SCD1保護(hù)胰島β細(xì)胞避免IL-1β引起損傷的研究

梁瑾,汪彥陽,吳倜珺,陳芳

南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省人類功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京市,211166

糖尿病(diabetes mellitus,DM) 是以胰島素分泌和/或作用缺陷引起的以血糖持續(xù)性升高為特征的慢性代謝性疾病,以2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM) 最為常見。雖然胰島素抵抗是T2DM 的始動(dòng)因素,但β 細(xì)胞功能障礙是其發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。在T2DM 患者的胰島內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞浸潤,釋放的炎性因子可造成β 細(xì)胞合成和分泌胰島素能力下降甚至造成細(xì)胞凋亡。在多種炎性因子中,IL-1β 被認(rèn)為是引起β 細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因子,清除或抑制IL-1β 能夠逆轉(zhuǎn)β 細(xì)胞損傷[4]。β 細(xì)胞表面具有豐富的IL-1β 受體,分泌的IL-1β 通過其受體激活NF-κB、MAPK 等信號(hào)途徑造成損傷[6];此外,高糖、髙脂會(huì)刺激β 細(xì)胞大量表達(dá)IL-1β,引起細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激從而激活下游生物學(xué)效應(yīng),導(dǎo)致惡性循環(huán)并最終延長炎癥的發(fā)展。

硬脂酰輔酶A 去飽和酶1 (stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1) 是一種催化飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶,是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種整合蛋白,廣泛表達(dá)于肝臟、腎臟、胰腺以及腦等組織中。文獻(xiàn)報(bào)道,SCD1 全身性敲除鼠表現(xiàn)出全身瘦小,對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖有一定抵抗,且體內(nèi)脂肪組織以及肝臟等胰島素作用的靶器官呈現(xiàn)出胰島素敏感性增強(qiáng)的現(xiàn)象;但是也有文獻(xiàn)認(rèn)為,人體肝臟中低水平的SCD1 活性則與脂肪肝的形成以及胰島素抵抗密切相關(guān)。除胰島素敏感性外,SCD1 與胰島β 細(xì)胞功能的關(guān)系亦有探討。有研究發(fā)現(xiàn)雖然全身性SCD1 敲除的ob/ob 小鼠胰島素敏感性出現(xiàn)增加,但β 細(xì)胞功能出現(xiàn)了障礙,即胰島素合成和分泌的嚴(yán)重不足[16]。在小鼠胰島β 細(xì)胞系Min6 細(xì)胞中,篩選出耐棕櫚酸刺激的細(xì)胞株,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞株中SCD1 含量相較其他細(xì)胞株明顯增高。SCD1 對(duì)炎癥狀態(tài)下的胰島β 細(xì)胞是否有保護(hù)作用,目前仍不清楚。因此,本研究旨在探究SCD1 能否發(fā)揮抗炎作用以保護(hù)β 細(xì)胞免受炎性因子造成的功能損傷和凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI-1640、DMEM 培養(yǎng)基(美國GIBCO 公司);FBS (美國GIBCO 公司);青霉素、鏈霉素(Thermo Fisher);IL-1β (美國Pepro-tech 公司);Tunicamycin (美國Sigma 公司);β-巰基乙醇(美國Sigma 公司);PrimerSTAR PCR 試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、DNA marker (日本Takara 公司);AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒、AxyPrep PCR 清潔回收試劑盒(AXYGEN 公司);胰島素放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所);細(xì)胞培養(yǎng)皿、孔板 (德國Greiner 公司);轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 (美國Invitrogen公司);TUNEL BrightGreen Apoptosis Dection Kit(南京諾唯贊公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠胰島INS-1 細(xì)胞培養(yǎng)于含8 % FBS、11.1 mmol/L 葡萄糖、50 μmol/L β-巰基乙醇、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、10 mmol/L HEPES、1 mmol/L 丙酮酸鈉的RPMI-1640 培養(yǎng)液內(nèi)。小鼠胰島βTC-6 細(xì)胞系培養(yǎng)于含15 % FBS、25 mmol/L 葡萄糖、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10 mmol/L HEPES、1 mmol/L 丙酮酸鈉的DMEM 培養(yǎng)液內(nèi)。細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿或孔板中,在含95 % O2、5 % CO2的37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞處理

在IL-1β 處理細(xì)胞過程中,對(duì)照組需加入對(duì)應(yīng)量的溶劑處理。為了避免溶劑自身毒性對(duì)結(jié)果的影響,所有處理均設(shè)溶劑對(duì)照組,并確保溶劑的終濃度小于0.1 %。

1.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染細(xì)胞,具體如下(以48 孔板為例): 轉(zhuǎn)染前一天細(xì)胞消化種板,細(xì)胞密度約1 ×105個(gè)/mL,每孔加培養(yǎng)液0.2 mL,以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)70 %～80 %;轉(zhuǎn)染時(shí),按照所需量將質(zhì)粒和脂質(zhì)體以1 (μg) ∶1.2(μL) 的比例分別稀釋于兩管無抗生素?zé)o血清的25 μL 培養(yǎng)液中;室溫靜置5 min。將質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合至一管,室溫靜置20 min,使之形成復(fù)合物。等待20 min 時(shí),可將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用新的培養(yǎng)液進(jìn)行換液,每孔100 μL。20 min 之后,將質(zhì)粒脂質(zhì)體的復(fù)合物每孔加入50 μL。轉(zhuǎn)染4～6 h后,棄上清,換成完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,之后可進(jìn)行其他處理。細(xì)胞全程于37 ℃5 % CO2條件下培養(yǎng)。

1.5 KSIS、GSIS 實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞內(nèi)胰島素含量抽提

以48 孔板為例,細(xì)胞棄上清,PBS 洗一次。加入0.2 mL 無糖并含有對(duì)應(yīng)藥物或者溶劑的KRBbuffer [Krebs-ringer bicarbonate buffer containing 135 mmol/L NaCl,3.6 mmol/L KCl,0.5 mmol/L NaH2PO4,0.5 mmol/L MgSO4,1.5 mmol/L CaCl2,2 mmol/L NaHCO3,10 mmol/L HEPES,0.1 % BSA(pH7.4)],培養(yǎng)1 h;棄上清,每孔細(xì)胞加入0.2 mL 含3.3 mmol/L (低糖,INS-1 細(xì)胞系) 或0.2 mmol/L (低糖,βTC-6 細(xì)胞系) 的KRB 溶液,繼續(xù)孵育1 h,收集上清至1.5 mL EP 管中,凍存于-80 ℃,待測(cè);棄上清,每孔細(xì)胞加入0.2 mL 含11.2 mmol/L (高糖,檢測(cè)βTC-6 細(xì)胞的GSIS 功能) 的KRB 溶液,繼續(xù)孵育1 h 后,收集上清到1.5 mL EP 管中,凍存于-80 ℃,待測(cè);棄上清,每孔細(xì)胞加入0.2 mL 含3.3 mmol/L (低糖,INS-1 細(xì)胞系) 或0.2 mmol/L (低糖,βTC-6 細(xì)胞系)以及含50 mmol/L 的KCl 的KRB 溶液,繼續(xù)孵育1 h,收集上清至1.5 mL EP 管中,凍存于-80 ℃,待測(cè);將每孔細(xì)胞棄上清,用PBS 漂洗一次,每孔中加0.2 mL 酸乙醇抽提液(74 % ethanol,1.4 %HCl),4 ℃孵育過夜,抽提細(xì)胞中儲(chǔ)存的胰島素,第二天收集上清于1.5 mL 離心管中,4 ℃冰箱放置,待測(cè);采用放射性免疫法(radioimmnuoassay,RIA) 檢測(cè)胰島素含量。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡

細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后,棄上清,PBS 清洗細(xì)胞兩遍,加入細(xì)胞裂解液冰上裂解20～30 min,用刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中刮落收集至1.5 mL 離心管中,4 ℃12 000 r/min 離心20 min,收集上清至新的1.5 mL離心管中,測(cè)定其中蛋白濃度,煮沸變性后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、結(jié)合抗體,最后借助于化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。

1.7 質(zhì)粒的構(gòu)建

①SCD1 基因擴(kuò)增: 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫查詢小鼠SCD1 基因開放閱讀框?qū)?yīng)的核酸序列,使用Snapgene 軟件設(shè)計(jì)引物,以小鼠DNA 為模板,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下: 98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s;55 ℃～65 ℃退火30 s;進(jìn)行35 次循環(huán);72 ℃延伸10 min。②PCR 產(chǎn)物的純化: 通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物大小,符合要求后用Axygen 公司的凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。③雙酶切: 根據(jù)需求選取兩個(gè)限制性內(nèi)切酶,同時(shí)對(duì)載體(pEGFP-C1) 和PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng),37 ℃水浴1 h,反應(yīng)體系為,10 ×Buffer 5 μL,載體1 μg 或目的片段20 μL,限制性內(nèi)切酶各1 μL,滅菌超純水補(bǔ)足體積至40 μL。④連接: 測(cè)定酶切后載體與目的片段濃度,將載體與目的片段以4∶3 的摩爾比加入連接體系;連接反應(yīng)體系為10 ×T4 DNA 連接酶buffer 1.5 μL,載體和片段共8 μL,T4 DNA 連接酶1 μL,滅菌超純水補(bǔ)足體積至15 μL。⑤轉(zhuǎn)化: 將連接產(chǎn)物通過42 ℃熱激90 s的方法轉(zhuǎn)入DH5α 大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中,并至37 ℃恒溫?fù)u床上預(yù)搖1 h,之后離心收集下層細(xì)菌均勻涂布在含有抗生素的LB 瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。⑥陽性克隆的鑒定測(cè)序、質(zhì)粒小提: 在超凈工作臺(tái)中挑選LB 平板上的單克隆菌落,轉(zhuǎn)移至含有對(duì)應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,在恒溫?fù)u床振搖12～16 h,收集菌液;利用Axygen 質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并測(cè)序。

1.8 Tunel 染色

使用南京諾唯贊公司TUNEL Bright Green Apoptosis Dection Kit 試劑盒,將細(xì)胞處理完畢后參照說明書對(duì)其進(jìn)行染色后使用熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IL-1β 抑制SCD1 的蛋白表達(dá)

IL-1β 是造成胰島β 細(xì)胞功能障礙的主要炎性因子之一。結(jié)果顯示,在IL-1β 濃度梯度的處理下,大鼠胰島β 細(xì)胞系INS-1 細(xì)胞中SCD1 的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)濃度依賴性下降(圖1)。

圖1 IL-1β 抑制SCD1 的蛋白表達(dá)

2.2 SCD1 過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)驗(yàn)證

上述結(jié)果證實(shí)在IL-1β 處理下β 細(xì)胞中SCD1的表達(dá)下降且呈濃度劑量依賴性。為了進(jìn)一步探索SCD1 與胰島β 細(xì)胞功能之間的關(guān)系,我們構(gòu)建了SCD1 過表達(dá)質(zhì)粒,在INS-1 細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,Western 印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)SCD1 過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

圖2 SCD1 過表達(dá)質(zhì)粒驗(yàn)證

2.3 過表達(dá)SCD1 逆轉(zhuǎn)IL-1β 造成的胰島β 細(xì)胞凋亡

為了探究過表達(dá)SCD1 能否緩解IL-1β 引起的胰島β 細(xì)胞凋亡增加,我們?cè)贗NS-1 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了SCD1 過表達(dá)質(zhì)粒24 h 后,用IL-1β 處理48 h 后進(jìn)行Tunel 染色。染色結(jié)果表明,IL-1β 處理會(huì)加劇β 細(xì)胞凋亡,過表達(dá)SCD1 顯著減少IL-1β 造成的β 細(xì)胞凋亡(圖3)。

圖3 過表達(dá)SCD1 逆轉(zhuǎn)IL-1β 造成的胰島β 細(xì)胞凋亡

2.4 過表達(dá)SCD1 逆轉(zhuǎn)炎性因子IL-1β 引起的胰島β 細(xì)胞的功能損傷

接著,我們探索了SCD1 能否逆轉(zhuǎn)IL-1β 造成的胰島β 細(xì)胞功能障礙。將SCD1 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入INS-1 細(xì)胞24 h 后,用IL-1β 處理24 h 進(jìn)行KSIS 的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,IL-1β 處理顯著抑制INS-1 細(xì)胞的KSIS 功能,而過表達(dá)SCD1 可以部分逆轉(zhuǎn)INS-1 細(xì)胞KSIS 功能損傷(圖4A) 和胰島素含量的下降(圖4B)。由于INS-1 細(xì)胞沒有GSIS 功能,我們進(jìn)一步在具有GSIS 功能的βTC-6 細(xì)胞(小鼠胰島β 細(xì)胞系) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果與INS-1 細(xì)胞類似,即炎癥因子IL-1β 顯著降低βTC-6 的GSIS 以及KSIS功能,而過表達(dá)SCD1 部分改善βTC-6 細(xì)胞胰島素分泌功能障礙(圖4C) 和胰島素含量的下降(圖4D)。以上結(jié)果說明,炎性因子IL-1β 可以通過抑制SCD1 的表達(dá)造成胰島β 細(xì)胞功能的下降。

圖4 過表達(dá)SCD1 逆轉(zhuǎn)炎性因子IL-1β 引起胰島β 細(xì)胞的功能損傷

3 討論

T2DM 是一種慢性炎癥狀態(tài)的代謝性疾病,炎癥不僅是導(dǎo)致T2DM 進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,也是引起胰島β 細(xì)胞功能障礙的重要因素[18]。T2DM 患者長期高糖刺激(糖毒性)、高脂刺激(脂毒性)可造成胰島慢性炎癥的發(fā)生,使得胰島局部浸潤的炎性細(xì)胞明顯增加[19]。炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞產(chǎn)生釋放大量促炎性細(xì)胞因子,其中,白介素-1β (IL-1β) 在T2DM 的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用。高濃度IL-1β 刺激會(huì)直接引起β 細(xì)胞損傷,并最終加速T2DM 的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激是IL-1β 介導(dǎo)β細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。據(jù)報(bào)道,胰島β 細(xì)胞SCD1產(chǎn)物油酸水平降低會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡。而油酸是一種抗氧化劑,通過阻止氧化應(yīng)激保護(hù)β 細(xì)胞避免脂毒性造成的損傷[25]。此外,上調(diào)SCD1表達(dá)能保護(hù)β 細(xì)胞避免飽和脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷;反之,抑制SCD1 的表達(dá)會(huì)進(jìn)一步增加飽和脂肪酸對(duì)β 細(xì)胞的損傷。這些證據(jù)均說明SCD1 與胰島β 細(xì)胞功能和存活有著密切的聯(lián)系,但是目前沒有關(guān)于SCD1 與炎性因子造成β 細(xì)胞損傷的關(guān)系報(bào)道。

我們觀察到炎性因子IL-1β 可以濃度依賴性降低SCD1 的蛋白表達(dá)水平,此時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾(如酪氨酸磷酸化) 在調(diào)節(jié)SCD1 表達(dá)方面發(fā)揮重要作用,推測(cè)可能影響了SCD1 的蛋白穩(wěn)定性。因?yàn)镮L-1β 刺激導(dǎo)致β 細(xì)胞內(nèi)SCD1 的表達(dá)下調(diào),因此我們希望探究在胰島β 細(xì)胞中過表達(dá)SCD1 能否逆轉(zhuǎn)IL-1β 刺激引發(fā)的胰島β 細(xì)胞凋亡和功能下降。結(jié)果表明,過表達(dá)SCD1 可以逆轉(zhuǎn)IL-1β 刺激造成的胰島β 細(xì)胞凋亡。研究已顯示,SCD1 的過表達(dá)可以保護(hù)細(xì)胞免于死亡,抑制SCD1會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡和凋亡,這與我們實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)SCD1 對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的胰島功能損傷發(fā)揮的保護(hù)作用和抗凋亡作用相一致。我們的結(jié)果顯示,SCD1還可以部分改善炎性因子IL-1β 引起的β 細(xì)胞GSIS 和KSIS 功能的下降和胰島素含量的降低。

SCD1 不僅能夠拮抗IL-1β 刺激的β 細(xì)胞凋亡和功能損傷,還可能在多種代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,如脂肪酸氧化、脂肪生成、產(chǎn)熱、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)等。文獻(xiàn)報(bào)道,SCD1 全身性敲除鼠可以預(yù)防高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖癥和肝脂肪變性,葡萄糖攝取和胰島素信號(hào)均增強(qiáng);雖然表型出現(xiàn)改善,但SCD1 的持續(xù)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致膳食小鼠模型發(fā)生肝脂肪變性。肝臟特異性敲除SCD1 小鼠會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的糖異生損傷和肝臟碳水化合物代謝物大量消耗。以上證據(jù)提示SCD1 在不同的組織發(fā)揮不同的作用,但其發(fā)揮相應(yīng)功能時(shí)的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述,過表達(dá)SCD1 可以改善炎性因子IL-1β 引起的β 細(xì)胞功能損傷。SCD1 可以保護(hù)和維持胰島β 細(xì)胞的生物學(xué)功能,這也為預(yù)防和治療糖尿病提供了新的治療靶點(diǎn)。