內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性損傷中的作用機(jī)制

夏 克，符來想，陳前永

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是常見的骨關(guān)節(jié)退行性疾病，以關(guān)節(jié)軟骨變性、損傷、破壞及代償性軟骨下骨質(zhì)增生、骨贅形成為特征。 軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨組織中唯一的細(xì)胞類型， 參與軟骨組織功能及形態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì)代謝的調(diào)控。 軟骨細(xì)胞炎癥性損傷與OA 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1，2]，但相關(guān)的分子機(jī)制尚不清楚，臨床上也缺乏特異性的OA 治療藥物。 近些年的分子生物學(xué)研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）參與多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展；ERS 是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失去平衡后出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊蛋白聚集的病理狀態(tài)， 持續(xù)激活的ERS 是細(xì)胞凋亡的上游信號(hào)、 介導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。軟骨細(xì)胞凋亡是造成OA 進(jìn)程中軟骨細(xì)胞損傷的重要生物學(xué)因素， 相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)ERS 激動(dòng)劑促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡、 相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ERS 拮抗劑改善OA 大鼠的關(guān)節(jié)軟骨退行性變及細(xì)胞凋亡[3，4]。 基于此提出假說：ERS 調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡參與OA 進(jìn)程中軟骨骨細(xì)胞炎癥性損傷。 為驗(yàn)證該假說，筆者將在白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥性損傷模型中觀察ERS 對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，旨在為初步揭示OA 發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)OA 新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

小鼠軟骨細(xì)胞株ATDC5， 由中國武漢尚恩生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

IL-1β（ Sigma，美國）；c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） 拮抗劑SP600125（MCE，美國）； 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12（cysteinyl aspartate specific proteinase 12，Caspase-12）抑制劑氟甲基酮（Z-ATAD-fluoromethylketone，Z-ATADFMK）、CCK8 法增殖檢測試劑盒（Abcam，美國）；TdT介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）凋亡檢測試劑盒（熒光法）（上海碧云天生物公司， 中國）； 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 （glucose-regulated protein 78，GRP78）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、 磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（phosphorylation c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）、裂解型caspase-12（Cleaved caspase-12）、βactin 特異性一抗（CST，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理

將ATDC5 細(xì)胞復(fù)蘇后，在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液、用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。分為對(duì)照組、IL-1β 組、si-NC 組、si-NC+IL-1β 組、si-CHOP+IL-1β 組、溶劑對(duì)照組、溶劑+IL-1β 組、JNK 拮抗劑+IL-1β 組、Caspase-12抑制劑+IL-1β 組。

傳代后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行分組處理。對(duì)照組用不含藥物的培養(yǎng)液處理，IL-1β 組含有10 ng/mL IL-1β 的培養(yǎng)液處理，si-NC 組轉(zhuǎn)染NC siRNA，si-NC+IL-1β 組在含有10 ng/mL IL-1β 的培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)染NC siRNA，si-CHOP + IL-1β 組在含有10 ng/mL IL-1β的培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)染CHOP siRNA，溶劑對(duì)照組用含有二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（體積分?jǐn)?shù)0.1%）的培養(yǎng)液處理，溶劑+IL-1β 組用含有DMSO（體積分?jǐn)?shù)0.1%） 和10 ng/mL IL-1β 的培養(yǎng)液處理，JNK拮抗劑+IL-1β 組用含有10.0 μmol/L（DMSO 的體積分?jǐn)?shù)為0.1%）JNK 拮抗劑SP600125 和10 ng/mL IL-1β 的培養(yǎng)液處理，Caspase-12 抑制劑+IL-1β 組用含有2.0 μmol/L（DMSO 的體積分?jǐn)?shù)為0.1 %）Caspase-12 抑制劑Z-ATAD-FMK 和10 ng/mL IL-1β 的培養(yǎng)液處理。

1.2.2 細(xì)胞增殖的檢測

將5×103個(gè)ATDC5 細(xì)胞接種96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，貼壁24 h 后按照1.2.1 節(jié)進(jìn)行分組處理； 繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h 后將培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀， 檢測每孔細(xì)胞在波長490 nm 的光密度（optical density，OD）490nm值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的檢測

將1×104個(gè)ATDC5 細(xì)胞接種24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，貼壁24 h 后按照1.2.1 節(jié)進(jìn)行分組處理； 繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)液， 用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞后，采用試劑盒進(jìn)行TUNEL 染色和4"，6- 二脒基-2-苯基吲哚 （4"，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染，抗熒光猝滅封片液封片后在顯微鏡高倍（×400）視野下觀察。凋亡細(xì)胞顯綠色熒光，細(xì)胞核顯藍(lán)色熒光。計(jì)算凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 蛋白表達(dá)的檢測

將5×105個(gè)ATDC5 細(xì)胞接種12 孔培養(yǎng)板內(nèi)，貼壁24 h 后按照1.2.1 節(jié)進(jìn)行分組處理；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液、提取細(xì)胞蛋白，將含有20 μg 蛋白的樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中電泳，而后將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜， 將膜放入5%脫脂牛奶中、 搖床上室溫孵育1 h， 洗膜3 次后分別孵育GRP78（1 ∶500 稀釋）、CHOP（1 ∶600 稀釋）、p-JNK（1 ∶400 稀釋）、Caspase-12（1 ∶800 稀釋）及β-actin（1 ∶5 000 稀釋）的特異性一抗、4 ℃過夜。 次日洗膜3次后室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1 ∶4 000稀釋）1 h，再次洗膜3 次，在凝膠成像系統(tǒng)中對(duì)膜上的蛋白進(jìn)行顯影，以目的蛋白/β-actin 的灰度值分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 版本軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)， 多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β 組與對(duì)照組細(xì)胞增殖和凋亡水平比較

采用CCK8 法檢測細(xì)胞增殖的OD490nm水平，采用TUNEL 法檢測細(xì)胞的凋亡率。IL-1β 組ATDC5 細(xì)胞的OD490nm水平低于對(duì)照組 （0.51 ± 0.07vs1.06 ±0.12）， 細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組 （9.58%±1.24%vs1.35%±0.17%），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.853、14.703，P＜0.001）。

2.2 IL-1β 組與對(duì)照組ERS 標(biāo)志蛋白和凋亡蛋白表達(dá)水平比較

采用Western blot 檢測ERS 標(biāo)志蛋白GRP78 和ERS 凋亡蛋白CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12 的表達(dá)水平。IL-1β 組ATDC5 細(xì)胞中GRP78、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12 的相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組， 差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t= 9.339、17.206、11.667、10.217，P＜0.001）。 見圖1、表1。

表1 對(duì)照組與IL-1β 組ATDC5 細(xì)胞GRP78、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12 表達(dá)比較Tab.1 Comparison of GRP78，CHOP，p-JNK，Cleaved caspase-12 expression in ATDC5 cells between control group and IL-1β group

圖1 對(duì)照組和IL-1β 組ATDC5 細(xì)胞中GRP78、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12 的表達(dá)電泳圖Fig. 1 Electrophoretograms of GRP78， CHOP， p-JNK and Cleaved caspase-12 expression in ATDC5 cells of control group and IL-1β group

2.3 si-NC 組、si-NC + IL-1β 組、si-CHOP +IL-1β 組組間細(xì)胞增殖和凋亡水平比較

si-NC+IL-1β 組ATDC5 細(xì)胞增殖OD490nm水平低于si-NC 組，細(xì)胞凋亡率及CHOP 表達(dá)水平高于si-NC 組（t=14.378、10.001、14.536，P＜0.05）；si-CHOP+IL-1β 組ATDC5 細(xì)胞OD490nm水平高于si-NC+IL-1β 組，凋亡率及CHOP 表達(dá)水平低于si-NC+IL-1β組（t=16.250、9.395、11.757，P＜0.05）。 見圖2、表2。

圖2 si-NC 組、si-NC+IL-1β 組、si-CHOP+IL-1β 組CHOP表達(dá)電泳圖Fig. 2 Electrophoretograms of CHOP expression in si-NC group，si-NC+IL-1β group and si-CHOP+IL-1β group

2.4 溶劑對(duì)照組、溶劑+ IL-1β 組、JNK 拮抗劑+IL-1β 組組間軟骨細(xì)胞增殖和凋亡水平比較

溶劑+ IL-1β 組ATDC5 細(xì)胞增殖OD490nm水平低于溶劑對(duì)照組， 細(xì)胞凋亡率及p-JNK 的表達(dá)水平高于溶劑對(duì)照組（t=12.964、9.833、15.408，P＜0.05）；JNK 拮抗劑+ IL-1β 組ATDC5 細(xì)胞增殖OD490nm水平高于溶劑+IL-1β 組， 細(xì)胞凋亡率及p-JNK 的表達(dá)水平低于溶劑+ IL-1β 組 （t= 14.795、9.779、11.339，P＜0.05）。 見圖3、表3。

表3 溶劑對(duì)照組、溶劑+IL-1β 組、JNK 拮抗劑+IL-1β 組組間p-JNK 表達(dá)、增殖和凋亡比較Tab.3 Comparison of p-JNK expression，proliferation and apoptosis in solvent control group，solvent+IL-1β group and JNK antagonist+IL-1β group

圖3 溶劑對(duì)照組、 溶劑+IL-1β 組、JNK 拮抗劑+IL-1β 組p-JNK 表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoretograms of p-JNK expression in solvent control group，solvent+IL-1β group and JNK antagonist+IL-1β group

2.5 溶劑對(duì)照組、 溶劑+ IL-1β 組、Caspase-12 抑制劑+ IL-1β 組組間細(xì)胞增殖和凋亡水平比較

溶劑+ IL-1β 組ATDC5 細(xì)胞增殖OD490nm水平低于溶劑對(duì)照組， 細(xì)胞凋亡率及Cleaved caspase-12表達(dá)水平高于溶劑對(duì)照組 （t= 11.600、11.289、15.912，P＜0.05）；Caspase-12 抑制劑+IL-1β 組ATDC5 細(xì)胞增殖OD490nm水平高于溶劑+IL-1β 組，細(xì)胞凋亡率及Cleaved caspase-12 表達(dá)水平低于溶劑+IL-1β 組（t=13.080、9.117、11.658，P＜0.05）。見圖4、表4。

表4 溶劑對(duì)照組、溶劑+IL-1β 組、Caspase-12 抑制劑+IL-1β 組組間Cleaved caspase-12 表達(dá)、增殖和凋亡比較Tab. 4 Comparison of Cleaved Caspase-12 expression， proliferation and apoptosis in solvent control group， solvent + IL-1β group and Caspase-12 inhibitor+IL-1β group

圖4 溶劑對(duì)照組、 溶劑+IL-1β 組、Caspase-12 抑制劑+IL-1β 組Cleaved caspase-12 表達(dá)電泳圖Fig. 4 Electrophoretograms of Cleaved caspase-12 expression in solvent control group， solvent + IL-1β group and Caspase-12 inhibitor+IL-1β group

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的炎性損傷在OA 的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，在炎性介質(zhì)的作用下軟骨細(xì)胞發(fā)生過度凋亡會(huì)導(dǎo)致軟骨組織退行性變和破壞、 軟骨下骨贅形成。 臨床上常用的OA 治療藥物包括非甾體類藥物、軟骨營養(yǎng)和修復(fù)藥物， 但受限于OA 發(fā)病機(jī)制不明確，目前缺乏能夠抑制軟骨細(xì)胞凋亡的特異性O(shè)A 治療藥物[5，6]。多項(xiàng)國內(nèi)外OA 相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究采用10 ng/mL IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性損傷的方式建立OA 細(xì)胞模型[7～9]，筆者也采用該方法建立OA 細(xì)胞模型， 細(xì)胞模型增殖水平降低、 凋亡率增加的變化與OA 進(jìn)程中軟骨細(xì)胞凋亡的特征符合。 筆者將在該OA 細(xì)胞模型中研究軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。

細(xì)胞凋亡的調(diào)控途徑包括線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑、ERS 凋亡途徑。 ERS 是新近受到越來越多關(guān)注的凋亡調(diào)控機(jī)制[10，11]。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成轉(zhuǎn)運(yùn)、糖基化修飾、鈣離子再分布的調(diào)控；慢性炎癥、缺血缺氧、高糖等病理因素刺激會(huì)造成未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，進(jìn)而激活ERS。 適度的ERS 有助于維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定、保證細(xì)胞的適應(yīng)性存活； 但是持久且強(qiáng)烈的ERS 不利于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定， 會(huì)造成GRP78 表達(dá)增加并通過下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、加重組織損傷[12～14]。 既往OA 相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[4，15，16]、筆者研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均證實(shí)OA 軟骨組織及軟骨細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志基因GRP78 的表達(dá)水平均明顯增加，OA 進(jìn)程中存在ERS 的過度激活。 已有研究證實(shí)ERS 激動(dòng)劑對(duì)軟骨細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用，ERS 拮抗劑抑制OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞凋亡[3，4]，提示ERS 可能通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡的途徑參與OA 的發(fā)生發(fā)展，但ERS調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚不明確。

ERS 對(duì)細(xì)胞凋亡的途徑依賴于下游CHOP、JNK、Caspase-12 途徑，CHOP 通過調(diào)控下游B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 削弱細(xì)胞的抗凋亡能力、促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放及細(xì)胞凋亡；JNK 磷酸化為有活性的p-JNK及Caspase-12 裂解為有活性的Cleaved caspase-12均能作用于Caspase 級(jí)聯(lián)激活途徑， 引起Caspase-3激活并引起細(xì)胞凋亡[17，18]。 筆者研究在OA 軟骨細(xì)胞模型中檢測到CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12 的表達(dá)水平均增加， 提示OA 進(jìn)程中ERS 的激活可能引起下游CHOP 的高表達(dá)、JNK 的磷酸化活化、Caspase-12 的裂解后活化，進(jìn)而介導(dǎo)了促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證OA 細(xì)胞模型中ERS下游CHOP、JNK、Caspase-12 對(duì)凋亡的調(diào)控作用，筆者在OA 細(xì)胞模型中分別進(jìn)行了CHOP 表達(dá)的敲低、JNK 拮抗劑干預(yù)、Caspase-12 抑制劑干預(yù)， 經(jīng)上述干預(yù)后細(xì)胞的增殖水平增加、凋亡率降低，表明OA 細(xì)胞模型中ERS 激活通過下游CHOP、JNK、Caspase-12介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。

綜上所述，IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性損傷模型中ERS 通過CHOP、JNK 和Caspase-12 引起細(xì)胞凋亡。在OA 進(jìn)程中關(guān)鍵軟骨細(xì)胞在炎癥反應(yīng)的作用下會(huì)發(fā)生ERS 激活，激活的ERS 進(jìn)一步通過下游CHOP、JNK、Caspase-12 促進(jìn)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡。 根據(jù)以上結(jié)果， 軟骨細(xì)胞中ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與OA 的發(fā)病。