利用400 μL甲醇沉淀蛋白后,加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液,渦旋振蕩后冰浴靜置5 min,然后以15 000 r/min、4 ℃離心10 min,取一定量的上清液,加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇含量為53%,并置于離心管中15 000 g、4 ℃離心10 min,收集上清液,利用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析[15]。以含0.1%甲酸的53%甲醇水溶液作為空白樣品。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

RNA的提取參照Trizol說明書,并采用RNeasy Mini Kit試劑盒進(jìn)行純化。去除rRNA后,利用TruSeq?Stranded mRNA Library Prep Kit進(jìn)行文庫構(gòu)建,并基于Illumina HiSeqTM2500平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序。文庫構(gòu)建及RNA-seq測(cè)序由北京諾禾致源生物科技有限公司完成。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

代謝組學(xué)中,所有結(jié)果均呈現(xiàn)為剔除空白和對(duì)照組樣品后的數(shù)據(jù),將同時(shí)滿足以下條件的物質(zhì)確定為差異表達(dá)代謝物:變化倍數(shù)(fold change,FC)≥2為上調(diào),FC≤0.5為下調(diào);P<0.05;VIP(variable important in project)≥1.0[16]。RNA-seq測(cè)序中,通過DEGSeq 1.18.0軟件對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異分析,差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2(fold change)|>1,且校正后的P<0.001。將差異表達(dá)基因映射到Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫以分析其功能和途徑[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 非靶向代謝組學(xué)分析

樣品BA組和CO組共有193種代謝物具有顯著差異,而樣品CV組和CO組的顯著差異代謝物則有297種,這些物質(zhì)均集中在脂類和類脂分子、有機(jī)酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、苯環(huán)型化合物等(見圖1)?？梢园l(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)對(duì)酵母菌的影響強(qiáng)于對(duì)細(xì)菌的影響,這可能與B.amyloliquefaciens產(chǎn)蛋白酶等酶系的能力優(yōu)于C.versatilis有關(guān)[18-19],表明該芽孢桿菌可為C.versatilis代謝形成風(fēng)味物質(zhì)提供前體物。

圖1 差異代謝物富集氣泡圖Fig.1 Bubble chart of differential metabolite enrichment

主要差異代謝物見表1。

表1 主要差異代謝物比較Table 1 Comparison of main differential metabolites

樣品CO組較樣品BA組顯著上調(diào)的代謝物有二十二碳四烯酸、油酸、棕櫚酸甲酯和麝香酮,上調(diào)倍數(shù)均高于100倍;此外,香芹酮、可的松、十五烷酸、對(duì)羥苯基乙醇等物質(zhì)含量也增加了20倍以上。這些物質(zhì)主要為脂類化合物,表明C.versatilis可顯著加速脂類的降解,這與C.versatilis分泌酯酶的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于B.amyloliquefaciens的研究結(jié)果一致[20-21],并且在郫縣豆瓣實(shí)物接種發(fā)酵模型中得到驗(yàn)證:相較于單獨(dú)接種芽孢桿菌,同時(shí)接種上述兩株微生物的樣品中含有更高濃度的長(zhǎng)鏈脂肪酸、脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯類化合物[22-23]。

而相較于樣品CV組,CO組中顯著上調(diào)的化合物具有相似的結(jié)果,主要集中在脂類和類脂分子,如油酸、棕櫚酸甲酯、二十二碳四烯酸、可的松等化合物均上調(diào)30倍以上,這表明B.amyloliquefaciens和C.versatilis在這些化合物的形成中具有加和或協(xié)同效應(yīng)。另外,許多多肽及氨基酸含量也上調(diào)了20倍以上,如Pro-Leu、Gly-Tyr-Ala、Gly-Tyr、羥脯氨酸、肌肽、L-酵母氨酸、O-乙酰絲氨酸、組氨酸等,但相較于樣品BA組,所有鑒定到的二肽化合物均在CO組中顯著下調(diào)。結(jié)果表明B.amyloliquefaciens較C.versatilis更利于形成與蛋白質(zhì)相關(guān)的代謝物(B.amyloliquefaciens產(chǎn)蛋白酶和氨肽酶能力更強(qiáng)[24]),且后者可能會(huì)降低芽孢桿菌產(chǎn)相關(guān)酶系的能力。此外,C.versatilis較B.amyloliquefaciens可能更易形成氨基酸衍生物,該結(jié)論可以從樣品CO組下調(diào)的氨基酸類物質(zhì)中獲得。相較于樣品CV組,CO組中下調(diào)的氨基酸類物質(zhì)主要為其衍生物,例如苯乙酰甘氨酸、甲硫氨酸硫氧化物、L-焦谷氨酸。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.2.1 基因表達(dá)差異對(duì)比分析

由于C.versatilis沒有模式參考菌株,無法有效地進(jìn)行基因表達(dá)量的比較,本節(jié)重點(diǎn)基于B.amyloliquefaciens的基因表達(dá)變化來剖析兩株菌的互作機(jī)制,差異表達(dá)基因火山圖和熱力圖見圖2,B.amyloliquefaciens在樣品BA組和CO組之間共有1 606個(gè)顯著差異表達(dá)基因,其中上調(diào)表達(dá)基因有801個(gè),下調(diào)表達(dá)基因有805個(gè)。

圖2 差異表達(dá)基因火山圖(A)和熱力圖(B)Fig.2 Volcano plot (A) and heatmap (B) of differentially expressed genes

2.2.2 差異基因GO富集分析

GO富集分析結(jié)果見圖3,共發(fā)酵體系(CO組)中,B.amyloliquefaciens顯著性表達(dá)的基因集中在生物過程和分子功能類別,上調(diào)表達(dá)以生物過程顯著性更高,如核苷單磷酸合成及代謝、ATP代謝、嘌呤核苷單磷酸代謝等10個(gè)過程,且各類別差異基因的表達(dá)數(shù)量也很高(均>20個(gè));而下調(diào)表達(dá)以分子功能類別更顯著,且除作用于tRNA的催化活性外,其他類別基因下調(diào)數(shù)量均高于60個(gè)。

圖3 B. amyloliquefaciens差異表達(dá)基因的GO富集分析散點(diǎn)圖Fig.3 Scattering plot of differentially expressed genes in B. amyloliquefaciens by GO enrichment analysis

在下調(diào)表達(dá)基因中,與有機(jī)環(huán)狀化合物代謝、雜環(huán)代謝和細(xì)胞芳香族化合物代謝過程相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)量均超過100個(gè),含硫化合物與吡咯化合物代謝也有相關(guān)基因下調(diào)表達(dá),這說明相較于樣品BA組,樣品CO組與上述代謝相關(guān)的化合物的生成量會(huì)更低,該結(jié)果與前文基于代謝組學(xué)的研究結(jié)果一致,樣品CO組中有機(jī)雜環(huán)化合物和苯環(huán)型化合物等化合物的下調(diào)數(shù)量及比例均更高,該結(jié)果也與Lu等[22]的研究結(jié)果相匹配,B.amyloliquefaciens與C.versatilis混合發(fā)酵時(shí),郫縣豆瓣樣品中多數(shù)吡嗪、呋喃(酮)等雜環(huán)化合物以及含硫化合物含量均比單獨(dú)接種B.amyloliquefaciens發(fā)酵的樣品更低。不過,兩種不同接種方式的樣品在上述化合物中的含量差異較小,這與下調(diào)表達(dá)基因的顯著性并不高(1.2<-log10(PAdj)<1.6)有關(guān)。

2.2.3 差異基因KEGG富集分析

對(duì)樣品BA組和CO組中差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析,其中20條富集通路見圖4。

圖4 B. amyloliquefaciens差異表達(dá)基因的KEGG富集散點(diǎn)圖Fig.4 Scattering plot of differentially expressed genes in B. amyloliquefaciens by KEGG enrichment

B.amyloliquefaciens在樣品CO組上調(diào)表達(dá)的基因中,注釋到KEGG最顯著的通路為糖酵解/糖異生途徑(-log10(PAdj)≈2.5),其次為磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、氧化磷酸化和微生物代謝(-log10(PAdj)≈1.5),而包括碳代謝、脂肪酸降解、丙酮酸代謝在內(nèi)的其他途徑顯著性相對(duì)較低(-log10(PAdj)<1.0)。而基因表達(dá)量方面,以微生物代謝活動(dòng)相關(guān)的基因上調(diào)數(shù)量最高(59個(gè)),其次為碳代謝(34個(gè))、糖酵解/糖異生(21個(gè))。

下調(diào)表達(dá)基因中,最顯著的通路包括葉酸合成和硫中繼系統(tǒng)途徑(-log10(PAdj)>2.0),其次為RNA降解、多種氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)的生物合成及硫氨酸代謝等(-log10(PAdj)>1.0)。而基因表達(dá)量方面,以ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的數(shù)量最多,為27個(gè),其次為群體感應(yīng)(17個(gè))、葉酸合成(15個(gè))和鞭毛裝配(14個(gè))等。

混合培養(yǎng)中B.amyloliquefaciensKEGG代謝途徑分析見表2。

表2 混合培養(yǎng)中B. amyloliquefaciens KEGG代謝途徑分析Table 2 Analysis of KEGG metabolic pathways of B. amyloliquefaciens in co-culture system

KEGG糖酵解/糖異生代謝途徑中,除醇脫氫酶(EC1.1.1.1)外,其他幾乎所有監(jiān)測(cè)到的基因均在共發(fā)酵體系(CO組)中上調(diào)表達(dá),這有助于乙醇的積累,進(jìn)而合成更多的酯類化合物。另外,共培養(yǎng)體系下,除長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶A連接酶(EC6.2.1.3)外,與脂肪酸合成代謝途徑相關(guān)的基因均在B.amyloliquefaciens中下調(diào)表達(dá);而除醇脫氫酶和酰基轉(zhuǎn)移酶(EC1.1.1.1,EC2.3.1.9)外,其他與脂肪酸降解代謝途徑相關(guān)的基因均上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果均與Lu等[22]的研究結(jié)果相似,B.amyloliquefaciens與C.versatilis共發(fā)酵的郫縣豆瓣樣品中醇類、酯類化合物含量顯著高于單獨(dú)接種B.amyloliquefaciens的樣品,而脂肪酸類化合物的含量整體上更低。

從丁酸鹽代謝通路來看,與乙偶姻前體物丙酸鹽形成的相關(guān)基因(EC1.1.1.83)在共培養(yǎng)體系中下調(diào)最顯著,而與其直接相關(guān)的基因(EC1.1.1.4,EC4.1.1.5,EC1.1.1.303)上調(diào)表達(dá)相對(duì)較弱,這可能是單獨(dú)接種B.amyloliquefaciens的郫縣豆瓣樣品中乙偶姻的含量高于混合接種發(fā)酵樣品的原因。另外,混合發(fā)酵體系下含硫化合物(3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙醇)的含量均低于單獨(dú)接種B.amyloliquefaciens發(fā)酵的樣品[22,25],這也與B.amyloliquefaciens中與蛋氨酸和半胱氨酸代謝相關(guān)的基因(EC2.5.1.47,EC4.4.1.2)在共培養(yǎng)體系中顯著下調(diào)表達(dá)一致。

代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明,B.amyloliquefaciens與C.versatilis共培養(yǎng)時(shí),可引起B(yǎng).amyloliquefaciens中大量基因表達(dá)的變化,其中,基因上調(diào)表達(dá)的顯著性高于下調(diào)表達(dá)基因。顯著上調(diào)的代謝途徑主要包括糖酵解/糖異生、脂肪酸降解等,而與脂肪酸合成、氨基酸相關(guān)的代謝通路顯著減弱,表明C.versatilis對(duì)B.amyloliquefaciens的生長(zhǎng)和代謝具有雙向作用,進(jìn)而引起一系列代謝產(chǎn)物的差異。

3 結(jié)論

本文基于非靶向代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),探究了B.amyloliquefaciens與C.versatilis的互作機(jī)制。共培養(yǎng)時(shí),C.versatilis對(duì)B.amyloliquefaciens的生長(zhǎng)和代謝具有雙向作用,且B.amyloliquefaciens基因上調(diào)表達(dá)的顯著性高于下調(diào)表達(dá)基因。其中,與糖酵解/糖異生、脂肪酸降解等途徑相關(guān)基因表達(dá)顯著增強(qiáng),而與脂肪酸合成、氨基酸相關(guān)的基因表達(dá)顯著減弱,進(jìn)而引起代謝產(chǎn)物的變化,兩株菌共培養(yǎng)可使B.amyloliquefaciens上調(diào)表達(dá)脂類和類脂分子,下調(diào)表達(dá)有機(jī)酸及其衍生物類;可使C.versatilis上調(diào)表達(dá)脂肪酸或類脂化合物、多肽或氨基酸類代謝產(chǎn)物,下調(diào)表達(dá)氨基酸衍生物、苯環(huán)型化合物、苯丙素和聚酮類化合物。