鴨源奇異變形桿菌和摩氏摩根菌的分離鑒定、NDM 耐藥基因檢測(cè)及中藥體外抑菌試驗(yàn)

石玉節(jié)，柴貝貝，張彥昕

（鄭州賽科藥業(yè)科技有限公司，河南 鄭州 450000）

變形桿菌是人和動(dòng)物的一種常見(jiàn)條件致病菌，以普通變形桿菌（Proteus vulgaris）和奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）最為常見(jiàn)［1］。 變形桿菌可引起腹瀉、腎盂腎炎、尿道炎、腦膜炎、菌血癥等疾病，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡［2-4］。 摩氏摩根菌（Morganella morganii）為兼性厭氧的革蘭陰性菌，是一種條件致病菌，可引起腹瀉以及傷口和尿道感染，嚴(yán)重時(shí)可引起菌血癥［5］。 近些年，變形桿菌和摩氏摩根菌的臨床分離率越來(lái)越高， 且很多臨床分離菌株都呈現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性［6］。 攜帶介導(dǎo)對(duì)碳青酶烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的blaNDM基因的“超級(jí)耐藥菌”的出現(xiàn)，使得被稱(chēng)為人類(lèi)治療革蘭陰性菌感染“最后一道防線(xiàn)” 的碳青酶烯類(lèi)抗菌藥物無(wú)法發(fā)揮較好的治療作用， 對(duì)人類(lèi)健康和公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重威脅［7］，也對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示，blaNDM基因主要在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上的克雷伯菌和大腸桿菌中傳播［8］，關(guān)于分離出攜帶blaNDM基因的摩氏摩根菌報(bào)道較少。

2021 年11 月， 廣東省某鴨場(chǎng)的部分鴨只開(kāi)始發(fā)病，初期病鴨精神沉郁、羽毛凌亂，并排出黃綠色水樣稀糞，后期發(fā)病鴨只陸續(xù)死亡。為確定引起病鴨死亡的細(xì)菌性病原種類(lèi)， 筆者從發(fā)病鴨場(chǎng)采集病料進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)及鑒定； 在確定病原菌種屬的基礎(chǔ)上， 對(duì)分離菌株進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)和NDM 耐藥基因檢測(cè)，并評(píng)價(jià)單味中藥對(duì)分離菌株的體外抑菌效果， 篩選對(duì)分離菌株具有明顯抑菌作用的中藥， 以期為該類(lèi)疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源

肝臟、 脾臟等病料樣本采集自廣東省某鴨場(chǎng)的發(fā)病鴨只。

1.1.2 主要試劑及受試藥物

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙門(mén)志賀菌屬（SS）瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，南京建成生物科技有限公司產(chǎn)品；革蘭染液試劑盒，索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌生化微量鑒定管，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PCR 試驗(yàn)相關(guān)試劑，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

13 種藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。 野菊花、大黃、金銀花、連翹、苦參、辣木、駱駝刺、枇杷葉、桑葉、黃柏、防風(fēng)、射干、桔梗、博落回，均購(gòu)自河南省禹州市永銘藥業(yè)有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-1F 型超凈工作臺(tái)， 蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LS-50LD 型立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LI-9272 型恒溫培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PA43 BIO型光學(xué)顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；DYY-6D 型電泳儀， 北京市六一儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；A050911-014 型UVP 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)思博明科學(xué)器材公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將灼燒過(guò)的剪刀烙烤病變組織表面， 用剪刀剪開(kāi)組織， 手持灼燒過(guò)的接種環(huán)伸入切口輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)后取出， 分別于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS 瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線(xiàn)接種，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h； 挑取不同形態(tài)的單個(gè)菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)8 h； 劃線(xiàn)接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)， 直至培養(yǎng)基上出現(xiàn)單一菌落。

1.2.2 革蘭染色鏡檢

從長(zhǎng)有單一菌落的平板培養(yǎng)基上， 無(wú)菌挑取單個(gè)菌落，使用革蘭染色試劑盒進(jìn)行染色，光鏡下觀(guān)察細(xì)菌形態(tài)、排列方式及染色特征。

1.2.3 生化鑒定

在無(wú)菌環(huán)境下， 使用接種環(huán)挑取純化培養(yǎng)后的單個(gè)菌落，接種于生化微量鑒定管中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀(guān)察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 16S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增及測(cè)序分析

采用煮沸法提取分離菌株的基因組DNA。PCR 擴(kuò)增采用細(xì)菌16S rDNA 序列通用引物，上游引 物 （rmtc-F） 序 列：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3， 下游引物（rmtc-R） 序列：5′-AAGGAGGTGAGCCAGCCGCA-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小1 500 bp。 PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA 模板3 μL，上、下游引物各0.5 μL。 PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s， 共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司完成測(cè)序。

1.2.5 基于16S rDNA 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中， 將分離菌株的16S rDNA 測(cè)序結(jié)果與已公布的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)； 根據(jù)比對(duì)結(jié)果用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析， 并使用Mega-X 軟件中鄰接法（Neighbor-Joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)， 通過(guò)分離菌株的同源性分析及在進(jìn)化樹(shù)上的分支確定其對(duì)應(yīng)種屬。

1.2.6 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，參照K-B 紙片擴(kuò)散法，結(jié)果參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行耐藥、中介、敏感的結(jié)果判定。

1.2.7 NDM 耐藥基因檢測(cè)

采用PCR 法檢測(cè)10 種NDM 耐藥基因在分離菌株中的分布情況。 目的基因引物序列參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)［9-10］，引物序列及預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 以提取的分離菌基因組DNA 為模板，不同耐藥基因?qū)?yīng)不同的引物，參照“1.2.4”項(xiàng)下的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并觀(guān)察記錄結(jié)果。

表1 10 種NDM 耐藥基因檢測(cè)所用引物序列信息

1.2.8 中藥體外抑菌試驗(yàn)

1.2.8.1試驗(yàn)菌液及單味中藥藥液制備

菌液制備： 無(wú)菌挑取分離菌單個(gè)純菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～12 h。 用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)液，使菌液濃度達(dá)到1×107CFU/mL，備用。

單味中藥液制備：采用水煎煮沸法制備試驗(yàn)所需所有藥材的中藥藥液，每種中藥各稱(chēng)取60 g，水煎2 次，合并2 次濾液，濃縮至藥材與藥液比1∶1，使中藥藥液終濃度為1 g/mL，高壓蒸氣滅菌30 min，4 ℃保存，備用。

1.2.8.2 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用肉湯二倍稀釋法測(cè)定各單味中藥對(duì)分離菌株的MIC。 如果藥液本身透明， 則直接判定結(jié)果；若藥液顏色較深，在培養(yǎng)結(jié)束后無(wú)法直接觀(guān)察結(jié)果， 則使用接種環(huán)挑取每孔培養(yǎng)液在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)24 h， 以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低稀釋度為MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離及革蘭染色鏡檢結(jié)果

從病變組織中分離出2 株具有鑒定意義的菌株，將2 株分離菌株分別命名為SK1、SK2。 2 株菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)圓形、灰白色、中央突起、表面光滑的單個(gè)菌落；SK1 株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、扁平、半透明、表面光滑的菌落，在SS 瓊脂培養(yǎng)基上為半透明、中央黑色或整個(gè)菌落都呈黑色的圓形、 扁平菌落；SK2 株在SS瓊脂培養(yǎng)基及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上均為無(wú)色菌落。 革蘭染色鏡檢顯示，2 株分離菌株均為革蘭陰性菌，其形狀以短桿狀為主，兩端鈍圓，多數(shù)為中等大小。

2.2 生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果

生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)（第八版）》，SK1 株的鑒定結(jié)果與奇異變形桿菌基本相符，SK2 株的鑒定結(jié)果符合摩氏摩根菌的生化特性。

表2 分離菌株SK1、SK2 的生化鑒定結(jié)果

2.3 16S rDNA 序列的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

如圖1 所示，SK1 株和SK2 株的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小均在1 500 bp 左右，獲得的目的條帶單一、清晰，片段與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。

圖1 分離菌株的16S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.4 16S rDNA 序列同源性分析及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)使用MegAlign 軟件比較分析測(cè)序獲得的SK1 株、SK2 株16S rDNA 序 列 與GenBank 中已公布的細(xì)菌16S rDNA 序列的同源性，判定2 株菌的種屬。 由圖2 可知，分離株SK1 與20 株參考菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行比對(duì)，同源性為93.4%～99.6%， 與美國(guó)人體糞便來(lái)源Proteus mirabilis 分離株（GenBank 登錄號(hào)：JX006386.1）、中國(guó)南京市黑水蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)Proteus mirabilis 分離株（Gen-Bank 登錄號(hào)：OK053814）同源性最高，達(dá)99.6%，因此， 將SK1 株鑒定為奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）； 分離株SK2 與20 株參考菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行比對(duì)， 同源性為93.7%～99.2%，與中國(guó)云南省動(dòng)物糞便來(lái)源Morganella morganii 分離株（GenBank 登錄號(hào)：KC456528）、荷蘭微生物實(shí)驗(yàn)室Morganella morganii 分離株 （GenBank 登錄號(hào)：KJ626253.1）同源性最高，達(dá)99.2%，因此，將SK2 株鑒定為摩氏摩根菌（Morganella morganii）。

圖2 分離菌株的16S rDNA 序列同源性比對(duì)分析

對(duì)SK1 株、SK2 株以及GenBank 中收錄的20株參考菌株的16S rDNA 序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖3 可知，22 株細(xì)菌的16S rDNA 序列在進(jìn)化上分為兩大支，SK1 株與中國(guó)南京市黑水蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)Proteus mirabilis 分 離 株 （GenBank 登 錄 號(hào)：OK053814） 屬于同一分支，SK2 株與中國(guó)云南省動(dòng)物糞便來(lái)源Morganella morganii 分離株（Gen-Bank 登錄號(hào)：KC456528）屬于同一分支，遺傳關(guān)系最為密切。

圖3 基于細(xì)菌16S rDNA 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.5 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株的抗菌藥物敏感性結(jié)果見(jiàn)表3。 由表3 可知，SK1 株對(duì)新霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星敏感，對(duì)其余8 種抗菌藥物耐藥；SK2 株對(duì)慶大霉素、卡那霉素、新霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮敏感，對(duì)多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氟苯尼考、多黏菌素B 耐藥，環(huán)丙沙星和左氧氟沙星中介。

表3 分離菌SK1 株、SK2 株的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 單位：mm

2.6 NDM 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)分離菌株SK1、SK2 進(jìn)行10 種NDM 耐藥基因的PCR 檢測(cè)， 結(jié)果顯示，SK2 株檢測(cè)出blaNDM-1基因， 其他9 種NDM 耐藥基因菌未檢出；SK1 株10 種NDM 耐藥基因均未檢出。

2.7 單味中藥對(duì)分離菌株的MIC

單味中藥對(duì)2 株分離菌的體外抑菌效果見(jiàn)表4。由表4 可知，博落回對(duì)SK1 株的抑菌效果最強(qiáng)，MIC 為3.906 mg/mL； 其次是大黃和金銀花，MIC為31.25 mg/mL； 然后是苦參和連翹，MIC 分別為125、250 mg/mL；野菊花、駱駝刺、枇杷葉和射干的MIC 均為500 mg/mL。 連翹對(duì)SK2 株的抑菌效果最強(qiáng)，MIC 為3.906 mg/mL；其次為博落回，MIC 為7.812 5 mg/mL；金銀花的MIC 為15.625 mg/mL；大黃、駱駝刺的MIC 為31.25 mg/mL；辣木的MIC 為62.5 mg/mL；苦參、射干的MIC 為125 mg/mL；野菊花的MIC 為250 mg/mL； 枇杷葉、 桑葉、 防風(fēng)的MIC 為500 mg/mL。

表4 中藥對(duì)分離菌SK1 株、SK2 株的MIC 測(cè)定結(jié)果 單位：mg/mL

3 討論

奇異變形桿菌存在于被污染的水源、 糞肥和土壤中，對(duì)人和動(dòng)物都具有感染性。在畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域， 奇異變形桿菌引起的感染是近些年多發(fā)的急性細(xì)菌性傳染病，發(fā)病主要集中家禽中，鴨感染奇異變形桿菌的報(bào)道較為少見(jiàn)［11］。 本研究分離的奇異變形桿菌SK1 株，對(duì)新霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星敏感，此結(jié)果與近些年報(bào)道的醫(yī)源、 動(dòng)物源奇異變形桿菌藥物敏感性研究結(jié)果相似［12-14］。 有研究報(bào)道，兔源奇異變形桿菌對(duì)環(huán)丙沙星高度敏感［15］，但也有報(bào)道稱(chēng)人源奇異變形桿菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥［16-17］，這種差異可歸因于菌株宿主來(lái)源的不同。 張萍等［18］報(bào)道狐貍源奇異變形桿菌對(duì)頭孢菌素類(lèi)藥物敏感， 這一結(jié)果與本研究結(jié)果相似， 即鴨源奇異變形桿菌SK1 株對(duì)頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢他啶敏感。 楊霞等［19］報(bào)道鴨源奇異變形桿菌對(duì)頭孢氨芐耐藥， 頭孢氨芐是第一代頭孢菌素類(lèi)藥物； 本研究中鴨源奇異變形桿菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢他啶敏感，三者均為第三代頭孢菌素類(lèi)藥物； 提示相同動(dòng)物來(lái)源的奇異變形桿菌對(duì)同類(lèi)藥物的敏感性差異可能與藥物代次有關(guān)。

摩氏摩根菌屬于腸桿菌科摩根菌屬， 廣泛存在于人和動(dòng)物的糞便、污水、土壤中，在機(jī)體免疫力低下時(shí)可條件性致病， 且該菌的天然耐藥性嚴(yán)重［20］。近年來(lái)，有很多關(guān)于摩氏摩根菌引起人和多種動(dòng)物疾病的相關(guān)報(bào)道， 甚至可引起人和動(dòng)物的死亡［21］。目前有摩氏摩根菌引起烏魚(yú)、中華鱉、牛、豬、雞、兔等動(dòng)物感染的報(bào)道［22］，但是關(guān)于從鴨體內(nèi)分離出摩氏摩根菌報(bào)道相對(duì)較少。 本研究分離出的摩氏摩根菌SK2 株對(duì)慶大霉素、卡那霉素、新霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮敏感，對(duì)多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氟苯尼考、多黏菌素B 耐藥， 這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的鳀魚(yú)源摩氏摩根菌對(duì)抗菌藥物的敏感性檢測(cè)結(jié)果相似［23］；并且該菌株檢測(cè)出blaNDM-1耐藥基因，說(shuō)明該鴨場(chǎng)存在碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥性傳播和擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

單味中藥體外抑菌結(jié)果顯示， 博落回對(duì)奇異變形桿菌SK1 株的抑菌效果最強(qiáng)，大黃、金銀花次之；連翹對(duì)摩氏摩根菌SK2 株的抑菌效果最強(qiáng)，其次為博落回和金銀花。 其他中藥對(duì)SK1 株和SK2株的體外抑菌效果不如以上中藥理想。 此結(jié)果可為治療鴨源奇異變形桿菌和摩氏摩根菌感染參考依據(jù)。但本研究?jī)H進(jìn)行了體外試驗(yàn)，中藥在進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)是否能對(duì)上述2 種菌發(fā)揮有效的抑制效果，還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

引起該鴨場(chǎng)鴨群發(fā)病的主要病原菌為奇異變形桿菌和摩氏摩根菌，可使用新霉素、頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物及中藥博落回、 連翹對(duì)患病鴨只進(jìn)行治療。