PD-1 抑制劑通過(guò)STAT6 介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲

曲軍,陳科,陳宋林,馮湖文,謝亞彬

海南省腫瘤醫(yī)院泌尿外科 海口市,570311

據(jù)統(tǒng)計(jì),前列腺癌是全球第二大致命的男性惡性腫瘤,也是全球第五大癌癥死亡原因[1]。由于前列腺癌具有早期不易察覺(jué),預(yù)后性差等特點(diǎn),其死亡率一直居高不下[2],因此探索前列腺癌的發(fā)病機(jī)制,尋找有效的分子標(biāo)記物或藥物治療的靶點(diǎn)對(duì)于前列腺癌的治療至關(guān)重要。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (tumor-associated macrophages,TAM) 可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移,約占前列腺腫瘤總免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的30 %[3],通過(guò)發(fā)揮其免疫抑制作用,驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞耐藥性并促進(jìn)其逃逸、轉(zhuǎn)移、侵襲和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]。一般來(lái)說(shuō),前列腺癌組織中的TAM 密度越高,預(yù)后越差并且患者的總生存期越差[5]。研究表明,在前列腺癌組織中存在大量的M2 型TAM 浸潤(rùn),可能與抑制腫瘤免疫微環(huán)境、促進(jìn)腫瘤耐藥有關(guān)[6]。STAT6 是M2 型巨噬細(xì)胞活化過(guò)程中的關(guān)鍵因子[7],Tariq 等[8]發(fā)現(xiàn),STAT6 磷酸化介導(dǎo)TAM 的M2 型極化在促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,抑制STAT6 的磷酸化將抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

PD-1/PD-L1 通路是目前腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn),與腫瘤的免疫逃逸有關(guān),研究表明PD-1 可以影響免疫細(xì)胞在腫瘤中的浸潤(rùn)從而影響腫瘤的發(fā)展[9]。但是通過(guò)抑制PD-1 是否改變TAM 極化,從而影響前列腺癌的發(fā)展目前仍不清楚,STAT6 磷酸化在TAM 極化中發(fā)揮關(guān)鍵作用,抑制PD-1 是否改變STAT6 的活化狀態(tài)尚待闡明。在本研究中,我們旨在研究PD-1、STAT6 與M2 型TAM 標(biāo)志物CD206 在前列腺癌組織中的表達(dá),并進(jìn)一步探索抑制PD-1 對(duì)于腫瘤免疫微環(huán)境的影響,為將來(lái)進(jìn)一步探索前列腺癌的治療方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

收集了2020 年7 月至2022 年5 月在我院就診的25 例前列腺腫瘤患者的癌組織及其癌旁組織(距腫瘤邊緣≥3 mm),患者此前均未接受放療和化療。取樣后立即放在凍存管并置于液氮中。所有患者術(shù)前均已簽署知情同意書(shū)。本研究在海南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的監(jiān)督下獲得批準(zhǔn)和實(shí)施。

1.2 細(xì)胞和主要試劑

人前列腺癌細(xì)胞DU145、THP-1 細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);AS1517499 與Camrelizumab 購(gòu)自美國(guó)MedChemexpress 公司;CD206、STAT6 和GAPDH 抗體購(gòu)自proteintech 公司;胎牛血清和RPMI 1640 培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Giboco 公司;IL4、佛波酯(PMA) 購(gòu)自sigma 公司;qRT-PCR 試劑盒(RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green 試劑)、IL-13、TGF-β 和iNOS ELISA 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;CCK8 試劑盒購(gòu)自Vazyme 公司;Transwell 小室購(gòu)自Corning 公司;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、PD-1、CD206 和STAT6 引物由上海生工生物工程有限公司合成;臺(tái)式低溫高速離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;ATC 實(shí)時(shí)熒光定量自動(dòng)化PCR 儀購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5 % CO2恒溫的濕潤(rùn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中,使用含10 % 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基對(duì)人THP 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。每3 天更換一次新鮮的培養(yǎng)基,并根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度和培養(yǎng)基的顏色變化及時(shí)更換新鮮的培養(yǎng)基,以確保細(xì)胞得到充足的營(yíng)養(yǎng)和細(xì)胞毒性物質(zhì)的清除。每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)是否正常,當(dāng)細(xì)胞的生長(zhǎng)密度達(dá)到70 %～80 %時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)時(shí)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.3.2 THP-1 細(xì)胞分化和給藥 將THP-1 接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,按照1 mL 細(xì)胞懸液含4 ×105個(gè)THP-1 細(xì)胞,添加20 μL PMA (100 ng/mL),將經(jīng)PMA 刺激貼壁轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求更換培養(yǎng)基。以上細(xì)胞分別加入Camrelizumab (50 nmol/L) 共孵育,同時(shí)加入IL-4 (45 ng/mL) 刺激48 h,分組為M0 組、M0+Camrelizumab 組、TAM 組、TAM+Camrelizumab 組;以上細(xì)胞分別加入AS1517499 (200 nmol/L) 共孵育,同時(shí)加入IL-4 (45 ng/mL) 刺激48 h,分組為M0 組、M0 +AS1517499 組、TAM 組、TAM+AS1517499 組。

1.3.3 qRT-PCR 檢測(cè)mRNA 的表達(dá) 依照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),分別采用Trizol 試劑從前列腺癌患者的腫瘤、癌旁組織以及細(xì)胞中提取總RNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照SYBR qPCR 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)指示,制備qRT-PCR 預(yù)混液。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。所用引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成,引物序列如下: GAPDH-F,5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3′,GAPDH-R,5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′;PD-1-F,5′-TGGATTTCCAGTGGCGAGAG-3′,PD-1-R,5′-TGACCTTGGGACCGTAGGAT-3′;CD206-F,5′-GCAGAAGGAGTAACCCACCC-3′,CD206-R,5′-TGGCAAATGAAGGCGTTTGG-3′;STAT6-F,5′-CTCGCTGGACAGAGCTACAGA-3′,STAT6-R,5′-CAACCCCTCACCTCGGCAA-3′。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá) 使用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白質(zhì),接著使用10 %的SDS-PAGE 預(yù)制膠對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離,電泳條件: 120 V 恒壓,60 min,提前使用甲醇活化PVDF 膜,使用恒流300 mA,50 min 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。為了消除非特異性結(jié)合,對(duì)PVDF 膜采用5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入一抗CD206(1 ∶1 000),STAT6 (1 ∶1 000),GAPDH (1 ∶2 500) 置于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。第二天,使用TBST 緩沖液清洗PVDF,隨后加入羊抗兔二抗(1∶2 000),室溫下孵育1 h。再用TBS 清洗PVDF 膜,加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL) 試劑,在室溫下避光孵育3 min,然后將PVDF 膜放入成像系統(tǒng)中采集圖片信息。最后,使用Image J 軟件計(jì)算PVDF 膜上蛋白質(zhì)帶的灰度值。

1.3.5 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá) 取處理后的M0 組、M0+Camrelizumab 組、M0+AS1517499組、TAM 組、TAM+Camrelizumab 組、TAM +AS1517499 組,吸取細(xì)胞培養(yǎng)液,離心并收集,按分別按照人ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-13、TGF-β 水平。

1.3.6 CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖水平 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的DU145 細(xì)胞分別與M0 組、M0+Camrelizumab 組、M0+AS1517499 組、TAM 組、TAM +Camrelizumab 組、TAM +AS1517499 組巨噬細(xì)胞共孵育12 h。隨后將DU145 細(xì)胞接種于96 孔板,每孔細(xì)胞數(shù)為1 ×104個(gè),置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h。向孔內(nèi)添加10 μL CCK-8 溶液進(jìn)行共孵育,2 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.3.7 Transwell 實(shí)驗(yàn) 使用8 μm 規(guī)格的Transwell 小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究。提前24 h 將基質(zhì)膠從-20 ℃冰箱內(nèi)取出,置于4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。次日,取50 μL 基質(zhì)膠緩慢加入Transwell 小室,靜置1 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞5 ×103個(gè),接種Transwell 小孔上室,在下室為1 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清),置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,讓細(xì)胞逐漸侵入Transwell 孔板下室。將Transwell 孔板從培養(yǎng)箱中取出,用無(wú)菌棉簽輕輕地擦去上室的細(xì)胞,PBS 緩沖液清洗2 次后,向下室加入1 mL 4 %的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞1 h,結(jié)晶紫染色30 min 后,使用顯微鏡觀察細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 21.0 和Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行比較,兩組之間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn),若P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌中PD-1、CD206 和STAT6 表達(dá)水平相關(guān)性比較

qRT-PCR 結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,癌組織中PD-1、CD206 和STAT6 表達(dá)水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) (圖1A)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,PD-1 和CD206 以及CD206和STAT6 的表達(dá)水平呈正相關(guān)(圖1B)。

2.2 PD-1 抑制劑對(duì)TAM 極化和相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響

qRT-PCR 和蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示,與M0組相比,TAM 組CD206 和STAT6 表達(dá)水平升高(P＜0.05);與TAM 組相比,TAM +Camrelizumab組STAT6 和CD206 表達(dá)水平降低(P＜0.05) (圖2)。ELISA 結(jié)果顯示,與M0 組相比,TAM 組IL-13、TGF-β 分泌水平增加,iNOS 分泌水平減少(P＜0.05);與TAM 組相比,TAM+Camrelizumab 組IL-13、TGF-β 分泌水平減少,iNOS 分泌水平增加(P＜0.05) (圖3)。

2.3 PD-1 抑制劑對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

CCK8 結(jié)果顯示,與M0 組 相比,TAM 組DU145 細(xì)胞增殖水平升高,在72 h 時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05);與TAM 組相比,TAM +Camrelizumab 組DU145 細(xì)胞增殖水平降低,在72 h 時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05) (圖4A)。

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與M0 組相比,TAM 組DU145 細(xì)胞侵襲能力增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) (圖4B)。

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與TAM 組相比,TAM+Camrelizumab 組DU145 細(xì)胞侵襲能力降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) (圖4B)。

2.4 STAT6 對(duì)TAM 極化和相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響

STAT6 抑制處理組結(jié)果顯示,與M0 組相比,TAM 組CD206 表達(dá)水平升高(P＜0.05);與TAM組相比,TAM+AS1517499 組CD206 表達(dá)水平降低(P＜0.05) (圖5)。

圖5 抑制STAT6 降低巨噬細(xì)胞向TAM 極化

ELISA 結(jié)果顯示,與M0 組相比,TAM 組IL-13、TGF-β 分泌水平增加,iNOS 分泌水平減少(P＜0.05);與TAM 組相比,TAM+AS1517499 組IL-13、TGF-β 分泌水平減少,iNOS 分泌水平增加(P＜0.05) (圖6)。

2.5 STAT6 對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

CCK8 結(jié)果顯示,與M0 組 相比,TAM 組DU145 細(xì)胞增殖水平升高,在72 h 時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異 (P＜0.05);與TAM 組相比,TAM +AS1517499 組DU145 細(xì)胞增殖水平降低,在72 h時(shí)表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05) (圖7A)。

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與M0 組相比,TAM 組DU145 細(xì)胞侵襲能力增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) (圖7B)。

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與TAM 組相比,TAM+AS1517499 組DU145 細(xì)胞侵襲能力降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) (圖7B)。

3 討論

目前在臨床上,前列腺癌治療方式主要包括根治性前列腺手術(shù)切除、放/化療法、內(nèi)分泌療法。此外,臨床常用雄激素剝奪療法,但容易發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌,并與患者較差的預(yù)后情況相關(guān)[10]。隨著近年來(lái)對(duì)腫瘤形成分子機(jī)制和腫瘤免疫微環(huán)境的深入研究,免疫治療取得了突破進(jìn)展。免疫療法可以重新調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng),恢復(fù)其識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。因此,探究新型腫瘤免疫標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)對(duì)于前列腺癌的免疫治療至關(guān)重要。

最近幾年研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1 信號(hào)通路可以介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,PD-L1 是免疫球蛋白基因家族的跨膜糖蛋白成員,主要在活化的T 和B 淋巴細(xì)胞中表達(dá),在多種人體腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[11],目前認(rèn)為,PD-1/PD-L1 抑制劑通過(guò)拮抗PD-1/PD-L1,調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性,尤其是阻斷腫瘤細(xì)胞對(duì)于T 細(xì)胞的負(fù)向調(diào)控作用,重新恢復(fù)效應(yīng)T 細(xì)胞的腫瘤殺傷功能,阻斷腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與前人的研究結(jié)果相一致,相比于前列腺癌旁組織,癌組織中PD-L1 的表達(dá)顯著增加。

腫瘤微環(huán)境 (tumor microenvironment,TME)被認(rèn)為是許多癌癥(包括前列腺癌) 發(fā)展的關(guān)鍵因素[13]。其中,TAM 作為先天免疫系統(tǒng)的主要組成部分,在慢性炎癥中起關(guān)鍵作用,是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞,占腫瘤質(zhì)量的50 %[14]。TAM 可通過(guò)釋放多種細(xì)胞因子和基質(zhì)蛋白酶直接促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移,或通過(guò)介導(dǎo)腫瘤血管生成和免疫抑制間接促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,TAM 已成為癌癥治療的重要靶點(diǎn)[15]。TAM 具有很強(qiáng)的環(huán)境依賴性和可塑性,分為兩種主要表型;經(jīng)典激活的M1 型通常被認(rèn)為具有抗腫瘤活性,而激活的M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)抑制腫瘤微環(huán)境中的炎癥和誘導(dǎo)血管生成以支持腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,前者主要分泌iNOS,后者主要分泌IL-13、TGF-β[16]。前列腺癌患者體內(nèi)TAM 的積累通常與預(yù)后不良、治療耐藥和疾病復(fù)發(fā)有關(guān)。Zhang 等[17]的研究表明,前列腺癌患者的腫瘤組織中存在大量的M2 型TAM,可能與腫瘤免疫抑制有關(guān)。與前人研究結(jié)果一致,本實(shí)驗(yàn)研究表明,在前列腺癌組織中CD206 水平升高,而CD206 主要在M2 型巨噬細(xì)胞中表達(dá),提示腫瘤組織中M2 型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)可能增加。近期研究表明,與局部前列腺癌相比,轉(zhuǎn)移性前列腺癌中CD206+巨噬細(xì)胞的比例更高[18]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的癌組織中CD206 水平增加,提示TAM 極化的失調(diào)可能影響了前列腺癌的轉(zhuǎn)移。另外,通過(guò)Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),PD-1 和CD206 表達(dá)水平呈正相關(guān),說(shuō)明PD-1 可能與TAM 的極化相關(guān)。有研究表明PD-L1 可能參與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制[19],下調(diào)PD-L1 可能會(huì)影響THP-1 巨噬細(xì)胞分化和極化,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD-1 抑制劑可以抑制CD206 的表達(dá)與IL-13、TGF-β 分泌水平,增加iNOS 分泌水平,即抑制PD-1 可抑制M2 型TAM 極化,并抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲。

STAT6 屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族。之前研究發(fā)現(xiàn),STAT6 通過(guò)控制早期EGR2 和IL-13誘導(dǎo)的MHCⅡ類(lèi)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)IL-4 誘導(dǎo)的M2 型巨噬細(xì)胞分化,這對(duì)于巨噬細(xì)胞M2 型極化是必不可少的[20],此外,STAT6 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2 型相關(guān)特定基因的表達(dá),例如Arg1 和Mrc1 等[21]。因此STAT6 可能在癌癥中充當(dāng)重要的免疫調(diào)節(jié)因子。Huang 等[22]研究發(fā)現(xiàn),促進(jìn)STAT6 磷酸化信號(hào)通路可以促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞極化,STAT6 參與調(diào)節(jié)M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá),本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CD206 和STAT6 的表達(dá)水平呈正相關(guān),表明M2 型TAM 極化可能受STAT6 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。通過(guò)使用STAT6 的抑制劑可以抑制M2 型TAM 極化,并抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲,說(shuō)明抑制PD-1 可能通過(guò)抑制STAT6 信號(hào)通路,改變腫瘤微環(huán)境中TAM 的極化從而影響癌癥的發(fā)展。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PD-1 抑制劑通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞向M2 型TAM 極化從而降低前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲,其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞STAT6 信號(hào)通路,這可為進(jìn)一步探討前列腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的思路。