SMARCA4突變的非小細胞肺癌患者臨床特征及相關(guān)生物信息分析

陳雪松，陳 玲，何夢鈺

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029

肺癌是最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。WHO統(tǒng)計2022年我國新增肺癌人數(shù)約87萬，因肺癌死亡人數(shù)約50萬，肺癌仍是威脅國民健康的重要疾?。?］。根據(jù)病理類型，肺癌分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC 占85%，主要包括肺腺癌及肺鱗癌。近年來，NSCLC 的診斷策略及治療手段不斷發(fā)展，但患者5年生存率仍不盡人意。NSCLC的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多基因共同參與的過程，因而探究其中的分子機制、尋找關(guān)鍵基因，對NSCLC 診療具有重要價值。

SWI/SNF（Switch/sucrose nonfermentable）染色質(zhì)重塑復(fù)合體是ATP 依賴性染色體重塑復(fù)合物五大亞家族的成員之一，參與染色質(zhì)修復(fù)、調(diào)控細胞增殖分化過程。SMARCA4（SWI/SNF related，matrix associated，actin dependent regulator of chromatin，subfamily A member 4）編碼BRG1（brahma-related gene-1）蛋白，催化ATP 水解，是為整個SWI/SNF 復(fù)合物提供能量的核心基團［2］。由此可見，SMARCA4對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的基因調(diào)控起重要作用，然而目前SMARCA4基因與NSCLC的相關(guān)研究仍不深入。本研究分析了含SMARCA4基因突變NSCLC患者的臨床特征及預(yù)后，同時采用生物信息學(xué)方法探究SMARCA4基因在NSCLC中的差異表達、突變、與預(yù)后相關(guān)情況及潛在的生物學(xué)功能，為NSCLC診斷及治療提供新思路。

十月，秋意正濃。下過一場綿綿細雨，那山、那水、那樹更是秋味十足。這不，校園里的霧也迎來了它最濃的時光。它像一名神奇的魔術(shù)師，一會兒將遠處那座山頭變得無影無蹤；一會兒將美麗的校園裝點得撲朔迷離。秋日校園的協(xié)奏曲就這樣開始了……

文體學(xué)為研究文體特征提供了具體的分析方法，它往往聚焦于文體的語言形式和使用技巧，繼而探討語言的藝術(shù)特色。從文體學(xué)視角分析英語詩歌稱得上是一種創(chuàng)新的研究方法，它把語言學(xué)的發(fā)展成果和詩歌鑒賞緊密地聯(lián)系在一起，不僅可以彰顯詩歌的語言魅力，而且有利于揭示詩歌的主題意義。對英語詩歌的文體特征進行研究可以促進讀者提高英語詩歌的欣賞水平，亦能幫助讀者進行詩歌創(chuàng)作。

1 對象和方法

1.1 對象

回顧性分析2020 年1 月—2022 年12 月于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診且符合條件的35 例患者臨床資料。納入經(jīng)組織病理或細胞病理確診為NSCLC［根據(jù)WHO（2021 版）肺腫瘤組織學(xué)分型［3］］且經(jīng)二代測序（next generation sequencing，NGS）方法檢測有SMARCA4基因突變的患者。本研究獲得南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（2023-SR-318）。

1.2 方法

運用TIMER數(shù)據(jù)庫（http：//timer.cistrome.org）獲取SMARCA4在不同腫瘤中的相對表達水平；TIMER數(shù)據(jù)庫、GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn）分析SMARCA4 在肺腺癌組織與正常組織、肺鱗癌組織與正常組織間的表達差異。

本研究共納入35 例經(jīng)NGS 確診為SMARCA4基因突變的NSCLC 患者，記錄其性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)類型、SMARCA4突變類型、突變位點、共突變基因等指標。對35例患者進行電話或門診隨訪，統(tǒng)計患者生存時間?？偵嫫冢╫verall survival，OS）指診斷NSCLC開始直至由于任何原因死亡的時間。

本研究納入35例SMARCA4基因突變患者，1年生存率80%（圖1A）。其中伴隨EGFR 基因突變患者1 年生存率100%，EGFR 野生型患者1 年生存率71.4%，生存分析提示EGFR野生型與突變型患者預(yù)后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016，圖1B）。伴隨TP53基因突變患者1 年生存率72.7%，OS（14.2±2.0）個月，TP53 野生型患者1 年生存率87.5%，OS（28.3±1.6）個月，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.067，圖1C）。伴隨KRAS 基因突變患者1 年生存率25.0%，OS（11.0±2.9）個月，KRAS 野生型患者1 年生存率87.1%，OS（27.9±1.6）個月，生存分析提示KRAS 野生型與突變型患者預(yù)后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003，圖1D）。

1.2.1 患者資料收集

脂肪俗稱油，油每天攝入量比較好算，但比較難控制。幾乎全世界所有國家都建議油每天的攝入量不超過每人每天營養(yǎng)攝入總量的30%，最好能控制在25%左右。按30%來算，如果一個人每天攝入能量為1800千卡，那么這個人每日油的攝入量就不應(yīng)該超過60克。這60克油不是每日的烹調(diào)用油，是包括我們食物里所有的油，比如雞蛋、牛奶、肉、堅果和糕點等所含的油。

通過cBioPortal 數(shù)據(jù)庫（https：//www.cbioportal.org）的“cancer types summary”模塊分析SMARCA4基因在所有TCGA NSCLC的突變類型和拷貝數(shù)改變（copy number alteration，CNV）信息，并進一步分析肺腺癌及肺鱗癌中的遺傳突變信息。同時，在數(shù)據(jù)庫“comparison”模塊進行SMARCA4 突變型及野生型肺腺癌及肺鱗癌患者的生存分析。

1.2.3 遺傳突變分析

1.2.4 蛋白相互作用分析

運用STRING 數(shù)據(jù)庫（Version：11.5）探索與SMARCA4 潛在相互作用的蛋白并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建條件為置信度大于0.7。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

要確保課程教學(xué)質(zhì)量，關(guān)鍵在于有切合實際的教學(xué)措施及可操作的規(guī)范.課程質(zhì)量標準作為課程教學(xué)的指導(dǎo)性文件，從課程的教學(xué)文件、教學(xué)運行、教學(xué)考核三個方面對機械設(shè)計課程教學(xué)加以規(guī)范，提出具體的教學(xué)建議，見表3.

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本研究共納入35 例SMARCA4 突變的NSCLC患者（表1），其中男23 例，女12 例，年齡（64.26 ±1.70）歲（39～78 歲），有吸煙史患者18 例，否認吸煙史患者17例。35例患者NSCLC組織學(xué)類型為腺癌27 例（77.1%），鱗癌4 例（11.4%），其他類型4 例（11.4%）；Ⅰ～ⅢA 期8 例（22.9%），ⅢB～ⅣB 期27 例（77.1%）。

2.2 基因分析

在TCGA 數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上應(yīng)用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫分析SMARCA4基因突變情況，8%的NSCLC患者攜帶SMARCA4基因突變，其中10.3%的肺腺癌患者攜帶SMARCA4基因突變，5.37%的肺鱗癌患者攜帶SMARCA4基因突變，突變類型包括錯義突變、剪接突變、截短突變等（圖3A、B）。進一步分析SMARCA4 基因突變對NSCLC 患者預(yù)后的影響，提示含SMARCA4突變的肺腺癌患者OS及無進展生存時間（progression-free survival，PFS）較野生型患者更短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.035，P=0.007，圖3C、D）；在肺鱗癌中，SMARCA4突變型及野生型患者OS率及PFS率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.693，P=0.677，圖3E、F）。

2.3 預(yù)后生存分析

1.2.2 差異表達分析

進一步對ⅢB～ⅣB 期SMARCA4 基因突變NSCLC 患者進行亞組分析，發(fā)現(xiàn)伴隨EGFR 基因突變患者1年生存率仍為100%，EGFR野生型患者1年生存率56.2%，EGFR野生型與突變型患者預(yù)后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012，圖1E）。伴隨KRAS基因突變患者1 年內(nèi)生存率0%，OS（7.8±0.7）個月，KRAS野生型患者1年生存率87.5%，OS（24.9±1.8）個月，合并KRAS突變患者預(yù)后較野生型差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001，圖1F）。伴隨TP53基因突變與TP53野生型患者的OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.227，圖1G）。

運用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準誤（）表示。生存分析采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法進行生存時間的比較。SMARCA4 基因差異表達采用非參數(shù)Mann-Whitney 檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 SMARCA4基因在NSCLC中的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用TIMER數(shù)據(jù)庫分析SMARCA4基因差異性表達發(fā)現(xiàn)，肺腺癌及肺鱗癌組織中SMARCA4 基因表達水平相比正常肺組織均明顯上調(diào)（P＜0.001，圖2A）。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫進一步驗證，提示肺鱗癌組織中SMARCA4基因表達水平顯著高于癌旁正常肺組織（P＜0.05，圖2B）；肺腺癌組織中SMARCA4基因表達水平同樣高于癌旁正常肺組織（P＜0.05，圖2C）。

圖2 SMARCA4基因在NSCLC中的表達情況Figure 2 Expression of SMARCA4 gene in NSCLC

在35 例含SMARCA4 基因突變NSCLC 患者中進行基因表達譜分析（表1），伴隨EGFR 基因突變14例（40.0%）；伴隨TP53基因突變11例（31.4%）；伴隨KRAS基因突變4例（11.4%）；伴隨ERBB2基因突變4例（11.4%）；伴隨STK11基因突變3例（8.6%）；伴隨CDKN2A基因突變3例（8.6%）；伴隨ALK 基因突變2例（5.7%），其余共突變基因包括c-MET、ARID1A、PTEN、FGFR 等（表1）。SMARCA4 基因突變類型包括非同義突變16 例（45.71%），移碼突變11 例（31.43%）、非移碼突變5例（14.29%）、終止密碼子突變2例（5.71%）、剪接突變1例（2.86%）。

圖3 SMARCA4基因在NSCLC中的突變分析Figure 3 Mutational analysis of SMARCA4 gene in NSCLC

采用STRING數(shù)據(jù)庫分析與SMARCA4相互作用的蛋白，包括ARID1A、ARID1B、ARID2、CTNNB1、SMARCB1、SMARCC1、SMARCC2、SMARCD3、SMARCE1、TERT 等（P＜0.001，圖4A）。進一步分析SMARCA4 參與的生物學(xué)過程，包括細胞間連接蛋白組裝、染色質(zhì)重塑等（圖4B）。

圖4 SMARCA4蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（A）及SMARCA4蛋白相關(guān)生物學(xué)功能（B）Figure 4 Protein-protein interaction networks of SMARCA4（A）and SMARCA4-related biological function（B）

3 討論

SMARCA4 是構(gòu)成SWI/SNF 染色質(zhì)重塑復(fù)合體的重要亞單位，其組成結(jié)構(gòu)域包括1個ATP酶基團、保守的C 端溴基團、AT-hook 基序和N 端的QLQ、HSA、BRK 結(jié)構(gòu)域。ATP 酶基團高度保守參與水解ATP 提供能量；溴區(qū)結(jié)構(gòu)域參與組蛋白H3 和H4 羧基端乙酰化的賴氨酸的識別過程［4］。研究報道SMARCA4 基因突變與膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、胃癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。SMARCA4 基因在NSCLC中的突變發(fā)生率為6%～8%，好發(fā)于男性吸煙者，平均年齡65 歲，病理類型以肺腺癌為主，且其純合缺失、融合或截短突變與蛋白缺失及更高的腫瘤突變負荷緊密聯(lián)系［6-7］。本研究納入35例經(jīng)NGS檢測含SMARCA4 突變的NSCLC 患者，男性占65.7%，年齡（64.26±1.70）歲，其中腺癌77.1%，鱗癌11.4%，其他病理類型11.4%，與既往研究結(jié)果基本一致。目前關(guān)于SMARCA4基因突變及伴隨基因的相關(guān)報道仍較少。Schoenfeld 等［8］運用NGS 方法檢測407 例含SMARCA4 突變的NSCLC 患者，其中56%合并TP53突變，41%合并KEAP1 突變，39%合并STK11 突變，36%合并KRAS 突變。蔣杰等［9］報道66 例有SWI/SNF 復(fù)合體亞基突變的NSCLC 患者，發(fā)現(xiàn)EGFR、KRAS、ALK 為最常見的伴隨突變基因。本研究發(fā)現(xiàn)EGFR、TP53、KRAS為常見的伴隨突變基因，其中以EGFR頻率最高，此結(jié)果與既往研究不完全相同。首先，可能是Schoenfeld等［8］研究對象為西方人群，與我國人種存在差異。歐美人群的肺癌基因突變研究顯示TP53、KRAS、KEAP1和STK11基因為最常見的突變驅(qū)動基因；亞洲人群中EGFR 突變?yōu)樽钪饕尿?qū)動基因，占比為50%～60%［10］。其次，本研究及國內(nèi)研究納入的SMARCA4 突變患者例數(shù)較少，后續(xù)需要多中心多樣本的深入分析。

如表1所示，模型組和丁酸鈉組腸黏膜血流量顯著低于對照組（P＜0.05、0.01），丁酸鈉組腸黏膜血流量顯著高于模型組（P＜0.05）；模型組和丁酸鈉組腸黏膜葡聚糖水平顯著高于對照組（P＜0.05），丁酸鈉組腸黏膜葡聚糖水平顯著低于模型組（P＜0.05）。

光波導(dǎo)諧振腔的自由譜寬FSR(Free SpectrumRange)指的是兩個相鄰諧振譜的間隔。從相位域上來看相鄰諧振譜的間隔等于2π,說明光在光波導(dǎo)諧振腔中的諧振是周期性的,周期為2π。相位域上為2π的自由譜寬對應(yīng)到頻率域上為

最初研究認為SMARCA4為一種抑癌基因。肺BRG1蛋白條件敲除的雜合子小鼠的腫瘤體積明顯增加，提示蛋白表達缺失促進了腫瘤發(fā)生［11］。在高鈣型卵巢小細胞癌和乳腺癌等腫瘤類型中均觀察到SMARCA4 缺失促進了腫瘤發(fā)生［12-13］。然而近期研究發(fā)現(xiàn)SMARCA4基因在不同腫瘤組織中作用不同。在結(jié)直腸癌組織中SMARCA4 呈現(xiàn)高表達，且腫瘤細胞增殖及侵襲過程依賴于SMARCA4相關(guān)分子途徑；SMARCA4 缺失引起結(jié)直腸腫瘤細胞自噬缺陷，加速氧化應(yīng)激損傷［14-15］。在小腸組織中，SMARCA4缺失可抑制Wnt信號通路異?；罨?，預(yù)防腫瘤的發(fā)生［16］。由此可見，SMARCA4 可能在不同類型的組織細胞、不同的微環(huán)境中扮演致癌基因或抑癌基因角色。目前SMARCA4 突變分為兩類，第一類突變包括移碼突變、無義突變、基因融合、純和缺失等，通常引起蛋白表達缺失及功能喪失；第二類突變包括錯義突變和拷貝數(shù)丟失，可能引起功能異常。SMARCA4突變被認為是晚期NSCLC患者預(yù)后不佳的獨立危險因素，且含第一類突變的患者預(yù)后更差［8］。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)肺腺癌及肺鱗癌組織中SMARCA4 mRNA 含量明顯高于正常組織，表明SMARCA4 基因與NSCLC 發(fā)生密切相關(guān)。預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)含SMARCA4 突變的肺腺癌患者預(yù)后較野生型更差，而在肺鱗癌中并未發(fā)現(xiàn)SMARCA4 突變與預(yù)后的相關(guān)性。這種預(yù)后相關(guān)性的差異可能與肺腺癌及肺鱗癌間的遺傳異質(zhì)性相關(guān)。腫瘤測序及生物信息分析提示肺腺癌蛋白質(zhì)編碼區(qū)中平均存在7 755 個突變基因，攜帶非沉默突變基因中位數(shù)為105 個；肺鱗癌蛋白質(zhì)編碼區(qū)中平均存在11 125個基因突變，攜帶非沉默突變基因中位數(shù)為181 個，推測肺鱗癌具有更高的基因突變頻率和更復(fù)雜的基因突變種類，因而僅通過一個或少量基因表達水平推測其預(yù)后較為困難［17］。

本研究進一步分析了SMARCA4 伴隨基因與NSCLC 患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)伴隨EGFR 基因共突變患者與EGFR 野生型相比OS 更長；伴隨KRAS 基因共突變患者OS 相比KRAS 野生型患者更短。近期研究發(fā)現(xiàn)EGFR 可能是SMARCA4 下游轉(zhuǎn)錄的直接靶點，SMARCA4表達水平與EGFR水平呈正相關(guān)，SMARCA4突變可能增加了EGFR酪氨酸激酶抑制劑敏感性［14］。這可能是含SMARCA4 與EGFR 共突變患者獲得更好預(yù)后的原因。Liu 等［18］研究顯示在晚期NSCLC 患者中，SMARCA4 合并KRAS 突變患者與野生型患者相比，無病生存期及OS 均更短，原因可能是SMARCA4、KRAS 共同影響腫瘤免疫微環(huán)境，誘導(dǎo)腫瘤細胞免疫逃避與免疫抑制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明含SMARCA4 基因突變的NSCLC患者以老年男性為主，常見伴隨基因為EGFR、TP53、KRAS等，且伴隨基因種類可影響患者預(yù)后；進一步生物信息學(xué)分析揭示，SMARCA4突變以錯義突變?yōu)橹?，攜帶SMARCA4 突變的肺腺癌患者預(yù)后不佳。本研究分析了SMARCA4 突變對NSCLC患者預(yù)后的影響，為肺癌的精準化治療提供了更多依據(jù)。