復(fù)方守宮散通過TNF-α 信號(hào)通路對(duì)骨癌痛大鼠痛覺敏化機(jī)制的研究

蔡琪 ,張良軍 ,黃璟 ,毛漢文 ,田敬海 ,夏黎明

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院 合肥市,230037 武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院2腫瘤科,3骨外科 武漢市,430040 4安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 合肥市,230031

疼痛是癌癥患者的常見癥狀,研究表明85 %的乳腺癌、肺癌、前列腺癌患者出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移,而骨轉(zhuǎn)移可以引起高鈣血癥、脊髓壓迫、骨癌痛等癥狀,其中約三分之一患者伴有骨癌痛[1-2]。骨癌痛包括神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛,顯著降低患者的生活質(zhì)量,縮短了生存期[3]。骨癌痛產(chǎn)生疼痛難以忍受,但目前的治療策略可能存在不足亦或產(chǎn)生副作用[4],因此迫切需要開發(fā)新的治療藥物、探索新的機(jī)制緩解骨癌痛。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨癌痛屬于“骨疽”、“骨蝕”、“骨瘤” 等范疇,是由機(jī)體寒瘀、痰阻、本虛、氣滯等導(dǎo)致。中草藥復(fù)方守宮散(Compound Shougong powder,CSP) 屬于一種復(fù)方藥,包括守宮、制何首烏、三七、梅花、生曬參、沒藥,具有消腫止痛、補(bǔ)虛解毒等功效,可用于多種癌癥如肺癌的治療[5],另外研究發(fā)現(xiàn)CSP 對(duì)S180 荷瘤小鼠具有顯著鎮(zhèn)痛作用[6],但對(duì)于肺癌骨癌痛的治療鮮有報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)可能在慢性疼痛進(jìn)展中起重要作用[7]。其中腫瘤壞死因子α (tumour necrosis factor α,TNF-α) 是一種炎性介質(zhì),不僅介導(dǎo)炎癥進(jìn)展,還參與神經(jīng)性疼痛的調(diào)節(jié)[8]。研究表明TNF-α 通過鈣、鉀、鈉離子通道調(diào)節(jié)傷害性神經(jīng)元的敏感性,可能與疼痛通路密切相關(guān)[9],基于以上報(bào)道推測(cè)TNF-α 通路可能通過影響炎性因子水平及行為學(xué)變化,參與肺癌骨癌痛的發(fā)展。因此本研究通過建立肺癌骨癌痛大鼠模型,通過檢測(cè)其行為學(xué) [機(jī)械性縮足反射閾值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)、熱痛覺縮足潛伏期(paw withdrawal thermal lathency,PWTL)] 變化及炎性因子[TNF-α、白介素(interleukin,IL) -1β、IL-6] 變化,探討CSP 對(duì)肺癌骨癌痛大鼠痛覺敏化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞來源 ATCC 提供Lewis 肺癌細(xì)胞株(目錄號(hào): TCM7)。深圳市疾病預(yù)防控制中心提供雌性,SPF 級(jí)SD 大鼠72 只,4 周齡,體質(zhì)量115～123 g,動(dòng)物許可證號(hào): SYXK (粵)2022-0282。所有大鼠均飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房中,自由進(jìn)食、飲水。該研究已獲得動(dòng)物倫理使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供CSP;GIBCO 公司提供DMEM 培養(yǎng)基(貨號(hào): 12100046);美國(guó)BD 公司提供注射器;Sigma 公司提供PVDF 膜、戊巴比妥鈉 (貨號(hào):SIGMA-P3761);碧云天生物技術(shù)有限公司提供BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒;Bio-Rad 公司提供SDSPAGE 凝膠;Thermo Fisher Scientific 公司提供RIPA緩沖液;上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供TNF-α(貨號(hào): 002859)、IL-1β (貨號(hào): 037361)、IL-6(貨號(hào): 064292) ELISA 試劑盒;Abcam 公司提供單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1,MCP-1) (貨號(hào): ab7202)、TNF-α (貨號(hào): 109322)一抗。

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供全自動(dòng)熱痛測(cè)試儀(BME-410C 型);日本NIKON 株式會(huì)社提供倒置顯微鏡(MA100)。

1.2 方法

1.2.1 肺癌骨癌痛大鼠模型的制備及干預(yù) 參照文獻(xiàn)[10]建立肺癌骨癌痛大鼠模型: 隨機(jī)選取2只大鼠使用40 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,采用仰臥位固定大鼠,酒精消毒大鼠右腋部皮下,將Lewis 肺癌細(xì)胞[ (對(duì)數(shù)期,2 ×107個(gè)/mL 懸液(0.5 mL)] 皮下接種于該部位,在標(biāo)準(zhǔn)條件下繼續(xù)飼養(yǎng)。兩周后,麻醉并處死已成皮下瘤的5 只大鼠,無菌環(huán)境下取腫瘤組織,生理鹽水研磨制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度(2 ×108個(gè)/mL)。將剩余60 只大鼠分為造模組 (50 只)、假手術(shù)組 (10只),40 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,在左側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨處利用規(guī)格為1 mL 注射器進(jìn)行3～4 mm 的穿刺鉆孔,然后改用25 μL 微量進(jìn)樣器吸取1 μL 空氣、1 μL 明膠水溶液以及10 μL 腫瘤細(xì)胞懸液(使用PBS 懸浮) 進(jìn)行注射,緩慢去針,無菌棉簽蘸生理鹽水清洗傷口,其中假手術(shù)組僅注射PBS 溶液。造模完成第7 天,大鼠縮足反應(yīng)明顯增多,表明肺癌骨癌痛大鼠造模成功[11]。將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照(扶他林)組、CSP 低(CSP-L)、中(CSP-M)、高(CSP-H)劑量組,其中CSP-H、CSP-M、CSP-L 分別以80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg CSP 灌胃干預(yù)[12];陽(yáng)性對(duì)照組以扶他林局部用藥0.1 g/kg 干預(yù)[13],假手術(shù)組、模型組以生理鹽水干預(yù);每天干預(yù)一次,連續(xù)3 周。

1.2.2 檢測(cè)大鼠PWMT 采用Von Frey 纖維測(cè)定PWMT,具體操作如下: 將大鼠提前放入有機(jī)玻璃格子適應(yīng)30 min,以大鼠左后肢足底中心為作用點(diǎn),依次使用Von Frey 細(xì)絲刺激該部位,當(dāng)大鼠出現(xiàn)舔足、抬足行為標(biāo)記為陽(yáng)性反應(yīng)。PWMT 的記錄標(biāo)準(zhǔn): 每個(gè)強(qiáng)度進(jìn)行10 次檢測(cè),當(dāng)有5 次陽(yáng)性反應(yīng)時(shí),記下該數(shù)值,再重復(fù)3 次,取平均值即為PWMT。各組大鼠分別在用藥前、后進(jìn)行PWMT 檢測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)大鼠PWTL 采用全自動(dòng)熱痛測(cè)試儀測(cè)定PWTL,將大鼠提前放入有機(jī)玻璃格子適應(yīng)30 min,以大鼠左側(cè)后肢足部中心為熱輻射刺激儀的聚焦作用點(diǎn),當(dāng)大鼠出現(xiàn)回縮、抬起行為記為陽(yáng)性,PWTL 即是大鼠從被照射(光照強(qiáng)度調(diào)節(jié)為75 %) 直至出現(xiàn)陽(yáng)性行為時(shí)的作用時(shí)間。每只大鼠重復(fù)3 次,間隔時(shí)間為10 min,為防止損傷大鼠組織,每次作用時(shí)間不得超過20 s。各組大鼠分別在用藥前、后進(jìn)行檢測(cè)PWTL。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平變化 PWMT、PWTL 檢測(cè)結(jié)束后,40 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,腹部主動(dòng)脈取血,離心后取上清液,按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。

1.2.5 Western 印跡檢測(cè)脊髓組織中MCP-1、TNFα 蛋白表達(dá) 處死各組大鼠,分離腰椎脊髓(L3～L5) 組織,采用RIPA 緩沖液、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑的混合物裂解10 min,在4 ℃以11 500 r/min 離心5 min,收集上清液,并進(jìn)行BCA 測(cè)定以確定總蛋白濃度;在10 % SDS-PAGE 凝膠上電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜,然后將免疫印跡在溶解于脫脂牛奶中孵育2 h,在4 ℃下與MCP-1、TNF-α、βactin 一抗孵育過夜,次日洗膜后,再與二抗在室溫下孵育1 h,使用Thermo Chemical 發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)蛋白質(zhì),Image J 軟件分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CSP 對(duì)各組大鼠機(jī)械性縮足反射閾值(PWMT) 的影響

用藥前,模型大鼠PWMT 較假手術(shù)組均顯著降低(P＜0.05);用藥后,與假手術(shù)組比較,模型組PWMT 顯著降低(P＜0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和CSP-L 組、CSP-M 組、CSP-H 組PWMT 顯著升高(P＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組PWMT與CSP-H 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,表1)。

表1 各組大鼠PWMT 的比較(,n=10)

表1 各組大鼠PWMT 的比較(,n=10)

PWMT: 機(jī)械性縮足反射閾值。與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與模型組比較,b P＜0.05;與CSP-L 組比較,c P＜0.05;與CSP-M 組比較,dP＜0.05

2.2 CSP 對(duì)各組大鼠熱痛覺縮足潛伏期(PWTL) 的影響

用藥前,模型大鼠PWTL 較假手術(shù)組均顯著縮短(P＜0.05);用藥后,與假手術(shù)組比較,模型組PWTL 顯著縮短(P＜0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和CSP-L 組、CSP-M 組、CSP-H 組PWTL顯著延長(zhǎng)(P＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組用藥后PWTL 與CSP-H 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,表2)。

表2 各組大鼠PWTL 的比較(,n=10)

表2 各組大鼠PWTL 的比較(,n=10)

PWTL: 熱痛覺縮足潛伏期。與假手術(shù)組比較,a P ＜0.05;與模型組比較,b P＜0.05;與CSP-L 組比較,c P＜0.05;與CSP-M 組比較,dP＜0.05

2.3 CSP 對(duì)各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著升高(P＜0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和CSP-L 組、CSP-M 組、CSP-H組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著降低(P＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平與CSP-H 組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,表3)。

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的比較(,n=10,ng/L)

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的比較(,n=10,ng/L)

與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與CSP-L 組比較,cP＜0.05;與CSP-M 組比較,dP＜0.05

2.4 CSP 對(duì)各組大鼠脊髓組織MCP-1、TNF-α 蛋白表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠脊髓組織中MCP-1、TNF-α 表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和CSP-L 組、CSP-M 組、CSP-H 組MCP-1、TNF-α 表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組MCP-1、TNF-α 表達(dá)水平與CSP-H 組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,圖1、表4)。

圖1 各組大鼠脊髓組織中MCP-1、TNF-α 表達(dá)(Western 印跡圖)

表4 各組大鼠脊髓組織中MCP-1、TNF-α表達(dá)的比較(,n=10)

表4 各組大鼠脊髓組織中MCP-1、TNF-α表達(dá)的比較(,n=10)

與假手術(shù)組比較,a P＜0.05;與模型組比較,b P＜0.05;與CSP-L 組比較,cP＜0.05;與CSP-M 組比較,dP＜0.05

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)70 %的晚期癌癥患者會(huì)經(jīng)歷癌癥疼痛,超過80 %的疼痛歸因于轉(zhuǎn)移性癌癥引起的骨癌疼痛,但其機(jī)制較為復(fù)雜,涉及外周、中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損、破骨細(xì)胞的過度活化[14]。雖然雙膦酸鹽、阿片類藥物、非甾體類抗炎藥等可緩解許多骨癌痛患者的疼痛,但常伴隨不良副作用的發(fā)生,例如胃出血[15]。因此迫切需要新的藥物治療骨癌痛。本研究通過注射Lewis 肺癌細(xì)胞建立肺癌骨癌痛大鼠模型,當(dāng)大鼠出現(xiàn)明顯的縮足反應(yīng)時(shí),表明肺癌骨癌痛大鼠模型建立成功,可用于新藥及機(jī)制的研究。

據(jù)《清代外科證治全書》 記載“貼骨瘤,貼骨而生,極疼痛”,在中醫(yī)看來骨癌痛屬于“不通則痛”、“不榮則痛”,所以大多數(shù)中藥治療多以補(bǔ)腎健骨、活血化瘀為主[16]。如在Lewis 肺癌引起的小鼠骨痛研究中,木犀草素可以抑制脊髓背側(cè)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和NOD 樣受體蛋白3 炎性小體的激活,進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥,改善肺癌誘導(dǎo)的骨癌痛[17]。CSP 屬于一種復(fù)方草藥,由制何首烏、守宮、生曬參、三七、梅花、沒藥組成,具有解毒散結(jié)、益腎填精等功效,可明顯改善晚期惡性腫瘤患者血瘀癥狀[18]。徐國(guó)品等[19]研究證明CSP 可以減輕晚期非小細(xì)胞肺癌化療患者的血液學(xué)毒性,提高免疫功能。但尚未有文獻(xiàn)報(bào)道CSP 可以緩解肺癌誘導(dǎo)的骨癌痛。基于以上文獻(xiàn)證明CSP 中梅花、沒藥能消腫止痛、活血通絡(luò);三七能化瘀止血;生曬參能健脾生津;制何首烏能補(bǔ)益經(jīng)血;守宮能解毒散結(jié)、益腎填精。PWMT、PWTL 是生理性疼痛的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌誘導(dǎo)的骨癌痛大鼠PWMT、PWTL 明顯降低,進(jìn)一步表明模型制備成功,但經(jīng)CSP 干預(yù)后,模型組大鼠PWMT、PWTL值明顯升高,提示CSP 可以有效緩解肺癌誘導(dǎo)的骨癌痛大鼠疼痛,但由于該藥物屬于復(fù)合組分,目前猜測(cè)梅花、沒藥、三七起到主要作用,但具體成分在其中作用還在進(jìn)一步核實(shí)中。

研究表明骨癌痛發(fā)生時(shí),往往伴隨炎癥信號(hào)通路被激活,大量炎性介質(zhì)被釋放,如腫瘤細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6 等因子[15]。在乳腺癌誘導(dǎo)的骨癌大鼠研究中[20],TNF-α 可介導(dǎo)機(jī)械和熱痛覺過敏,而IL-6 也可通過TNF-α 的升高引起機(jī)械性痛覺過敏,阻斷上述信號(hào)有助于緩解骨癌疼痛。另外,何佩珊等[10]研究報(bào)道了肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛小鼠血漿中炎性因子如TNF-α、IL-1β 水平明顯升高,而香辛方通過下調(diào)炎性因子水平,進(jìn)而緩解骨轉(zhuǎn)移癌痛。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌誘導(dǎo)的骨癌痛大鼠血清中IL-1β、IL-6 含量以及血清、組織中TNF-α 水平明顯升高,提示骨癌痛發(fā)生可能與炎性信號(hào)通路激活有關(guān)。當(dāng)CSP 干預(yù)后,上述指標(biāo)發(fā)生逆轉(zhuǎn),提示CSP 可通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá),進(jìn)而緩解骨癌痛大鼠疼痛。另外,研究發(fā)現(xiàn)在TNF-α誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的形成中,MCP-1 表達(dá)可被上調(diào)[21]。本研究還發(fā)現(xiàn)MCP-1 在骨癌痛大鼠脊髓組織中表達(dá)水平顯著升高,提示大鼠出現(xiàn)了痛覺中樞敏化,與以往研究結(jié)果相吻合[22-23]。但經(jīng)CSP 治療后,MCP-1 水平顯著下降,表明CSP 可能通過抑制中樞敏化而起到止痛作用。

此外,在本研究中,高劑量CSP 對(duì)骨癌痛大鼠的改善作用與扶他林接近,但低、中劑量CSP的改善作用低于扶他林,推測(cè)其原因可能與CSP的劑量和扶他林的作用特點(diǎn)有關(guān)。扶他林為非甾體類抗炎藥,主要具有鎮(zhèn)痛、抗炎的作用,可抑制環(huán)氧合酶和體內(nèi)前列腺素的生物合成,進(jìn)而抑制炎性因子的釋放,且扶他林外用能通過皮膚滲透到患處,緩解疼痛,具有起效快、安全性高等特點(diǎn)。CSP 對(duì)骨癌痛的改善作用是否與其給藥途徑有關(guān),還有待深入分析。

綜上所述,CSP 可能通過抑制TNF-α 炎性反應(yīng)通路,抑制中樞敏化,進(jìn)而緩解肺癌誘導(dǎo)的骨癌疼痛,但由于該疾病機(jī)制復(fù)雜,CSP 可能從多因素、多環(huán)節(jié)達(dá)到止痛目的,但是否有其他作用機(jī)制需進(jìn)一步探索。