MTNR1B基因突變合并胰島素受體基因突變1例家系報(bào)道

崔煥煥，鄭 帥，劉曉云，何戎華，陳歡歡*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210029；2無(wú)錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 無(wú)錫 214000

近年來(lái)全球糖尿病的發(fā)病率逐年提高，雖然臨床上可供選擇的降糖藥層出不窮，但在臨床工作中仍會(huì)遇到一些比較棘手的病例，即使嘗試多種降糖方案后治療效果仍不理想。基因診斷技術(shù)的發(fā)展日新月異，為進(jìn)一步尋找這些患者的病因提供了有力支持。筆者發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)褪黑激素受體1B（melatonin receptor 1B，MTNR1B）基因突變合并胰島素受體（insulin receptor，INSR）基因突變的家系，現(xiàn)報(bào)道如下，希望為該類患者的診治提供新思路。

1 病例資料

患者（先證者）為女性，42 歲，18 年前孕期產(chǎn)檢時(shí)發(fā)現(xiàn)血糖升高，產(chǎn)后復(fù)查血糖仍高，糖耐量試驗(yàn)檢查后診斷為“糖尿病”，予二甲雙胍控制血糖。2年前患者因肢體麻木住院時(shí)調(diào)整為門(mén)冬胰島素、二甲雙胍及阿卡波糖治療，監(jiān)測(cè)血糖控制欠佳?；颊邽樽阍骂^位順產(chǎn)，出生時(shí)身長(zhǎng)50 cm，體重3.8 kg，母親無(wú)糖尿病病史。既往有“慢性乙型肝炎”病史。家族史：祖母、父親及兄弟3 人，患者及兄弟姐妹4 人和兒子均患有“糖尿病”。體格檢查：身高161 cm，體重61 kg，體重指數(shù)（body mass index，BMI）23.53 kg/m2，血壓130/82 mmHg，正常體型，頸部及腋下未見(jiàn)黑棘皮。查糖化血紅蛋白為10.9%，糖尿病自身抗體均為陰性，胰島功能檢查結(jié)果見(jiàn)表1，胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）為空腹血糖×空腹胰島素/22.5，其中空腹血糖單位為mmol/L，空腹胰島素的單位為U/mL，22.5為校正因子，該患者的HOMA-IR為3.40。

患者的姐姐在23歲因胰腺炎住院時(shí)確診為“糖尿病”，正常體型，胰島素抵抗明顯，頸部可見(jiàn)黑棘皮（圖1），懷孕期間每日胰島素最大用量接近200 U，有高雄激素血癥病史，多次因血糖控制不佳調(diào)整降糖方案。2018年12月因血糖控制不佳再次住院，查糖化血紅蛋白為12.0%，糖尿病自身抗體均為陰性，門(mén)冬胰島素及甘精胰島素合計(jì)用量為77 U，同時(shí)服用阿卡波糖片（100 mg，每日3次）和格列美脲片（2 mg，每日1次），血糖控制基本達(dá)標(biāo)，胰島功能檢查結(jié)果見(jiàn)表1，HOMA-IR為3.64。

圖1 患者姐姐背部黑棘皮照片

患者的弟弟自幼飲食不控制，活動(dòng)量少，體型肥胖，36 歲時(shí)因糖尿病性酮癥酸中毒住院，無(wú)高雄激素血癥病史，頸部未見(jiàn)黑棘皮，其降糖方案包括利格列汀（5 mg，每日1 次）、阿卡波糖片（50 mg，每日3次）、門(mén)冬胰島素（早12 U、中12 U、晚10 U）及甘精胰島素（22 U），查糖化血紅蛋白為13.3%，糖尿病自身抗體均為陰性，胰島功能檢查結(jié)果見(jiàn)表1，HOMA-IR為0.76。

患者的妹妹因腦梗死住院時(shí)確診為“糖尿病”，目前口服降糖藥物治療，血糖控制一般。此外患者的兒子21 歲，已確診為“糖尿病”，但尚未正規(guī)治療。患者的父親和伯伯等均在20 歲左右時(shí)發(fā)現(xiàn)糖尿病。該家系成員糖尿病發(fā)病早，考慮不排除特殊類型糖尿病可能，為此征得患者及家屬同意后，對(duì)患者及其家系成員的所有已知單基因遺傳病相關(guān)基因（包括全部外顯子，已報(bào)道的所有內(nèi)含子、啟動(dòng)子位點(diǎn)）進(jìn)行檢測(cè)。

抽取患者及其家系成員外周血2 mL，提取DNA。利用捕獲芯片將目標(biāo)區(qū)域的DNA 片段進(jìn)行富集后再借助高通量二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，采用靶向捕獲測(cè)序。將原始測(cè)序數(shù)據(jù)去除污染和接頭序列，然后利用BWA 軟件將過(guò)濾后的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)人類基因組參考序列（hg19）比對(duì)，利用GATK軟件分析得出單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNV）和插入缺失突變（insertion deletion mutation，INDEL）的相關(guān)信息。然后通過(guò)ANNOVAR軟件對(duì)所有的SNP 和INDEL 進(jìn)行注釋。利用PCR和Sanger 測(cè)序驗(yàn)證經(jīng)過(guò)分析篩選得到的變異位點(diǎn)。利用Primer 3.0 在線軟件設(shè)計(jì)PCR 引物。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)Sanger 測(cè)序并在ABI 3130 Genetic Analyzer上進(jìn)行分析。再在家系成員中進(jìn)行共分離驗(yàn)證。最后通過(guò)生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測(cè)軟件SIFT、PolyPhen-2、REVEL對(duì)突變基因位點(diǎn)的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)［1］。突變基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)：在軟件篩選基礎(chǔ)上根據(jù)有無(wú)糖尿病病史，最后挑選出研究的基因。

基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者家系中有兩個(gè)位點(diǎn)的基因發(fā)生雜合突變，包括INSR基因（IVS7+/-5C＞T，即c.1610+5G＞A）和MTNR1B 基因（c.457C＞T，p.R153W）（圖2），未發(fā)現(xiàn)其他符合臨床表型的突變基因。INSR 基因位于chr19-7167974，突變位于外顯子前后5個(gè)堿基處，即7號(hào)內(nèi)含子上第5個(gè)堿基由C 突變?yōu)門(mén)，該突變發(fā)生在內(nèi)含子，會(huì)引起mRNA 剪接突變，可能會(huì)保留內(nèi)含子或缺失外顯子，導(dǎo)致翻譯的多肽鏈發(fā)生改變，是否影響蛋白的剪切需要?jiǎng)游锬Ｐ蛯?shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，蛋白功能預(yù)測(cè)軟件SIFT、PolyPhen-2、REVEL的預(yù)測(cè)結(jié)果均為未知（表2）。另一個(gè)突變基因?yàn)镸TNR1B 基因，其位于chr11-92714846，該編碼區(qū)域的第457 號(hào)核苷酸中的胞嘧啶變異為胸腺嘧啶，導(dǎo)致合成的氨基酸發(fā)生改變（第153 號(hào)氨基酸由精氨酸變異為色氨酸），為錯(cuò)義突變，根據(jù)ACMG指南，初步判定該突變?yōu)榕R床意義未明，蛋白功能預(yù)測(cè)軟件SIFT、PolyPhen-2、REVEL的預(yù)測(cè)結(jié)果分別為有害、有害、良性（表2）。該患者家系圖（圖3）及基因突變位點(diǎn)的驗(yàn)證結(jié)果如下（表3）。

圖2 INSR與MTNR1B基因突變位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

圖3 患者家系圖

表2 生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測(cè)軟件分析結(jié)果

表3 患者家系基因檢測(cè)報(bào)告匯總表

2 討論

糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥是全球疾病死亡的主要原因之一，2015—2017年我國(guó)18歲及以上人群的糖尿病患病率為11.2%［2］。國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)估計(jì)，到2035 年，將有5.92 億人患糖尿病。糖尿病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)病與環(huán)境、遺傳等多種因素相關(guān)。不管1型糖尿病還是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM），均存在明顯的遺傳異質(zhì)性。迄今為止，T2DM的致病機(jī)制仍不清楚。然而，越來(lái)越多的證據(jù)顯示T2DM 的發(fā)病機(jī)制與遺傳變異相關(guān)，其中胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分泌途徑相關(guān)基因之間的相互作用在個(gè)體對(duì)T2DM的易感性方面發(fā)揮重要作用。現(xiàn)有的降糖藥物均有一定不良反應(yīng)，因此發(fā)現(xiàn)一種可以有效幫助糖尿病管理的新型生物分子至關(guān)重要。

褪黑素是一種負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的激素，由哺乳動(dòng)物和人類的松果體產(chǎn)生，分布于各靶器官和組織，研究顯示其可通過(guò)影響晝夜節(jié)律來(lái)影響葡萄糖代謝［3］。褪黑素受體（melatonin receptor，MTNR）分為MTNR1和MTNR2兩個(gè)亞型，主要分布于海馬、下丘腦、視網(wǎng)膜等部位。MTNR1B基因編碼的MTNR1B是褪黑激素受體家族的成員，其可在許多組織中表達(dá)，包括胰島［4］，褪黑素通過(guò)MTNR1B和下游的Raf-1/ERK信號(hào)通路對(duì)胰島素基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用［5］。研究顯示小鼠體內(nèi)MTNR1缺失時(shí)，其糖代謝能力降低，推測(cè)激活MTNR1 能夠促進(jìn)葡萄糖的代謝能力，從而改善胰島素抵抗，維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)［6］。另有研究表明MTNR激動(dòng)劑提高經(jīng)棕櫚酸處理過(guò)的脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體1的表達(dá)，激活A(yù)MPK氧化應(yīng)激通路，提高經(jīng)棕櫚酸處理過(guò)的脂肪細(xì)胞糖代謝能力，從而改善胰島素抵抗，降低血糖。已有研究發(fā)現(xiàn)MTNR1B rs10830963 位點(diǎn)基因多態(tài)性與早期胰島素反應(yīng)缺陷和β細(xì)胞葡萄糖敏感性降低有關(guān)。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)MTNR1B 的遺傳變異在調(diào)節(jié)空腹血糖水平和影響T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中發(fā)揮了重要作用，特別是由MTNR1B 調(diào)控的MTNR2，經(jīng)鑒定MTNR2 功能喪失與T2DM 有關(guān)［7］。因此，研究認(rèn)為褪黑素和MTNR1B 的遺傳變異與T2DM 易感性有關(guān)［8］。褪黑素在動(dòng)植物、真菌、細(xì)菌體內(nèi)皆可發(fā)現(xiàn)，許多降糖中藥（如黃芩、大黃、麥冬、連翹）中含有褪黑素成分，其中黃芩中的褪黑素含量高達(dá)0.7%，具有潛在的降血糖作用，為降糖藥物研發(fā)提供參考。

INSR是一種細(xì)胞表面糖蛋白，屬于酪氨酸激酶家族的受體，成熟的INSR由2個(gè)α亞單位和2個(gè)β亞單位組成，胰島素通過(guò)與膜外的α亞單位結(jié)合，將信息通過(guò)跨膜的β亞單位傳遞至細(xì)胞膜內(nèi)，引起受體及其底物發(fā)生一系列磷酸化反應(yīng)，從而介導(dǎo)INSR生物效應(yīng)的發(fā)揮。T2DM的發(fā)生與胰島素分泌不足及胰島素抵抗有關(guān)。胰島素發(fā)揮作用必需由INSR 介導(dǎo)，因此INSR的數(shù)目及功能缺陷均會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。研究顯示INSR 基因突變通過(guò)以下幾個(gè)方面引起胰島素抵抗的發(fā)生：①抑制受體的生物合成，最常見(jiàn)的是形成成熟前鏈終止密碼，使受體結(jié)構(gòu)不完整；②INSR受體基因突變使受體向膜的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面受體數(shù)目減少；③降低受體與胰島素的親和力；④抑制受體酪氨酸激酶活性；⑤加速受體降解［9］。

目前臨床上與INSR基因相關(guān)的疾病有：①家族性高胰島素血癥性低血糖癥5 型，也稱為先天性高胰島素血癥、胰島細(xì)胞增生癥和嬰兒持續(xù)性高胰島素低血糖癥，其特點(diǎn)為嬰兒期持續(xù)低血糖，該病主要是由于血糖水平低下對(duì)胰島素分泌形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)所致［10］；②松果體增生、胰島素抵抗性糖尿病伴體細(xì)胞異常，又稱為Rabson-Mendenhall 綜合征，本病屬于一組極端胰島素抵抗綜合征（其中還包括矮妖精貌綜合征、脂營(yíng)養(yǎng)不良以及A 型和B 型胰島素抵抗綜合征），它是一種發(fā)病率未知的罕見(jiàn)?。虎垡葝u素抵抗性糖尿病伴黑棘皮癥，主要表現(xiàn)是嚴(yán)重的胰島素抵抗、黑棘皮病和青春期女性患者的卵巢雄激素過(guò)多，女性患者經(jīng)常表現(xiàn)為多毛癥、痤瘡、閉經(jīng)或月經(jīng)稀發(fā)和男性化。與MTNR1B 基因相關(guān)的疾病則為非胰島素依賴性糖尿病，通常在兒童期或成年早期發(fā)?。ㄒ话阍?5歲之前），主要表現(xiàn)為發(fā)病初期胰島素分泌缺陷和胰島素依賴，臨床表現(xiàn)為胰島素抵抗和T2DM。

對(duì)該家系成員進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)果顯示家系中存在2 個(gè)突變的基因位點(diǎn)，包括位于chr19-7167974的INSR 基因（c.1610+5G＞A）和chr11-92714846 的MTNR1B 基因（c.457C＞T）。從患者及其家系位點(diǎn)驗(yàn)證報(bào)告可知，家系中已確診的糖尿病患者中，除患者的弟弟2 個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)突變，妹妹僅MTNR1B 基因存在突變外，其余糖尿病患者均存在2個(gè)位點(diǎn)的突變。已有文獻(xiàn)報(bào)道MTNR1B基因多態(tài)性與胰島素受體底物（insulin receptor substrate 2，IRS2）基因變異相互作用，影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)［11］。該家系中先證者的弟弟無(wú)上述2 個(gè)基因位點(diǎn)的突變，糖尿病自身抗體為陰性，結(jié)合其自幼飲食不控制、體型肥胖，T2DM可能大，檢查也提示其胰島素抵抗指數(shù)較其他存在基因突變者低，這些基因表型上的區(qū)別值得研究和隨訪。

研究發(fā)現(xiàn)MTNR 基因與胰島素敏感性、糖尿病和代謝綜合征有關(guān)，提示MTNR 基因可能是多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）的候選基因［12］。Shabani 等［13］發(fā)現(xiàn)給PCOS 患者補(bǔ)充褪黑素可明顯降低HOMA-IR，并明顯提高定量胰島素敏感性指數(shù)。此外，多個(gè)研究提示褪黑素和MTNR1B的遺傳變異與T2DM胰島素抵抗也密切相關(guān)。分析該家系臨床特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，INSR和MTNR1B基因未發(fā)生突變或僅存在MTNR1B 基因突變者胰島素抵抗相對(duì)較輕，而2 個(gè)位點(diǎn)均突變者存在更嚴(yán)重的胰島素抵抗，INSR基因的這一突變位點(diǎn)尚無(wú)報(bào)道，是新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，值得臨床關(guān)注。患者姐姐的HOMA-IR為3.64，胰島素抵抗明顯，考慮可能與其INSR 和MTNR1B基因均存在突變有關(guān)。研究顯示許多中藥（如麥冬等）含有褪黑素成分，有潛在的降血糖作用，參芪降糖顆粒聯(lián)合利拉魯肽治療胰島素控制效果不佳的T2DM患者療效顯著［14］。文獻(xiàn)報(bào)道，MTNR1B SNP 與IRS2 基因變異相互作用，與心外膜脂肪組織的數(shù)量相關(guān)，并影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)和血脂譜，從而影響心臟代謝風(fēng)險(xiǎn)［11］。岳穎等［15］研究顯示，MTNR激動(dòng)劑Neu-p11 可改善由線粒體融合蛋白2 介導(dǎo)的T2DM 大鼠的胰島素抵抗、糖代謝異常及肝糖代謝酶mRNA 異常表達(dá)，達(dá)到保護(hù)肝臟、治療糖尿病的作用。推測(cè)以MTNR 和INSR 為靶點(diǎn)的藥物將成為以后的研究方向。

對(duì)于該家系來(lái)說(shuō)，家系成員發(fā)病年齡早，大多數(shù)在25歲之前，有明顯的家族遺傳傾向。根據(jù)該家系特點(diǎn)考慮為常染色體顯性遺傳，部分家系成員目前尚未診斷為糖尿病，但不能排除他們以后不會(huì)發(fā)病，建議定期監(jiān)測(cè)血糖變化。研究顯示存在INSR和MTNR1B 基因突變者的胰島素抵抗明顯，無(wú)基因突變者胰島素抵抗較輕，患者妹妹僅存在MTNR1B基因突變，考慮MTNR1B基因?yàn)槠渲虏〉闹餍Щ蚩赡艽?，蛋白功能預(yù)測(cè)軟件SIFT、PolyPhen-2、REVEL分析MTNR1B 基因突變位點(diǎn)結(jié)果分別為有害、有害、良性，與臨床表現(xiàn)相符。但I(xiàn)NSR 基因突變位點(diǎn)的蛋白功能預(yù)測(cè)分析提示為未知，INSR基因突變是否與患者的發(fā)病有關(guān)，以及INSR和MTNR1B基因是否存在相互影響，仍需對(duì)子代其他人員觀察隨訪后進(jìn)一步探討。

基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展為精準(zhǔn)醫(yī)療奠定了基礎(chǔ)。臨床上對(duì)于治療效果差的患者，要積極尋找病因，從基因?qū)用孢M(jìn)行疾病的診斷，從而為患者選擇最佳的治療方案。相信隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的糖尿病致病基因會(huì)被發(fā)現(xiàn)，從而為攻克糖尿病創(chuàng)造條件。