應用于3D 生物打印的甲基丙烯酸酐化明膠水凝膠相關理化性能的研究進展

吳海媚，丁 能，朱 鴷

三維（three-dimensional，3D）生物打印技術在過去十幾年里得到快速的發(fā)展，不同的打印技術日漸成熟[1]。3D 生物打印的核心是直接將負載細胞的材料打印成生物支架[2]。 它具有靈活的支架制造和再現(xiàn)自然組織3D 復雜結構的能力[3]。 因此，3D 生物打印技術在生物醫(yī)學工程等領域被廣泛應用。

生物墨水是打印的重要組成成分。明膠及其衍生物與不同類型的細胞（如成纖維細胞、間充質細胞、脂肪細胞等）及生長因子具有良好的生物相容性，是非常受歡迎的生物墨水[3]。 水凝膠是具有3D 結構的親水聚合物， 并具有類似于細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的多孔結構，有利于細胞的黏附、增殖、遷移和分化[4]，與細胞微環(huán)境極其相似[5]。 因此常被用于3D 生物打印支架材料，其理化性質是影響打印支架的生物和力學性能的關鍵。理想的水凝膠要求能快速可控交聯(lián)，有效促進細胞黏附、增殖分化和遷移[6]。天然來源聚合物形成的水凝膠與ECM 存在一定的相似性，可為細胞提供支架和生物行為上的支持，促進細胞增殖分化，但這類水凝膠機械性能較差，黏度較低，可打印性較差，而人工合成聚合物形成的水凝膠機械性能則更加可控[7]。 有些凝膠材料（聚乙烯醇、酸鈉等）經3D 打印與ECM 存在顯著的差異[8]。 甲基丙烯酸酐化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）水凝膠具有優(yōu)良的生物相容性及易調控的機械性能，引起了眾多研究人員的興趣。 目前，用于GelMA 的生物3D 打印技術包括立體光固化打印、擠出式打印及數(shù)字光固化打印， 由于擠壓成型生物打印技術具有過程可控、設備簡單、耗能較少等優(yōu)勢，更適合打印負載細胞材料[7，9，10]，通過光交聯(lián)精確地形成GelMA 3D 支架[4]。 由于GelMA 水凝膠機械性能非常弱，在3D 生物打印應用中受到一定的限制。許多研究者通過添加物質形成混合水凝膠以提升其生物和力學性能。 因此，文章對近年基于3D 生物打印的GelMA 水凝膠材料的改性進行綜述。

1 GelMA 水凝膠的制備

在生物制造領域中使用的明膠主要來源于哺乳動物，含有大量精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD） 序列和基質金屬蛋白酶（matrix-metalloproteinase，MMP）， 有利于細胞的黏附與重塑[3，11]。GelMA 由Van Den Bulck AI 等首次提出并制備[12]。GelMA 是通過明膠中氨基與甲基丙烯酸酐（methacrylic anhydride，MA） 在一定條件下反應得到的光敏聚合物[11]。此外，MA 的化學修飾過程涉及極少的氨基酸殘基，大部分功能性氨基酸序列沒有受到影響，這保證了GelMA 水凝膠良好的細胞黏附性能[13]。目前已報道很多GelMA 水凝膠的制備方法， 整個制備過程基本為先取明膠溶于（杜氏）磷酸鹽緩沖溶液[Dulbecco’s phosphate-buffered saline，（D）PBS]中，根據不同的取代度， 在50 ℃環(huán)境下加入所需量的MA溶液進行反應；在相同的環(huán)境中透析4 ～7 d，以去除殘留的MA 和甲基丙烯酸[4]；最后將透析液進行真空冷凍干燥獲得GelMA； 取一定量的GelMA 加入無毒光引發(fā)劑（常用LAP，Irgacure 2959），經紫外線照射形成GelMA 水凝膠。

許多研究證明，MA 的取代度、 引發(fā)劑的濃度及種類，GelMA 濃度及紫外線照射時間等因素都會影響到GelMA 水凝膠的孔隙率、彈性模量、降解度和溶脹率等物理性能及生物性能[13，14]。 李媛媛等[15]通過制備不同質量濃度的GelMA 水凝膠，經分析證明，隨著GelMA 的質量濃度增加，彈性模量明顯增加，但材料的吸水率、溶脹率、MA 的交聯(lián)率均降低，可能是因為大量引入明膠增大了空間位阻， 從而降低了交聯(lián)率；同時由于結構變得更加緊密， 材料的孔隙率明顯減小。 顧恒等[9]制備GelMA-明膠-海藻酸鈉復合水凝膠通過紫外光照射5 min 和10 min 對比下，復合凝膠的彈性模量增加70%，但其伸長率下降。高水平交聯(lián)的水凝膠可提供很好的打印形狀保真度，但會降低水凝膠的溶脹比，減小孔徑，減少細胞生存所需的氧氣和營養(yǎng)物質的擴散[16]。 考慮到生物墨水中光引發(fā)劑的濃度、種類及與活細胞的長期接觸，可能對細胞產生一定的影響。 Xu H 等[14]通過打印含固定細胞濃度和不同濃度的光引發(fā)劑的GelMA， 結果顯示， 使用Irgacure 2959 和LAP 時， 細胞活力通常會隨著光引發(fā)劑濃度和打印時間的增加而降低；雖然低濃度光引發(fā)劑有利于提高細胞活力，但可能難以完全交聯(lián)；此外發(fā)現(xiàn)，Irgacure 2959 固化的GelMA 樣品比LAP 固化的樣品孔徑稍大，降解速度更快，溶脹率更大。但另有研究表明，Irgacure 2595 對光敏感性較低，LAP 凝膠化速度是Irgacure 2595 的10 倍。 快速凝膠化可對負載細胞的損壞程度降到最低[17]。

2 基于GelMA 復合水凝膠研究

3D 生物打印過程的打印氣壓、噴頭移動速度、噴頭高度等工藝參數(shù)都會對打印支架產生影響[9，18]，但從材料化學改性角度來改善支架相關性能仍是研究的焦點。純GelMA 水凝膠具有較差的力學性能，不利于進行3D 打印形成支架[9]。 對GelMA 制備過程改變某一因素提高材料的某一性能的同時，有可能會降低或破壞其他性能[13]。針對水凝膠的加工性能和生物相容性的要求往往是相反的[16]。 因此，研究人員經過不斷的探索，通過引入納米材料，天然聚合物及合成聚合物進行化學修飾以改善GelMA 材料的物理性能及材料的生物相容性能，使水凝膠同時滿足相關應用功能和3D 生物打印制備需求。

2.1 納米材料復合型

高濃度的GelMA 水凝膠剛度顯著提升， 但其孔隙率的減小卻顯著影響了細胞活力、 增殖分化和遷移[19]。 很多研究已證明，低濃度的GelMA 具有高孔隙率，有利于細胞的增殖與營養(yǎng)物質的輸送，但不能滿足生物墨水應具有的足夠流變性能標準[20]。納米材料也是當前的研究熱點， 通過在低濃度的GelMA 中摻入納米材料， 可增強GelMA 的機械性能與打印適應性。 一些納米材料還可為GelMA 賦予良好的導電性能，在構建3D 導電組織領域具有巨大的應用潛力。

2.1.1 納米纖維

納米纖維可增強水凝膠的壓縮模量，可作為細胞生長膠原纖維進行設計。 纖維素納米纖維（cellulose nanofiber，CNF） 是主要由植物纖維制備而成的納米纖維材料，因其具備增強性能和保水性等特性而被廣泛使用。Shin S 等[20]將GelMA 與CNF 溶液混合制備5種不同CNF 濃度的生物墨水，發(fā)現(xiàn)隨著CNF 濃度的增加，GelMA 溶液的黏度逐漸增加，表現(xiàn)出剪切稀化行為，打印形狀保真度得到提高，復合凝膠的壓縮模量也得到了十幾倍的增加。經過體外細胞毒性實驗表明， 該復合水凝膠無細胞毒性， 細胞活性保持穩(wěn)定。Cernencu AI 等[3]從魚皮和牛皮提取明膠制備GelMA與CNF 混合， 經測試表明生物墨水的黏度和支架培養(yǎng)細胞的存活率均有所提高。

細菌纖維素又稱微生物纖維素，相比植物纖維素具有更高的純度，并具有良好的生物相容性和生物降解性。 細菌納米纖維素（bacterial nanocellulose，BNC）是由相互連接的纖維素帶組成[21]。Wu Z 等[21]制備含有海藻酸鈉和BNC 的GelMA 復合水凝膠，可以保持支架固有的形狀，具有良好的形狀保真度，提高了水凝膠的壓縮模量， 證實了BNC 可以作為生物墨水的機械增強劑和流變改性劑。 同時由于BNC 的多孔納米結構和豐富的羥基官能團使其活性催化層與基底結合緊密，材料的導電性明顯增強，并有效促進細胞的黏附。

2.1.2 納米金屬

許多金屬納米顆粒（金、銀、氧化鐵等）具有優(yōu)秀的導電性，并可以提高材料的力學性能。 Boularaoui S等[22]通過制備金納米顆粒（gold nanoparticle，AuNP）/GelMA 復合生物墨水進行機械測試，結果發(fā)現(xiàn)，AuNP改善了GelMA 的流變性， 同時增加了生物墨水的導電性，可為細胞提供所需電信號。此外，納米銀是一個熱門的研究元素。 納米銀可以調節(jié)細菌的行為、代謝和生長，具有杰出的抗菌性能，廣泛應用于水凝膠敷料領域[23]。Cao C 等[24]制備GelMA/單寧酸（tannic acid，TA）-聚磷酸鹽 （polyphosphate，Poly）-銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）復合水凝膠，證明AgNPs的引入不僅提高了GelMA 水凝膠的可受最大應力，同時提高了水凝膠的光熱性能，進一步提高了水凝膠的抗菌活性， 通過控制AgNPs 的引入量使水凝膠具有良好的細胞相容性。 銀納米線 （silver nanowire，AgNW）具有優(yōu)良的導電性和柔韌性，Ha JH 等[18]在GelMA/膠原蛋白復合水凝膠中引入AgNW，經過流變性能檢測證明AgNW 有效提高了復合水凝膠的黏彈性機械強度。在通電下，內部離子移動，水凝膠內外之間表現(xiàn)出滲透壓，導致質量減少，證明該復合水凝膠系統(tǒng)可通過收縮和膨脹過程來控制分子的釋放。目前銀納米材料與GelMA 的研究雖多，但結合3D 生物打印技術的相關研究甚少，仍需要進一步的探索。

2.1.3 其他納米材料

基于其他納米材料復合型GelMA 水凝膠的研究很多， 比如納米黏土和納米羥基磷灰石（nanocrystalline hydroxyapatite powders，nHAP）等。 兩者都具有良好的生物相容性等特性。納米黏土是一種來源于天然無機礦物制成的層狀硅酸鹽， 厚度和直徑分別為1 nm 和25 nm 的圓盤形納米顆粒[25]。基于納米黏土的觸變性，可以容易地打印復雜的支架[26]。Gao Q 等[26]將不同濃度的納米黏土與GelMA 混合制備的生物材料墨水，經測試表明，GelMA/納米黏土墨水的黏度遠高于純GelMA 或納米黏土的黏度。后續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，添加納米黏土可以提高孔隙率，降低降解率，其極限強度和壓縮模量隨著納米黏土的濃度增加而增強，并證實納米黏土有利于細胞的附著和生長。 Das S 等[27]采用水熱法合成不同粒徑的nHAP 粉末，以不同濃度摻入預交聯(lián)的GelMA 水凝膠中，通過定制的擠出式3D 打印機進行打印。研究發(fā)現(xiàn)，隨著nHAP 含量的增加，水凝膠的壓縮模量和最大應力均增大，但由于孔隙度和孔體積降低使得水合度逐漸降低， 吸水率也逐漸降低，此外，生物酶降解速率也顯著降低。

在納米材料與水凝膠的結合研究中，獲得了令人滿意的結果。 材料的機械性能、3D 打印結構保真度、黏附性能等都獲得顯著的提升，可見納米復合水凝膠具有很大的應用前景。但含有大量不能降解的納米材料可能面臨著細胞毒性的風險，從而限制其在體內的長期應用。

2.2 天然聚合物復合型

天然聚合物具有優(yōu)異的生物相容性、生物降解性及抗菌性， 因此天然聚合物被廣泛應用于傷口敷料，皮膚組織工程等領域。研究人員通過不斷地探索尋找符合要求的天然聚合物來改善打印支架的相關性能，比如膠原蛋白、纖維蛋白、殼聚糖及多糖等。殼聚糖及其衍生物是近年材料研究的熱門元素。殼聚糖羧甲基化不僅保留本身親水特性，而且提高了水溶性和生物活性，并具有良好的抗菌性能[28]。 Wang L 等[28]將羧甲基殼聚糖 （carboxymethyl chitosan，CMCS） 與GelMA復合， 證明CMCS 提高了水凝膠支架的平均孔徑、模量和黏度，并促進細胞的增殖和分化。

膠原蛋白是人體的主要結構蛋白， 具有高度活性、易化學修飾等優(yōu)點[29]。 Stratesteffen H 等[29]將Ⅰ型膠原蛋白與GelMA 水凝膠混合， 在水凝膠中形成獨特的毛細管結構，在GelMA/膠原蛋白水凝膠中，人間充質干細胞擴散增強，并隨著膠原蛋白增加，水凝膠的剛度和儲能模量進一步增加。 Shi Y 等[30]將摻有絡氨酸酶（Ty） 的膠原蛋白與GelMA 制成新型生物墨水，經黏度測試發(fā)現(xiàn)，GelMA/Col-Ty 的儲能模量高于GelMA/Col，并隨著Ty 的濃度升高，儲能模量越高。該研究表明Ty 的酶促交聯(lián)可提高生物墨水的強度，但濃度太高會降低細胞活力， 經過組織學分析表明，Ty能夠抑制傷口肉芽的生長，有效促進真皮的形成。 纖維蛋白加工簡易， 基于纖維蛋白的水凝膠與ECM 的力學相似度高，且具有良好的細胞相容性[31]。Na K 等[10]將由蠶絲精制具有高生物相容性、出色的機械性能及不會產生免疫反應的絲素蛋白 （silk fibroin，SF）與GelMA 混合進行數(shù)字光處理（digital light processing，DLP）生物打印，使得GelMA 溶液的黏度增加約140倍，有效克服了3D 封裝過程中細胞分布不均勻的缺點，但細胞真正的沉降速度仍在研究；此外，過量的SF 會降低生物墨水的可打印性。

對于來源豐富的多糖具有良好的生物活性、安全性高，且理化性能優(yōu)越，在生物醫(yī)學領域得到了廣泛的運用[32]。 經研究將甲基丙烯修飾后得到的多糖衍生物與GelMA 混合，可有效提高打印支架的穩(wěn)定性、機械性能、孔隙率和降解度，并表現(xiàn)出良好的生物相容性[33 ～35]。

2.3 合成聚合物復合型

合成聚合物相比天然聚合物更加穩(wěn)定，并有更高的機械性能來制成某些組織支架， 應用也非常廣泛。主要有聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]、聚己內酯[poly（ε-caprolactone），PCL]等高分子材料。PLGA 和PCL 是具有良好生物相容性和可降解、無毒的材料，并能夠提供足夠的支撐強度[36]。 Ko YG 等[37]設計含有聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米片[poly（lactic-co-glycolic acid）nanofiber fragments，PLGA-NF] 的GelMA 混合水凝膠， 研究發(fā)現(xiàn)PLGA-NF 的加入使水凝膠黏度和壓縮模量顯著增加，也有效促進了負載細胞的增殖。Buyuksungur S 等[38]通過3D 打印具有高機械強度的PCL/GelMA 復合水凝膠支架， 并對負載牙髓干細胞的PCL/GelMA 復合水凝膠進行3D 生物打印，支架中細胞表現(xiàn)出高活力（74%～95%）。

有些合成聚合物不但可以提升打印支架的機械性能， 并可賦予水凝膠本身極其微弱的導電性能。Spencer AR 等[39]開發(fā)了聚（3，4-乙烯二氧噻吩）-聚苯乙烯碳酸鈉[poly （3，4-ethylenedioxythiophene）/poly（styrenesulfonate），PEDOT/PSS]/GelMA 水凝膠， 通過控制PEDOT/PSS 的濃度來調節(jié)電導率， 可打印生成高分辨率和打印保真度的3D 仿生結構。

合成聚合物具有可控穩(wěn)定的結構，使其在提高材料性能方面比天然聚合物更占據優(yōu)勢。如今眾多合成聚合物復合水凝膠已被研究出來，不僅為了提供高材料的力學性能，同時賦予材料多樣其他性能，如藥物控釋、光敏性、熱敏性等，得到更廣泛的應用。

3 總結與展望

理想的水凝膠支架不僅要具備良好的機械性能，還需根據不同的負載細胞，控制好支架的孔徑，具有良好的生物相容性。 GelMA 因其本身所具有的優(yōu)良特性， 在生物醫(yī)學應用領域成為非常受歡迎的材料。低濃度的GelMA 具備高生物相容性， 但其機械性能較差，所得支架并不能滿足設計需求，并成為打印過程重大的挑戰(zhàn)。 通過不斷探索復合天然/合成聚合物的混合水凝膠，可大大提升支架的機械性能，同時保留GelMA 優(yōu)越的生物相容性。 而納米材料同時增強了GelMA 水凝膠的電導率， 不僅可以調控細胞的行為， 并可結合柔性電子及圖像處理等電子信息技術，將支架實現(xiàn)智能功能，尤其是在敷料支架領域的研究極其熱門。