骨質(zhì)疏松癥中鐵死亡的分子機(jī)制

王 鵬，徐朱杰，王振廷，崔 浩，劉 儀

南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院骨科，江蘇 無(wú)錫 214000

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨病，中國(guó)50歲及以上的男性和女性骨質(zhì)疏松癥的患病率分別為6.46%及29.13%［1］。年齡的增長(zhǎng)及機(jī)體生理性衰退會(huì)引起骨生成與骨破壞平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致骨代謝失衡［2］。鐵死亡由脂質(zhì)過(guò)氧化物和活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的積累直接介導(dǎo)［3］，許多研究發(fā)現(xiàn)糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化及骨質(zhì)疏松等疾病都與鐵死亡有關(guān)［4-5］，鐵死亡有可能是診治相關(guān)疾病新的研究方向。

1 鐵死亡的特征

鐵是天然生物中具有氧化還原活性的微量元素，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)及機(jī)體代謝［6］。鐵積累促進(jìn)ROS 以及脂質(zhì)相關(guān)自由基的產(chǎn)生增加，最終引發(fā)鐵死亡［7］。鐵死亡是一種新型細(xì)胞死亡模式，不同于細(xì)胞凋亡、壞死及自噬等［8］。在用鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin處理的人表皮成纖維細(xì)胞中觀察到線粒體數(shù)量減少，膜密度增加，線粒體嵴的正常結(jié)構(gòu)被破壞，這些形態(tài)學(xué)特征有助于區(qū)分鐵死亡與其他細(xì)胞死亡模式［9］。在生物學(xué)特性方面表現(xiàn)為胱氨酸攝取減少、谷胱甘肽（glutathione，GSH）消耗、胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（cystine/glutamate antiporter，又稱System Xc-）活性降低以及鐵離子和ROS 異常積聚［10］。

2 鐵死亡在骨細(xì)胞中的作用機(jī)制

鐵死亡的發(fā)生涉及鐵的代謝異常及ROS 和脂質(zhì)過(guò)氧化物的異常堆積，還受多種信號(hào)通路的調(diào)控，目前已有的研究主要通過(guò)以下關(guān)鍵通路展開(kāi)（圖1）。

圖1 骨質(zhì)疏松癥中鐵死亡的發(fā)生機(jī)制Figure 1 The mechanisms of ferroptosis in osteoporosis

2.1 鐵代謝紊亂

鐵是生命活動(dòng)必需的微量元素之一，維持人體的各種生理功能。細(xì)胞鐵主要以Fe2+或Fe3+形式儲(chǔ)存于細(xì)胞中，F(xiàn)e2+能與蛋白質(zhì)結(jié)合，參與各種生理反應(yīng)，而Fe3+是人體鐵運(yùn)輸?shù)闹饕问剑?1］。全身鐵調(diào)節(jié)主要通過(guò)鐵調(diào)素（hepcidin）和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin）之間的相互作用調(diào)控，包括細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白（ferritin）、二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）和轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）等［12］。在體內(nèi)，細(xì)胞外的Fe3+經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)，再被還原酶前列腺六跨膜上皮抗原3（six transmembrane epithelial antigen of prostate 3，STEAP3）進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為Fe2+并儲(chǔ)存起來(lái)。鐵蛋白還可與核受體輔激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）結(jié)合釋放出游離鐵，大量的鐵離子通過(guò)芬頓反應(yīng)（Fenton reaction）促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，最終引發(fā)鐵死亡。

鐵代謝在骨骼穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，鐵代謝異常引起的鐵超負(fù)荷是鐵死亡的主要特征之一［13］。鐵超負(fù)荷降低了細(xì)胞活力以及超氧化物歧化酶和GSH 水平，增加了脂質(zhì)過(guò)氧化物、鐵死亡相關(guān)蛋白以及ROS的生成，并誘導(dǎo)線粒體的微觀結(jié)構(gòu)變化［14］。成骨細(xì)胞中DMT1 的過(guò)表達(dá)可引起鐵超負(fù)荷，增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞的成骨功能下降。鐵超負(fù)荷會(huì)降低小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1）活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明鐵超負(fù)荷可能在一定程度上抑制成骨細(xì)胞增殖并促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡［15］。鐵超負(fù)荷還可促進(jìn)核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的產(chǎn)生增加，從而提高骨細(xì)胞中RANKL/骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）的比例，最終增強(qiáng)破骨細(xì)胞的分化和破骨功能，誘導(dǎo)骨細(xì)胞凋亡［16］。因此，鐵代謝在骨細(xì)胞鐵死亡過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)鐵代謝相關(guān)信號(hào)通路可以有效去除鐵代謝紊亂產(chǎn)生的ROS，可能成為未來(lái)骨質(zhì)疏松藥物開(kāi)發(fā)的重要基礎(chǔ)。

2.2 脂質(zhì)過(guò)氧化物累積

脂質(zhì)代謝異常會(huì)引起鐵死亡，生物膜成分磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）可以誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化（lipid peroxidation，LPO）。PUFA在雙烯丙基位具有較弱的C-H 鍵，因此容易氧化［17］。游離的PUFA 是LPO 的重要底物，可酯化為磷脂雙層并導(dǎo)致過(guò)度氧化，引發(fā)鐵死亡［18］。溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）和?；o酶A 合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）通過(guò)將PUFA 摻入細(xì)胞磷脂尤其是PE 中生成PUFA-PE，并進(jìn)一步被脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）氧化成脂質(zhì)過(guò)氧化物，在鐵死亡中起著關(guān)鍵作用［19］。通過(guò)減少LPCAT3及ACSL4的產(chǎn)生可以降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成，從而抑制鐵死亡。

LPO 與許多疾病相關(guān)，例如心血管疾病、腫瘤、骨質(zhì)疏松等［20］。脂質(zhì)過(guò)氧化物的異常堆積會(huì)激活并影響細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的信號(hào)通路［21］。研究表明通過(guò)激活METTL3/ASK1-p38（methyltransferaselike 3/apoptosis signal-regulating kinase 1-p38）信號(hào)通路可以誘導(dǎo)糖尿病性骨質(zhì)疏松癥（diabetic osteoporosis，DOP）中的成骨細(xì)胞鐵死亡［22］。此外，轉(zhuǎn)錄因子核因子-E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是抗氧化反應(yīng)的核心元素，CoCrMo-納米顆粒（CoNP）通過(guò)顯著下調(diào)Nrf2 的表達(dá)也可促進(jìn)成骨細(xì)胞鐵死亡［23］。因此，脂質(zhì)過(guò)氧化物的累積在骨細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生中起著重要作用。

2.3 p53介導(dǎo)的鐵死亡

p53 是一種腫瘤抑制基因，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和組織修復(fù)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)［24］。許多研究表明，p53 也與鐵死亡密切相關(guān)。System Xc-輕鏈SLC7A11（solute carrier family 7 member 11）可能是p53基因的新靶點(diǎn)，p53能夠通過(guò)拮抗SLC7A11的產(chǎn)生來(lái)減少System Xc-對(duì)胱氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而降低谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的活性，增加細(xì)胞ROS 及脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡［25］。在單獨(dú)用ROS處理的細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)胞死亡，然而，當(dāng)用p53誘導(dǎo)與ROS結(jié)合處理細(xì)胞時(shí)會(huì)有超過(guò)90%的細(xì)胞死亡。當(dāng)再用鐵死亡抑制劑鐵生長(zhǎng)素-1（Fer-1）處理細(xì)胞后，細(xì)胞死亡率降低至40%，表明p53可誘導(dǎo)鐵死亡［26］。

2.4 System Xc-/GSH/GPX4抗氧化系統(tǒng)的破壞

System Xc-是一種廣泛分布在磷脂雙分子層中的抗轉(zhuǎn)運(yùn)體，由輕鏈SLC7A11和重鏈SLC3A2（solute carrier family 3 member 2）兩個(gè)亞基組成，它是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)不可或缺的一部分［27］。它可以將細(xì)胞外胱氨酸運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)作為半胱氨酸的生產(chǎn)原料，然后進(jìn)一步合成GSH［28］。GSH主要由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸組成，其中含量最少的半胱氨酸限制了GSH 的合成速度［29］。GSH 作為GPX4 的輔助因子，能夠降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的毒性，保護(hù)生物膜系統(tǒng)免受鐵死亡的損傷。GPX4 是一種中樞調(diào)節(jié)因子，也是人體抗氧化系統(tǒng)的重要成分，GSH在GPX4的作用下與氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSH）處于動(dòng)態(tài)平衡。

鐵死亡受多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，尤其是System Xc-/GSH/GPX4信號(hào)通路，通過(guò)阻斷下調(diào)System Xc-/GSH/GPX4抗氧化系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡［30］。激活轉(zhuǎn)錄因子3（activating transcription factor 3，ATF3）是一種編碼可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的基因，它可以通過(guò)抑制System Xc-活性來(lái)介導(dǎo)高糖環(huán)境中的成骨細(xì)胞鐵死亡，從而誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥［31］。He 等［32］建立了鐵過(guò)載小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Biochanin A（BCA）可以通過(guò)抑制TfR1 和促進(jìn)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin）直接降低細(xì)胞內(nèi)鐵濃度，還可以通過(guò)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2來(lái)調(diào)控System Xc-/GPX4的表達(dá)，進(jìn)而減少軟骨細(xì)胞鐵死亡。因此，System Xc-/GSH/GPX4抗氧化系統(tǒng)在骨細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生發(fā)展中起著核心作用。

3 鐵死亡與骨質(zhì)疏松

正常的骨骼通過(guò)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收處于不斷重塑的狀態(tài)。各種原因?qū)е碌墓巧蓽p少或骨吸收增加均會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注鐵死亡與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系［33-34］。

3.1 鐵死亡與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要是因?yàn)榻^經(jīng)后婦女雌激素水平降低，雌激素對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用減弱，引起破骨細(xì)胞數(shù)量增加、凋亡減少，最終導(dǎo)致骨吸收功能增加。鐵死亡相關(guān)基因可用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的早期診斷和個(gè)體化治療［35］。Wu等［36］構(gòu)建了敲除全身鐵調(diào)素基因的雙側(cè)卵巢切除小鼠模型和腹腔注射鐵劑的小鼠模型，從中發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）在鐵蓄積的骨質(zhì)疏松癥中起關(guān)鍵作用，鐵蓄積通過(guò)影響骨細(xì)胞的mTOR/STAT1/Cxcl9 通路減少骨細(xì)胞再生，導(dǎo)致骨量減少。鐵超負(fù)荷會(huì)降低MC3T3-E1 細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明鐵超負(fù)荷可能在一定程度上抑制成骨細(xì)胞增殖并促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。青蒿素是一種有機(jī)化合物，可以通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡來(lái)抑制鐵攝取刺激的破骨細(xì)胞分化，起到抗骨質(zhì)疏松的作用，可能成為治療鐵超負(fù)荷引起的骨質(zhì)疏松癥的潛在藥物［37］。鐵超負(fù)荷會(huì)引起骨組織的鈣含量和股骨骨密度明顯下降，破骨細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)受損。此外，在鐵超負(fù)荷大鼠的骨組織中還觀察到RANKL表達(dá)增加以及OPG表達(dá)降低，這表明骨吸收增加可能是通過(guò)ROS介導(dǎo)的RANK/RANKL/OPG 途徑引起［38］。RANKL是鐵死亡調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵靶點(diǎn)，有可能為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的理論依據(jù)。

3.2 鐵死亡與激素性骨質(zhì)疏松癥

大量使用糖皮質(zhì)激素會(huì)引起骨質(zhì)疏松癥，從而引起人體骨量及骨形成的減少。內(nèi)皮細(xì)胞分泌外泌體（endothelial cells secrete exosome，EC-Exos）是細(xì)胞間相互聯(lián)系的必要介質(zhì)，是機(jī)體生命活動(dòng)的重要組成部分。EC-Exos通過(guò)抑制鐵死亡對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥具有保護(hù)作用，為激素性骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新的替代方法［39］。有研究者采用大劑量糖皮質(zhì)激素建立小鼠激素性骨質(zhì)疏松癥模型，從中發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞微囊泡（endothelial progenitor cell-extracellular vesicle，EPC-EV）不僅可以在一定程度上增加骨小梁的數(shù)量和骨密度，減少股骨頭壞死組織的形成，而且能夠逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素引起的幾種氧化損傷標(biāo)志物的改變，如丙二醛（malondialdehyde，MDA）和GSH等。此外，EPC-EV 還可以通過(guò)減少成骨細(xì)胞的鐵死亡防止激素性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，這也為激素性骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新的方法［40］。Miao 等［41］對(duì)斑馬魚(yú)幼體進(jìn)行地塞米松暴露實(shí)驗(yàn)。48 h接觸地塞米松的斑馬魚(yú)幼體出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。轉(zhuǎn)錄組分析、生化參數(shù)和基因表達(dá)譜揭示了鐵死亡可能在地塞米松引起的斑馬魚(yú)幼體毒性效應(yīng)中起作用。與上述研究結(jié)果相似，在一項(xiàng)關(guān)于激素性骨質(zhì)疏松癥的研究中發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的鐵死亡與激素性骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)，褪黑素（melatonin，MT）通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路顯著緩解糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鐵死亡，從而減少激素性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。因此，MT 可能成為預(yù)防和治療激素性骨質(zhì)疏松癥的新型藥物［42］。

3.3 鐵死亡與DOP

DOP是糖尿病患者骨骼方面的主要并發(fā)癥，其主要的致病因素是骨細(xì)胞活力喪失。鐵死亡是DOP 中骨細(xì)胞死亡的重要機(jī)制。糖尿病的微環(huán)境會(huì)引起LPO、鐵過(guò)載及鐵死亡途徑的異常激活，從而增加骨細(xì)胞的鐵死亡。血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）對(duì)DOP 中的骨細(xì)胞鐵死亡至關(guān)重要，其啟動(dòng)子活性由上游Nrf2 和c-JUN 轉(zhuǎn)錄因子的相互作用控制。靶向鐵死亡或HO-1 通過(guò)破壞LPO和HO-1 激活之間的惡性循環(huán)，有效減少DOP 中的骨細(xì)胞死亡，防止DOP 的發(fā)生［43］。Ge 等［44］測(cè)定了骨質(zhì)疏松患者和健康個(gè)體的骨密度（bone mineral density，BMD）、血清晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end product，AGE）和空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者的血清AGE 水平比健康個(gè)體更高。血清AGE 顯著促進(jìn)了細(xì)胞凋亡和鐵死亡，通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡來(lái)破壞成骨細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致DOP的發(fā)生。高葡萄糖水平可通過(guò)增加DOP 中的ROS/LPO/GSH 消耗來(lái)誘導(dǎo)鐵死亡［45］。此外，MT 不僅可以有效預(yù)防卵巢切除大鼠的骨質(zhì)疏松癥，促進(jìn)骨形成，防止圍絕經(jīng)期婦女的骨質(zhì)流失，還與DOP 中自噬細(xì)胞的鐵死亡有關(guān)，通過(guò)影響Nrf2/HO-1 信號(hào)通路增加對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力，從而增強(qiáng)成骨細(xì)胞的成骨能力。有研究者在高葡萄糖中培養(yǎng)細(xì)胞并敲低了其ATF3 水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制ATF3 的功能增加了GPX4 水平并減少了ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，從而抑制了成骨細(xì)胞的鐵死亡并改善了其成骨功能［31］。此外，高葡萄糖可通過(guò)誘導(dǎo)ATF3 上調(diào)，導(dǎo)致SLC7A11 表達(dá)降低，從而引起細(xì)胞內(nèi)GSH 和細(xì)胞外谷氨酸水平降低，最終導(dǎo)致DOP 的發(fā)生。維生素K2 是一種脂溶性維生素，臨床上用于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥和改善凝血。在腹腔注射鏈脲佐菌素溶液和高脂肪高糖飲食建立的小鼠DOP 模型中發(fā)現(xiàn)，維生素K2 通過(guò)激活A(yù)MPK/SIRT1 信號(hào)通路來(lái)抑制鐵死亡，從而減少DOP的發(fā)生［46］。與上述方法相似，另一項(xiàng)研究通過(guò)高糖高脂肪喂養(yǎng)建立了糖尿病大鼠模型，結(jié)果表明高糖高脂肪誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞鐵死亡可能與METTL3/ASK1-p38信號(hào)通路導(dǎo)致DOP有關(guān)。因此，抑制成骨細(xì)胞鐵死亡可能為DOP提供潛在的治療策略［22］。

4 總結(jié)與展望

鐵死亡是一種鐵依賴性細(xì)胞死亡過(guò)程，與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文綜述了鐵死亡在骨質(zhì)疏松癥中的分子機(jī)制及其相關(guān)研究進(jìn)展。闡明鐵死亡在骨質(zhì)疏松癥中的分子機(jī)制可以為骨代謝提供實(shí)質(zhì)性的見(jiàn)解，從而找出療效更佳的方法來(lái)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。目前關(guān)于鐵死亡在骨質(zhì)疏松癥中的相關(guān)機(jī)制及信號(hào)通路尚不完全清楚，科研人員需要進(jìn)行更深層次的探索，以期找到更多新型有效的診療骨質(zhì)疏松癥的方法。關(guān)于骨相關(guān)細(xì)胞鐵死亡信號(hào)通路的干擾措施，如DNA修復(fù)蛋白及類黃酮等的研究，可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的重要靶點(diǎn)。此外，鐵死亡還與其他肌肉骨骼疾病有密切聯(lián)系，深入了解鐵死亡在其他肌肉骨骼疾病中的發(fā)病機(jī)制將有助于相關(guān)疾病的精準(zhǔn)治療。