LncRNA BLACAT1 調(diào)節(jié)miR-324-5p/MAP4K3 軸對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

廖運(yùn)國 ,唐梓瑜 ,李超 ,蒲嘉騏 ,邱世香 ,楊甜

1南充市中心醫(yī)院介入醫(yī)學(xué)科 四川省南充市,637000 2南充市高坪區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科 四川省南充市,637100

肝癌是一種常見的惡性腫瘤,其具有早期癥狀不明顯,發(fā)生發(fā)展較快等特點(diǎn),在我國的發(fā)病率和死亡率都很高[1]。隨著科技進(jìn)步,常規(guī)的肝癌治療方法如手術(shù)、放化療等有所改進(jìn)和提高,但是治療效果仍然不是很理想,給人們的心理和生理帶來了極大的負(fù)擔(dān)[2]。因此尋找更加有效的治療肝癌的方法十分重要。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,LncRNA) 是一種長度超過200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA。既往研究發(fā)現(xiàn),在肝癌患者組織和血清中有大量異常表達(dá)的LncRNA,其中有一些LncRNA 被證實(shí)是抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子[3-5]。

已有研究報(bào)道,長鏈非編碼RNA 膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1 (long chain noncoding RNA bladder cancer associated transcript 1,LncRNA BLACAT1) 位于人類染色體1q32.1 的基因座上,其在人肝癌腫瘤和細(xì)胞中都過表達(dá),抑制BLACAT1 具有抑制肝癌腫瘤的作用[6]。在肝癌中下調(diào)miR-324-5p 可促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲[7],而絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3 (mitogen activated protein kinase kinase kinase kinase 3,MAP4K3) 下調(diào)可阻滯肝癌細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制惡性增殖[8]。本研究通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn),BLACAT1 與miR-324-5p 存在調(diào)控關(guān)系,miR-324-5p 與MAP4K3 可靶向結(jié)合。而BLACAT1能否通過調(diào)控miR-324-5p/MAP4K3 軸影響人肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲尚不明確。因此,本研究主要探究BLACAT1 對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響以及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2020 年6 月至2022 年12 月選取本院收治的50 例肝癌患者,其中男27 例,女23 例,年齡28～69 歲,收集手術(shù)中切除的癌組織及相應(yīng)的癌旁組織,并儲(chǔ)存在液氮中。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及其他相關(guān)抗癌治療。所有患者均簽署知情同意書,并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

人正常肝細(xì)胞(HL-7702) 和人肝癌細(xì)胞系(Huh-7、SMMC-7721、MHCC97L) 購自中國上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑

CCK-8 試劑盒(貨號(hào): CK04) 購自上海經(jīng)科化學(xué)公司;兔源一抗MAP4K3 (克隆號(hào): SB46b(HRP))、PCNA (克隆號(hào): IPO-38)、MMP2 (克隆號(hào): AB13a)、MMP9 (克隆 號(hào): 5C3)、c-Myc(克隆號(hào): 2D5)、Cyclin D1 (克隆號(hào): EP12) 以及二抗(貨號(hào): ab6721) 均購自Abcam 公司;LipofectamineTM2000 Reagent (貨號(hào): ab136465) 購自美國Invitrogen 公司;LncRNA BLACAT1 敲低質(zhì)粒(si-BLACAT1) 及對照 (si-NC),miR-324-5p抑制劑 (miR-324-5p inhibitor) 及對照 (miRNC)、LncRNA BLACAT1 及miR-324-5p 引物購自廣州RiboBio。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HL-7702 和Huh-7、SMMC-7721、MHCC97 L 細(xì)胞置于含10 % 胎牛血清、1 % 青-鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中,在37 ℃、5 % CO2的穩(wěn)定環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng),定期觀察,每3 天更換一次培養(yǎng)基,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到85 %以上時(shí),消化傳代,收集對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR) 法檢測BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達(dá)

使用Trizol 試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA,將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄條件: 16 ℃30 min;42 ℃30 min;75 ℃,15 min。以cDNA 為模板上RT-qPCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL,其中Taq/RTase Mix Ⅱ2 μL,2 ×One Step RT-PCR Buffer 25 μL,上下游引物(10 μmol/L) 各1 μL,加雙蒸水至50 μL。BLACAT1: 正向引物為5′-ACAGAGAGTGGCCTGAT-3′,反向引物為5′-ATCCTTCCAAATCCCCTACG-3′;miR-324-5p: 正向引物為5′-GAGGCGAAGCCCTGGTATG-3′,反向引物為5′-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3′;MAP4K3 mRNA:正向引物為5′-AACTTCCCGACAGTGAGGTT-3′,反向引物為 5′-CACCTTGGTGTCCTTGTCCAT-3′;GAPDH: 正向引物為5′-CCTTCCGTGTCACT-3′,反向引物為5′-GCCTGCTTCACCACCTTC-3′;U6: 正向引物為5′-AACGCTTCACGAATTGCGT-3′,反 向引物為5′-CTCGCTTCGGCACACA-3′。分別以GAPDH、U6 為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT計(jì)算不同組織和細(xì)胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對數(shù)期的Huh-7 細(xì)胞分為ctrl 組(正常培養(yǎng)的Huh-7 細(xì)胞)、si-NC 組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-BLACAT1 組(轉(zhuǎn)染si-BLACAT1)、si-BLACAT1 +miRNC 組(si-BLACAT1 和miR-NC 共轉(zhuǎn)染)、si-BLACAT1+miR-324-5p inhibitor 組 (si-BLACAT1 和miR-324-5p inhibitor 共轉(zhuǎn)染)。按照脂質(zhì)體法(Lipofectamine 2000) 操作步驟對上述各組Huh-7 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h。

1.6 RT-qPCR 法檢測各組細(xì)胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達(dá)

檢測各組Huh-7 細(xì)胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 的表達(dá),具體操作同1.4。

1.7 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖

各組細(xì)胞以1 ×104個(gè)/孔接種到96 孔板中。分別將細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h 后,棄去細(xì)胞上清液,且在指定的時(shí)間點(diǎn)向每個(gè)孔中加入含有10 μL CCK-8 溶液的100 μL 完全培養(yǎng)基。孵育2 h 后,使用酶標(biāo)儀檢測吸光度。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移

取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞,將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至5 ×105個(gè)/mL,接種到35 mm 培養(yǎng)皿中,定期孵育直到大約90 %匯合。采用20 μL 移液器槍頭進(jìn)行劃痕,后置于37 ℃,5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后,顯微鏡下分別拍照記錄0、24 h 時(shí)細(xì)胞的劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h 時(shí)劃痕寬度-24 h 時(shí)劃痕寬度)/0 h 時(shí)劃痕寬度×100 %。

1.9 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲

取各組干預(yù)24 h 的細(xì)胞,用胰蛋白酶消化,離心,之后制成細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度為1 ×105個(gè)/孔。取-20 ℃保存的基質(zhì)膠放4 ℃過夜融化后稀釋,每小室加入100 μL 基質(zhì)膠稀釋液,置37 ℃,5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h,使其呈干膠狀。將Transwell 小室放入6 孔板中,取細(xì)胞懸液加入上室,下室加入10 % FBS 的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出下室,棄上清,甲醇固定。晾干后,結(jié)晶紫染色后清洗,將小室倒置于顯微鏡上,每孔隨機(jī)選5 個(gè)不同區(qū)域,在顯微鏡下觀察拍照,Image-J 圖像分析軟件計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲率(%)=下室細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)量×100 %。

1.10 Western 印跡檢測蛋白表達(dá)

利用RIPA 裂解緩沖液充分裂解各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度并使蛋白煮沸變性。每個(gè)樣品取20 μg 蛋白進(jìn)行電泳分離蛋白,100 V 恒壓轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜上,用5 %的脫脂牛奶封閉2 h,將膜與一抗MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc、Cyclin D1、GAPDH,在4 ℃孵育過夜,再將膜與HRP 偶聯(lián)的羊抗兔二抗在室溫下孵育2 h,棄去液體,洗滌3 次,加入ECL 試劑觀察蛋白質(zhì)印跡,Image J 軟件評(píng)估蛋白的灰度值。

1.11 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

構(gòu)建BLACAT1 野生型質(zhì)粒(BLACAT1-WT)和突變型質(zhì)粒 (BLACAT1-MUT),將BLACAT1-WT 和BLACAT1-MUT 分別與miR-NC 或miR-324-5p mimic 共轉(zhuǎn)染于Huh-7 細(xì)胞,48 h 后,檢測熒光素酶活性。

構(gòu)建MAP4K3 野生型質(zhì)粒(MAP4K3-WT) 和突變型質(zhì)粒(MAP4K3-MUT),將MAP4K3-WT 和MAP4K3-MUT 分別與miR-NC 或miR-324-5p mimic共轉(zhuǎn)染于Huh-7 細(xì)胞,48 h 后,檢測熒光素酶活性。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

Graphpad Prism 7.0 軟件用于分析數(shù)據(jù)。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()。單因素方差分析用于多組間的比較,進(jìn)一步兩組間的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組織和細(xì)胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達(dá)比較

RT-qPCR 結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,肝癌組織中BLACAT1、MAP4K3 mRNA 表達(dá)顯著增加,miR-324-5p表達(dá)顯著降低(P＜0.05) (表1)。

表1 比較組織中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達(dá)(,n=50)

表1 比較組織中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達(dá)(,n=50)

與癌旁組織比較,*P＜0.05

為了進(jìn)一步明確BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用,經(jīng)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測其在不同肝癌細(xì)胞(SMMC-7721、MHCC97L、Huh-7) 和HL-7702 細(xì)胞中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示與HL-7702 細(xì)胞相比,Huh-7、SMMC-7721、MHCC97L 細(xì) 胞BLACAT1、MAP4K3 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05),miR-324-5p表達(dá)顯著降低(P＜0.05),以Huh-7 細(xì)胞中變化最為顯著并作為后續(xù)研究對象(圖1)。

圖1 細(xì)胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達(dá)比較

2.2 各組 Huh-7 細(xì)胞中 BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達(dá)比較

轉(zhuǎn)染si-BLACAT1 以及si-BLACAT1 和miR-324-5p inhibitor 共轉(zhuǎn)染后,經(jīng)RT-qPCR 驗(yàn)證各組轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果顯示,與ctrl 組、si-NC 組比較,si-BLACAT1 組Huh-7 細(xì)胞中BLACAT1、MAP4K3 mRNA 表達(dá)顯著降低、miR-324-5p表達(dá)顯著升高(P＜0.05);與si-BLACAT1 組、si-BLACAT1+miR-NC組比較,si-BLACAT1+miR-324-5p inhibitor 組Huh-7細(xì)胞中BLACAT1 表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),MAP4K3 mRNA 表達(dá)顯著升高(P＜0.05),miR-324-5p表達(dá)顯著降低(P＜0.05,圖2)。

圖2 各組Huh-7 細(xì)胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表達(dá)比較

2.3 各組Huh-7 細(xì)胞增殖能力比較

經(jīng)CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測LncRNA BLACAT1 調(diào)控miR-324-5p/MAP4K3 軸對細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,與ctrl 組、si-NC 組比較,si-BLACAT1 組Huh-7 細(xì)胞A450值顯著降低(P＜0.05);與si-BLACAT1 組、si-BLACAT1+miR-NC 組比較,si-BLACAT1 +miR-324-5p inhibitor 組Huh-7 細(xì)胞A450值顯著升高(P＜0.05,表2)。

表2 各組Huh-7 細(xì)胞A450值比較

2.4 各組Huh-7 細(xì)胞遷移能力比較

通過敲低BLACAT1 表達(dá)以及敲低BLACAT1的同時(shí)抑制miR-324-5p 表達(dá),經(jīng)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測其對細(xì)胞遷移的影響。

結(jié)果顯示,與ctrl 組、si-NC 組相比較,si-BLACAT1 組Huh-7 細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低(P＜0.05);與si-BLACAT1 組、si-BLACAT1+miR-NC組相比較,si-BLACAT1+miR-324-5p inhibitor 組Huh-7 細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高(P＜0.05) (圖3)。

2.5 各組Huh-7 細(xì)胞侵襲情況比較

經(jīng)Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測LncRNA BLACAT1 調(diào)控miR-324-5p/MAP4K3 軸對細(xì)胞侵襲的影響,結(jié)果顯示,與ctrl 組、si-NC 組比較,si-BLACAT1 組Huh-7 細(xì)胞侵襲率顯著降低 (P＜0.05);與si-BLACAT1 組、si-BLACAT1+miR-NC 組比 較,si-BLACAT1 +miR-324-5p inhibitor 組Huh-7 細(xì)胞侵襲率顯著升高(P＜0.05,圖4)。

圖4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測Huh-7 細(xì)胞侵襲(×100)

2.6 各組 Huh-7 細(xì)胞中 MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)比較

采用Western 印跡法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染si-BLACAT1 以及si-BLACAT1 和miR-324-5p inhibitor 共轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞MAP4K3 以及與增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,與ctrl 組、si-NC 組比較,si-BLACAT1 組Huh-7 細(xì)胞MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc、Cyclin D1 蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05);與si-BLACAT1 組、si-BLACAT1+miR-NC組比較,si-BLACAT1 +miR-324-5p inhibitor 組Huh-7 細(xì)胞MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc、Cyclin D1 蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05) (圖5,表3)。

圖5 Western 印跡檢測Huh-7 細(xì)胞中MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)

表3 各組Huh-7 細(xì)胞中MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)比較

2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果

為了驗(yàn)證miR-324-5p 分別與LncRNA BLACAT1、MAP4K3 之間的靶向關(guān)系,本研究分別利用Starbase、TargetScan 網(wǎng)站預(yù)測BLACAT1 與miR-324-5p、miR-324-5p 與MAP4K3 的結(jié)合位點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)證實(shí)LncRNA BLACAT1 與miR-324-5p 之間的靶向關(guān)系,結(jié)果顯示,與miR-NC 和BLACAT1-WT 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-324-5p mimic 和BLACAT1-WT 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低 (P＜0.05);與miR-NC 和BLACAT1-MUT 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-324-5p mimic 和BLACAT1-MUT 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-324-5p 與MAP4K3 之間的靶向關(guān)系,結(jié)果顯示,與miR-NC 和MAP4K3-WT 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-324-5p mimic 和MAP4K3-WT 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05);與miRNC 和MAP4K3-MUT 共轉(zhuǎn)染組比較,miR-324-5p mimic 和MAP4K3-MUT 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,圖6)。

圖6 BLACAT1、miR-324-5p 和MAP4K3 之間關(guān)系鑒定

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)現(xiàn)時(shí)通常已經(jīng)處于發(fā)展的終末期,患者的生存質(zhì)量嚴(yán)重下降,嚴(yán)重威脅著人們的生命健康[9]。隨著醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展,肝癌患者的生存率雖然有一定的提高,但術(shù)后復(fù)發(fā)率依然較高,放化療的治療效果也并不理想,肝癌的治療并未得到根本改善[10]。因此,尋找更加經(jīng)濟(jì)高效的治療方法對肝癌的治療有著重要的意義。

研究表明,LncRNA 參與了多種疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控過程,在肝癌治療中的地位不言而喻。有研究證實(shí),LncRNA TPT1-AS1 敲低可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]。還有研究表明,LncRNA NEAT1 在肝癌組織中表達(dá)增加,下調(diào)LncRNA NEAT1 可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞周期,進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲[12]。研究發(fā)現(xiàn),LncRNA BLACAT1 在多種癌癥中異常表達(dá),包括宮頸癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等,例如,有研究表明,敲降LncRNA BLACAT1 顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[13]。Liao 等[14]研究證實(shí),BLACAT1 在前列腺癌組織中的表達(dá)異常升高,敲低BLACAT1 可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。但LncRNA BLACAT1 在肝癌中的表達(dá)以及作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過RTqPCR 實(shí)驗(yàn)檢測,結(jié)果顯示在肝癌組織和細(xì)胞中BLACAT1 表達(dá)增加,經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-BLACAT1 后,得出敲減BLACAT1 可降低Huh-7 細(xì)胞的A450值、侵襲率、遷移率、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc和Cyclin D1 表達(dá),提示敲減BLACAT1 可降低肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。這與上述研究結(jié)果一致[13-14]。

LncRNA 的分子功能是多方面的,可充當(dāng)miRNA 海綿,而miRNAs 進(jìn)一步通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),從而控制多種生物學(xué)功能。微小RNA (microRNA,miRNA) 是一類含有15～18 個(gè)核苷酸的非編碼RNA,在人類癌癥進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[15]。miR-324-5p 是一種miRNA,其定位于17p13.1,有研究證實(shí),過表達(dá)miR-324-5p 在體外顯著抑制了膽囊癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,并阻礙了膽囊癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移[16]。大量研究證實(shí)LncRNA 可以靶向miRNA 對癌癥細(xì)胞起到調(diào)控作用[17]。有研究表明,LINC00491 可通過調(diào)控miR-324-5p/ROCK1 抑制肝癌細(xì)胞增殖、克隆和遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡[18]。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BLACAT1 可靶向調(diào)節(jié)miR-324-5p,通過RT-qPCR檢測組織和細(xì)胞中基因表達(dá),得出相比于人正常肝細(xì)胞,肝癌細(xì)胞BLACAT1 表達(dá)升高,miR-324-5p表達(dá)顯著降低,進(jìn)一步說明了其靶向關(guān)系,而敲減BLACAT1 可上調(diào)miR-324-5p 表達(dá),且下調(diào)miR-324-5p 減弱了敲減BLACAT1 對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。提示敲減BLACAT1 可能通過上調(diào)miR-324-5p 抑制Huh-7 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。

本研究還表明MAP4K3 是miR-324-5p 的靶標(biāo),進(jìn)一步的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了二者的靶向關(guān)系。MAP4K3 是絲裂原激活蛋白激酶的一個(gè)上游激活因子,其參與細(xì)胞增殖、凋亡、周期調(diào)控等多種生物學(xué)行為,在多種腫瘤中高表達(dá),加速腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化[19]。有研究表明,miR-199a-5p 和let-7c 通過靶向MAP4K3 來抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[20]。本研究與前人研究趨勢相吻合,MAP4K3 mRNA 在肝癌組織及細(xì)胞中顯著增加,而敲減BLACAT1 可下調(diào)MAP4K3 蛋白表達(dá),下調(diào)miR-324-5p 減弱了敲減BLACAT1 對MAP4K3 蛋白表達(dá)的抑制作用,表明干擾BLACAT1 通過miR-324-5p/MAP4K3 軸抑制Huh-7 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。然而本研究尚存在不足之處,僅僅在一種細(xì)胞水平上驗(yàn)證了BLACAT1/miR-324-5p/MAP4K3 軸對肝癌增殖、遷移和侵襲的影響,并未在多種細(xì)胞以及制備荷瘤小鼠在動(dòng)物體內(nèi)水平上進(jìn)行探討,后續(xù)研究將進(jìn)行更深一步的探索。

綜上所述,在肝癌組織以及細(xì)胞中,BLACAT1、MAP4K3 表達(dá)升高,miR-324-5p 表達(dá)降低,敲減BLACAT1 可能通過靶向miR-324-5p 并下調(diào)MAP4K3 抑制Huh-7 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。BLACAT1/miR-324-5p/MAP4K3 軸可能成為治療肝癌的一種新的靶點(diǎn)。