二維液相色譜在食品檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)展

邢倩倩

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436;2.食品營(yíng)養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 無(wú)錫 214122)

隨著食品工業(yè)的發(fā)展,對(duì)現(xiàn)代分析技術(shù)提出了更高要求,需表征盡可能多的食品組成成分和使檢測(cè)的微量食品組分達(dá)到更高的靈敏度,進(jìn)而了解食品物質(zhì)組成基礎(chǔ)[1]。近些年伴隨著分析化學(xué)的進(jìn)展,易操作的先進(jìn)儀器逐步出現(xiàn),傳統(tǒng)食品分析方法正在逐步被功能強(qiáng)大的分析技術(shù)所取代,如多維色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)在食品分析方面的廣泛應(yīng)用[2]。二維液相色譜在揭示食品復(fù)雜基質(zhì)組成、提供高分離能力和未知調(diào)味化合物識(shí)別方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[3]。

1 二維液相色譜簡(jiǎn)介

1.1 原理

二維分離的理念由Giddings[4]提出,通過(guò)將兩個(gè)獨(dú)立的色譜分離過(guò)程組合到一起實(shí)現(xiàn),在該分離過(guò)程中樣品經(jīng)過(guò)兩次不同機(jī)理的分離過(guò)程,因此分離能力遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)一維分離。傳統(tǒng)的一維色譜在分離復(fù)雜樣品過(guò)程中會(huì)發(fā)生峰交叉、共流出和分離度不足等現(xiàn)象,說(shuō)明一維色譜存在峰容量不足的問(wèn)題。二維液相色譜對(duì)復(fù)雜樣品的分辨率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)一維液相色譜,該分辨能力即峰容量。峰容量是指色譜體系中用最小分離度分得的最多峰個(gè)數(shù)的理論值[5]。二維液相色譜的理論峰容量為兩種分離模式峰容量的乘積。因此,建立二維液相色譜應(yīng)盡量選擇兩種不同的分離模式,保證正交性最大,即充分利用兩種分離模式的峰容量[6]。

在實(shí)際應(yīng)用中,二維液相色譜可通過(guò)組分由第一維到第二維的轉(zhuǎn)移方式分為離線(xiàn)、在線(xiàn)或流速停止模式[7]。在離線(xiàn)二維液相色譜模式中,首先手動(dòng)接出一維分離后的各個(gè)組分,處理后直接進(jìn)入第二維分離模式。在線(xiàn)二維液相色譜模式中,第一維和第二維通過(guò)接口或是調(diào)諧器連接,可自動(dòng)收集一維組分直接進(jìn)入第二維進(jìn)行分析[8—10]。流速停止二維液相色譜模式中,第一維流速停止開(kāi)始第二維分離過(guò)程,第二維完成后再重啟第一維分離模式,完成后再依次開(kāi)啟第二維分離模式。

1.2 分類(lèi)

二維液相色譜包括中心切割二維色譜和全二維液相色譜。中心切割模式可應(yīng)用于對(duì)第一維色譜中某個(gè)特定組分進(jìn)行第二維分離的過(guò)程,全二維模式應(yīng)用于對(duì)于第一維色譜中所有組分進(jìn)行第二維分離的過(guò)程。在全二維分離模式中,必須保證第一維的組分無(wú)損傷地全部進(jìn)入第二維,即需要保證第一維的樣品收集率比較高。

1.3 特點(diǎn)

二維液相色譜系統(tǒng)在分離能力方面遠(yuǎn)強(qiáng)于傳統(tǒng)一維色譜,這也是其成功應(yīng)用于食品分析的最大優(yōu)點(diǎn)[11]。另外,二維液相色譜系統(tǒng)也可與質(zhì)譜串聯(lián)使用,提高分離效率和識(shí)別能力[12]。基于二維液相色譜具有諸多優(yōu)點(diǎn),近些年在食品方面應(yīng)用愈加廣泛。本文針對(duì)近些年二維液相色譜在食品分析方面的應(yīng)用展開(kāi)討論。

2 二維液相色譜在食品溯源和安全方面的應(yīng)用

食品中的風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)和危害物質(zhì)可由多種因素引入。食品污染物一方面來(lái)源于農(nóng)藥、殺蟲(chóng)劑、環(huán)境污染物、抗生素以及為應(yīng)對(duì)食品需求增長(zhǎng)而使用的藥物等,另一方面則由食品攜帶或本身產(chǎn)生,如病原微生物污染、加工過(guò)程中生成的毒素和風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)等,以上所列物質(zhì)均對(duì)健康有害。因此,為了規(guī)范這些有害化合物的存在,需嚴(yán)格控制食品生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)存過(guò)程中相關(guān)物質(zhì)的允許限量。

在食品風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)檢測(cè)方面,傳統(tǒng)分析技術(shù)所面臨的挑戰(zhàn)包括食品樣品中所含化合物種類(lèi)多而復(fù)雜,目標(biāo)化合物含量范圍過(guò)寬以及基質(zhì)自帶的未知潛在毒性物質(zhì)等。因此,在傳統(tǒng)的食品分離分析中,需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜費(fèi)時(shí)的前處理過(guò)程才能完成目標(biāo)化合物的檢測(cè)。在檢測(cè)食品中風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)方面,能夠克服傳統(tǒng)分析缺點(diǎn)的分析技術(shù)是重要的發(fā)展方向[13]。傳統(tǒng)分析方法在分析食品污染物時(shí)由于樣品前處理導(dǎo)致目標(biāo)化合物丟失或轉(zhuǎn)移從而降低準(zhǔn)確性,食品安全分析中使用二維液相色譜方法可經(jīng)過(guò)較少或不經(jīng)過(guò)前處理步驟分析檢測(cè)識(shí)別目標(biāo)化合物,從而避免該類(lèi)失誤。

2.1 二維液相色譜在食品溯源方面的應(yīng)用

Ianni等[14]采用中心切割二維液相色譜法,該二維系統(tǒng)采用反相色譜柱串聯(lián)手性色譜柱組成,用于評(píng)估來(lái)自?xún)深^具有不同“加州乳腺炎測(cè)試”評(píng)分的奶牛的牛奶樣品中丹磺?；被釋?duì)映體含量的變化,結(jié)果顯示隨著乳腺炎發(fā)展程度加重,丹磺?；被岷克街饾u降低,該結(jié)果可建立數(shù)學(xué)模型以用于早期乳腺炎的診斷。Alvim-Jr等[15]建立在線(xiàn)反相手性二維色譜系統(tǒng)串聯(lián)三重四級(jí)桿檢測(cè)器完成人乳中的氟西汀和諾氟西汀的含量檢測(cè),該研究結(jié)合RAM-BSA C18色譜柱與ChirobioticTMV2色譜柱,提供了一種具有高靈敏度、無(wú)基質(zhì)效應(yīng)、分析時(shí)間僅為25 min、幾乎無(wú)需樣品制備且溶劑用量較少(每次運(yùn)行 10 mL)的方法,該方法成功應(yīng)用于分析母乳樣品,可用于藥代動(dòng)力學(xué)研究和常規(guī)藥物監(jiān)測(cè)。與Alvim-Jr同一課題組的Lopes等[16]將Alvim-Jr所建立的方法拓展至初乳樣品中,并按照歐洲藥品管理局指南完成方法驗(yàn)證。

指紋圖譜技術(shù)可用于分離、識(shí)別和比較復(fù)雜樣品的相關(guān)成分,二維液相指紋色譜可通過(guò)提供二維圖像來(lái)實(shí)現(xiàn)相關(guān)功能。全二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜可用于完成復(fù)雜樣品非靶向指紋識(shí)別,以獲得樣品化合物信息的完整圖譜。全二維指紋圖譜對(duì)分析方法的分離參數(shù)要求較高,需在保證不丟失信息的情況下最大化實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品基質(zhì)分離,同時(shí)要應(yīng)對(duì)由于缺乏能夠直接處理二維液相色譜提供的復(fù)雜原始數(shù)據(jù)的軟件而導(dǎo)致的數(shù)據(jù)處理挑戰(zhàn)。使用二維液相色譜方法來(lái)評(píng)估受保護(hù)的原產(chǎn)地名稱(chēng)(protected designation of origin,PDO)的真實(shí)性便是二維液相指紋圖譜技術(shù)一種代表性應(yīng)用。PDO是一項(xiàng)歐洲質(zhì)量認(rèn)證,由歐盟農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)認(rèn)證機(jī)構(gòu)頒發(fā),授予具有良好固定品質(zhì)(包括地理來(lái)源、加工和感官特性)的食品,該認(rèn)證旨在保護(hù)成員國(guó)優(yōu)質(zhì)食品和農(nóng)產(chǎn)品。來(lái)自卡拉布里亞(意大利)的甘草是具有高感官品質(zhì)和豐富生物活性的化合物,已被認(rèn)證為PDO產(chǎn)品。Montero等[17]開(kāi)發(fā)親水反相二維液相色譜方法,用于分析來(lái)自不同國(guó)家(意大利、中國(guó)、伊朗和阿塞拜疆)的甘草次級(jí)代謝產(chǎn)物,并與卡拉布里亞(意大利)的甘草次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)比,ZIC-HILIC固定相用作第一維色譜柱,選擇C18用作第二維色譜柱,該結(jié)果成功鑒定出可作為分析甘草地理來(lái)源評(píng)估的潛在標(biāo)記物。

Zhang等[18]建立親水反相二維液相色譜串聯(lián)離子淌度四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜完成43種紅參和37種白參指紋圖譜的建立和對(duì)比。該工作分析流程:第一步,確定24種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的碰撞截面值;第二步,使用人參皂苷數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)檢測(cè)到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,結(jié)構(gòu)鑒定所需關(guān)鍵參數(shù)為峰檢測(cè)時(shí)間、強(qiáng)度閾值、質(zhì)量準(zhǔn)確度、碰撞截面值、耐受性和保留時(shí)間;第三步,使用Progenesis QI 2.1軟件處理原始數(shù)據(jù)完成標(biāo)志物檢測(cè);第四步,對(duì)檢測(cè)到的離子進(jìn)行光譜解卷積和歸一化,獲得包含保留時(shí)間、m/z 和歸一化峰面積的數(shù)據(jù)矩陣;第五步,使用Ezinfo 3.0軟件對(duì)所得矩陣進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析,化學(xué)計(jì)量學(xué)分析包括應(yīng)用無(wú)監(jiān)督主成分分析和監(jiān)督正交偏最小二乘判別分析。該研究成功檢測(cè)出用于區(qū)分紅參和白參品種的9種人參皂苷,實(shí)現(xiàn)不同人參品種的溯源。

2.2 二維液相色譜在食品安全方面的應(yīng)用

2.2.1 化學(xué)性危害

多環(huán)芳烴是食品中廣泛存在的化學(xué)污染物之一,其在食品中的含量與食品來(lái)源有關(guān),主要通過(guò)烹飪過(guò)程、工業(yè)食品加工或環(huán)境污染產(chǎn)生。多環(huán)芳烴具有毒性、致癌和致突變作用,其在食品中的存在易對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生不利影響。由于多環(huán)芳烴的結(jié)構(gòu)多樣導(dǎo)致其異構(gòu)體數(shù)量多,因此分析該類(lèi)化合物非常困難,二維液相色譜的強(qiáng)大分離能力可解決該問(wèn)題。Nestola等[19]建立中心切割二維液相色譜串聯(lián)氣質(zhì)聯(lián)用色譜法分析多種食物基質(zhì)中的多環(huán)芳烴,該系統(tǒng)中第一維色譜柱選擇硅膠柱用于去除甘油三酯并保留多環(huán)芳烴和不飽和物成分,自動(dòng)進(jìn)入第二維去除不飽和物并完成多環(huán)芳烴分離,第二維組分進(jìn)入氣質(zhì)聯(lián)用儀完成定量分析檢測(cè)。該研究提出了一種結(jié)合不同色譜分離策略分析多環(huán)芳烴的有效方法,成功用于檢測(cè)橄欖油、葵花籽油、雞蛋、番茄醬或蛋黃醬等樣品中的多環(huán)芳烴含量。

食品中常見(jiàn)的化學(xué)性危害物還包括除草劑和抗生素等。Donato等[20]建立二維液相色譜法用于檢測(cè)紅酒中除草劑,在一維中使用氰基色譜柱,在二維中使用C18色譜柱。此外,為了增加兩種分離機(jī)制之間的正交性,在第二維中使用了60 s的移動(dòng)梯度。該工作除了檢測(cè)紅酒的酚類(lèi)成分外,還檢測(cè)到了痕量的除草劑滅草隆。通常認(rèn)為在線(xiàn)二維液相色譜的局限性之一是靈敏度低,主要是由于分析物在二維色譜中受到流動(dòng)相兩次稀釋;該成果中檢測(cè)限(LOD)為1 mg/L,表明對(duì)葡萄酒中所含化合物的分離和定量具有非常高的選擇性和靈敏度。Wang等[21]建立親水反相二維色譜系統(tǒng)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)乳制品中七大類(lèi)20種抗生素殘留,該方法可一次性完成乳中多種抗生素殘留檢測(cè),成功應(yīng)用于5種乳粉、5種液態(tài)奶和5種生奶的抗生素含量測(cè)定。

2.2.2 生物性危害

真菌毒素是由曲霉屬、青霉菌屬和鐮刀菌屬等幾種絲狀真菌產(chǎn)生的一組低分子量的有毒次生代謝產(chǎn)物,該類(lèi)化合物攝入后可在動(dòng)物和人類(lèi)中引起多種疾病。Campone等[22]成功開(kāi)發(fā)中心切割二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定啤酒中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,伏馬毒素B1、B2和赭曲霉毒素A的含量分析。該方法運(yùn)行時(shí)間為37 min。選擇兩種啤酒對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證,可滿(mǎn)足食品中霉菌毒素測(cè)定方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(EC Decision 657/2002和Regulation(EC) No.401/2006)。與一維技術(shù)相比,該二維方法檢測(cè)過(guò)程中干擾物顯著減少,基質(zhì)效應(yīng)也大大減少。

食品溯源和安全是食品研究方向的一項(xiàng)重要議題,以上所述案例對(duì)于食品溯源和安全研究具有借鑒意義。

3 二維液相色譜在食品質(zhì)量和添加劑方面的應(yīng)用

3.1 二維液相色譜在食品質(zhì)量方面的應(yīng)用

食品質(zhì)量是食品的重要標(biāo)志性參數(shù),控制食品質(zhì)量才能保證其感官性質(zhì)。調(diào)味品作為食品工業(yè)的一個(gè)重要方面,色譜技術(shù)已應(yīng)用在調(diào)味品的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)表征方面[23-25]。二維液相色譜作為適合評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的技術(shù),在該方面應(yīng)用已較多。Pickrahn等[26]建立液相色譜和固相萃取制備結(jié)合方法(HPLC-SPE-HPLC)用于表征兩種調(diào)味品大料提取物中的味覺(jué)成分,樣品首先在第一維色譜中分離出16個(gè)組分,進(jìn)而通過(guò)SPE完成溶劑替換,然后進(jìn)入第二維色譜完成分離;該分離系統(tǒng)制備出的256個(gè)組分使用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜完成表征,表明該調(diào)味品的甜味主要由反式茴香腦提供,苦味由反式偽異丁香酚-2-甲基丁酸酯提供。

3.2 二維液相色譜在食品添加劑方面的應(yīng)用

在食品工業(yè)界,不法商家會(huì)通過(guò)添加被禁止的成分來(lái)偽裝成更高質(zhì)量的產(chǎn)品,或是添加限量物質(zhì)增強(qiáng)風(fēng)味,色譜已應(yīng)用于不同食品中添加劑的限量檢測(cè)[27—28]。Hou等[29]開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)便快速的停流速中心切割二維液相色譜方法,第一維使用C4色譜柱,第二維使用C18色譜柱,用于同時(shí)定量酸奶中的5種添加劑,包括阿斯巴甜、苯甲酸、那他霉素、糖精鈉和山梨酸,該方法總分析時(shí)間為30 min,樣品加標(biāo)回收率在94.5%～103.9%之間。Hou等[30]建立中心切割二維液相色譜法分析牛奶和奶粉中的5種主要蛋白質(zhì)(α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白、α-乳球蛋白、β-乳球蛋白)和7種添加劑(麥芽糖醇、乙基麥芽糖醇、香蘭素、乙基香蘭素、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉),該方法中第一維色譜能夠?qū)⑻砑觿┖偷鞍踪|(zhì)分成兩組,呈現(xiàn)較高極性的添加劑從C4柱中快速洗脫并截留在捕集柱中以在第二維C18色譜柱中進(jìn)一步分析,而蛋白質(zhì)主要保留在第一維色譜柱中分析。添加單糖,如果糖、半乳糖或葡萄糖也是一種增強(qiáng)奶粉風(fēng)味的摻假方法,Ma等[31]開(kāi)發(fā)了一種二維液相色譜方法評(píng)估分析各種品牌和不同種類(lèi)奶粉中單糖的存在,該方法使用無(wú)需樣品前處理的中心切割二維液相色譜方法,研究對(duì)象包括全脂、脫脂和嬰兒配方奶粉以及豆奶粉,該方法檢測(cè)出部分奶粉樣品中含有葡萄糖。

食品質(zhì)量和添加劑對(duì)食品工業(yè)行業(yè)發(fā)展尤為重要,以上所述策略對(duì)于食品質(zhì)量和真?zhèn)窝芯烤哂薪梃b意義。

4 二維液相色譜在食品營(yíng)養(yǎng)和健康方面的應(yīng)用

由于食品是非常復(fù)雜的基質(zhì),因此它們的分離和表征非常困難。二維液相色譜可有效解決復(fù)雜基質(zhì)分離分析過(guò)程中所遇到的挑戰(zhàn)[32]。眾所周知,食物的營(yíng)養(yǎng)成分含量與其生物活性之間具有量化關(guān)系。現(xiàn)在食品科學(xué)領(lǐng)域的大部分研究涉及食品營(yíng)養(yǎng)或食品健康?；诙S液相色譜在分離分析方面的優(yōu)點(diǎn),其在食品營(yíng)養(yǎng)與食品健康方面應(yīng)用前景廣闊[33—34]。二維液相色譜適合表征和鑒定食品基質(zhì)中存在的營(yíng)養(yǎng)成分,這些化合物通常是微量成分[35—37]。采用非靶向分析對(duì)包含目標(biāo)組分的基質(zhì)進(jìn)行全組分分析是理想的解決復(fù)雜基質(zhì)中微量組分分離分析的手段[38]。

4.1 二維液相色譜在食品營(yíng)養(yǎng)方面的應(yīng)用

酚類(lèi)化合物是水果飲品中的代表性營(yíng)養(yǎng)調(diào)味物質(zhì),該類(lèi)物質(zhì)的色譜表征已較成熟[39]。Aly等[40]選擇綠色環(huán)保溶劑替代部分傳統(tǒng)溶劑建立在線(xiàn)全二維液相色譜分析鑒別葡萄汁和葡萄酒中的酚類(lèi)化合物,這項(xiàng)研究首次嘗試用綠色二維液相色譜,試圖在不影響分離能力的情況下更環(huán)保地實(shí)現(xiàn)該類(lèi)物質(zhì)的分離分析。Brazdauskas等[41]采用綜合二維液相色譜完成黑莓果渣中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的化學(xué)表征,可分離出61種不同成分,可初步鑒定不同花青素、原花青素、黃酮類(lèi)化合物和酚酸等營(yíng)養(yǎng)調(diào)味物質(zhì)。Montero等[42]建立親水反相串聯(lián)紫外質(zhì)譜二維方法用于分析多個(gè)品種葡萄藤中的(多)酚類(lèi)營(yíng)養(yǎng)調(diào)味物質(zhì),首次在葡萄藤中檢測(cè)出高度聚合的二苯乙烯類(lèi)化合物,該方法顯示出高峰容量(842)和良好的正交性(78%)。

二維液相色譜方法已廣泛用于食品功能活性物質(zhì)的制備,用于此目的的二維液相色譜配置通常是離線(xiàn)制備型二維液相色譜,該系統(tǒng)能夠從第一維手動(dòng)收集相對(duì)較大量的餾分,這些餾分可以適當(dāng)濃縮并重新溶解,以便在第二維中進(jìn)行分析。Fan等[43]建立制備型二維液相色譜方法用于分離甘草中黃酮類(lèi)化合物,本成果中離線(xiàn)二維液相色譜成功用于純化甘草中的低濃度物質(zhì),在16.8 h內(nèi)純化24種純度高于90%的黃酮類(lèi)化合物,表明離線(xiàn)二維制備色譜可用于分離活性營(yíng)養(yǎng)成分用于活性研究。Zenezini等[44]建立二維液相色譜用于從驢奶中純化肽,并對(duì)其進(jìn)行表征,首先通過(guò)反相一維純化具有抗氧化和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的驢奶肽,然后在第二維親水色譜分離中進(jìn)一步分析,通過(guò)篩選分離的肽的生物活性,其中兩個(gè)顯示出抗氧化活性,另外兩個(gè)顯示出血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制作用。

4.2 二維液相色譜在食品健康方面的應(yīng)用

二維液相色譜方法也可用于在線(xiàn)篩選化合物生物活性,通常第一維中使用細(xì)胞膜色譜,色譜柱中填充研究生物活性的特定受體,第二維則是分離目標(biāo)化合物。細(xì)胞膜色譜由細(xì)胞膜固定相組成,該固定相是將含有目標(biāo)化合物特定受體的細(xì)胞膜固定在活性二氧化硅上制備所得。Cao等[45]采用該方法成功從3種藥食兩用物質(zhì)中篩選出5種抗炎成分。

食品研究中,不僅食品成分重要,其相關(guān)的生物活性也很重要。以上所述策略對(duì)于食品營(yíng)養(yǎng)和健康研究具有借鑒意義。

5 展望

綜上所述,二維液相色譜是食品領(lǐng)域研究的一個(gè)非常有價(jià)值的工具。二維液相色譜方法在提高分辨率、獲得化合物結(jié)構(gòu)信息、易與質(zhì)譜聯(lián)用以及縮短樣品制備時(shí)間方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

盡管二維液相色譜在食品方面的應(yīng)用已經(jīng)比較廣泛,但仍有較大的提升空間。接口技術(shù)、耐用性、定量、化學(xué)計(jì)量學(xué)、數(shù)據(jù)處理等的發(fā)展有助于提高二維液相色譜在食品分析方面的應(yīng)用價(jià)值。未來(lái),二維液相色譜將在食品調(diào)味營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表征、食品質(zhì)量和食品安全等方面發(fā)揮巨大作用。