新疆南疆某規(guī)?；d羊養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉羔羊隱孢子蟲感染情況及其分子鑒定

張博文，司俊飛，張振杰，郭嘉棟，陳 榮，赫永強(qiáng)，余復(fù)昌，齊 萌，2

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000）

隱孢子蟲（Cryptosporidium）是引起人和動(dòng)物腹瀉的常見腸道寄生原蟲之一， 多通過飲水或食物進(jìn)行傳播［1］。 成年綿羊感染隱孢子蟲后，一般無明顯臨床癥狀； 羔羊感染隱孢子蟲后， 可引起腹瀉、脫水、消化不良、增長緩慢等臨床癥狀［2］。 目前，已命名至少45 個(gè)隱孢子蟲蟲種，常見感染羊的隱孢子蟲有微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）、泛在隱孢子蟲（C.ubiquitum）和肖氏隱孢子蟲（C.xiaoi），其中，微小隱孢子蟲和泛在隱孢子蟲是人獸共患隱孢子蟲蟲種［3］。

在我國開展的調(diào)查結(jié)果顯示， 綿羊隱孢子蟲感染率為0.41%（2/489）～36.36%（36/99）， 以新疆維吾爾自治區(qū)、寧夏回族自治區(qū)、吉林省和北京市的綿羊隱孢子蟲感染率較高， 分別為36.36%（36/99）、33.75%（81/240）、32.86%（23/70） 和29.69%（19/64）；以肖氏隱孢子蟲為優(yōu)勢(shì)感染蟲種，泛在隱孢子蟲和微小隱孢子蟲次之；以＜3 月齡羔羊更易感染隱孢子蟲［2，4-5］。

研究發(fā)現(xiàn)，微小隱孢子蟲至少存在21 個(gè)亞型家族， 不同宿主之間微小隱孢子蟲的亞型分布具有一定差異，其中Ⅱa 與Ⅱd 亞型家族可感染人和多種動(dòng)物，Ⅱc 和Ⅱe 則僅感染人［6］。我國綿羊感染的微小隱孢子蟲亞型主要為Ⅱd 亞型家族， 同時(shí)也發(fā)現(xiàn)少數(shù)感染Ⅱa 亞型家族［7-9］。 該研究結(jié)合顯微鏡觀察和分子生物學(xué)技術(shù)， 檢測(cè)新疆南疆某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉羔羊隱孢子蟲感染情況， 解析其基因亞型分布特點(diǎn)， 以期為我國新疆羊源隱孢子蟲的致病性和遺傳進(jìn)化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 腹瀉羔羊糞便樣本的采集

2023 年4 月，在新疆南疆某規(guī)?；d羊養(yǎng)殖場(chǎng)，采用一次性手套經(jīng)直腸采集4 個(gè)品種1 月齡以內(nèi)腹瀉羔羊糞便樣本共60 份，分別置于潔凈自封袋中，標(biāo)記信息后置4 ℃冷藏箱，送至實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器

奧林巴斯CX31 顯微鏡， 日本Olympus 公司產(chǎn)品；A600 型PCR 儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-7C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及JY 系列電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；糞便全基因組DNA 提取試劑盒，OMEGA 公司產(chǎn)品；2×EasyTaq PCR Super Mix（+dye）和DL 2 000 Marker，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 隱孢子蟲卵囊顯微鏡觀察

參考李治國等［10］報(bào)道的方法，采用飽和蔗糖溶液漂浮法檢查糞便樣本中的隱孢子蟲卵囊。 取1～2 g 綿羊糞便樣本于50 mL 燒杯中，加入30 mL蒸餾水充分?jǐn)嚢杈鶆?，?jīng)60 目篩網(wǎng)過濾至50 mL離心管中，3 000 r/min 離心2 min；棄去上清液，分別于離心管沉淀物中加入20 mL 飽和蔗糖溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅? 000 r/min 離心3 min； 吊環(huán)蘸取表層液膜置載玻片上，加蓋玻片，置普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 腹瀉羔羊糞便樣本DNA 的提取

取約200 mg 糞便樣本分別置于2 mL 離心管內(nèi)，使用糞便全基因組DNA 提取試劑盒，按照操作流程提取糞便樣本中的DNA， 每份樣本提取200 μL DNA，置于-20 ℃保存。

1.5 隱孢子蟲SSU rRNA 基因和微小隱孢子蟲gp60 基因的PCR 擴(kuò)增與電泳

參照文獻(xiàn)［11］設(shè)計(jì)隱孢子蟲SSU rRNA 基因序列引物，對(duì)所有DNA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，鑒定隱孢子蟲種屬；參照文獻(xiàn)［12］設(shè)計(jì)隱孢子蟲gp60基因序列引物， 對(duì)鑒定為微小隱孢子蟲的樣本進(jìn)行基因亞型鑒定； 引物均由蘇州金維智生物科技有限公司合成， 引物序列見表1。 隱孢子蟲SSU rRNA 基因和微小隱孢子蟲gp60 基因的PCR 擴(kuò)增均按照25 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行，各組分分別為：2×EasyTaq PCR Super Mix（+dye）12.5 μL，上、下游引物各0.3 μL，雙蒸水10.9 μL，糞便DNA 模板1 μL。

表1 隱孢子蟲SSU rRNA 基因和gp60 基因序列信息

基于隱孢子蟲SSU rRNA 基因位點(diǎn)， 兩輪PCR 擴(kuò)增條件均為：預(yù)變性94 ℃5 min；變性94 ℃30 s，退火55 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃5 min。每次PCR 擴(kuò)增時(shí)，以塔里木大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的牛源安氏隱孢子蟲（C.andersoni）DNA 樣本為陽性對(duì)照， 以雙蒸水為陰性對(duì)照。 基于微小隱孢子蟲gp60 基因位點(diǎn)，兩輪PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件均為：預(yù)變性94 ℃5 min；變性94 ℃45 s，退火58 ℃45 s，延伸72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃10 min。每次PCR 擴(kuò)增時(shí)，以塔里木大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的牛源微小隱孢子蟲DNA 樣本為陽性對(duì)照，雙蒸水為陰性對(duì)照。 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，每份樣本分別取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳和觀察。

1.6 隱孢子蟲種屬/基因亞型序列測(cè)定和比對(duì)分析

基于SSU rRNA 基因和gp60 基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將PCR 擴(kuò)增呈陽性的產(chǎn)物均委托蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序和序列拼接。 利用NCBI 中的BLAST，對(duì)測(cè)序獲得的隱孢子蟲序列和微小隱孢子蟲基因亞型序列進(jìn)行同源序列搜索，分別下載同源性較高的參考序列。對(duì)所獲隱孢子蟲種屬/基因亞型序列和下載的參考序列，采用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定隱孢子蟲的種類和微小隱孢子蟲的基因亞型。

1.7 微小隱孢子蟲基因亞型的種系發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建和分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中，分別下載不同地區(qū)和不同宿主源微小隱孢子蟲基因亞型序列， 結(jié)合該研究所獲微小隱孢子蟲基因亞型序列，采用MEGA 7.0軟件對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)分析， 以鄰接算法（Neighbor-Joining，NJ） 構(gòu)建微小隱孢子蟲基因亞型種系發(fā)育進(jìn)化樹， 進(jìn)化樹的可靠性采用Bootstrap 分析進(jìn)行檢測(cè)。 根據(jù)種系發(fā)育樹形成的聚類和分支， 分析微小隱孢子蟲不同基因亞型之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 隱孢子蟲卵囊的形態(tài)學(xué)觀察與種類初步鑒定

普通光學(xué)顯微鏡下（400×）觀察可見，飽和蔗糖溶液中隱孢子蟲卵囊呈圓形、 近圓形或不規(guī)則圓形，淡藍(lán)紫色，周邊有亮綠色折光帶，卵囊大小約5 μm×5 μm（見圖1）。 60 份羔羊腹瀉糞便樣本中有38 份樣本中觀察到隱孢子蟲卵囊，陽性率為63.33%（38/60）； 結(jié)合宿主年齡和形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定該次調(diào)查所獲蟲種為微小隱孢子蟲。

圖1 普通光學(xué)顯微鏡下隱孢子蟲卵囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)（400×）

2.2 隱孢子蟲SSU rRNA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果及種屬鑒定

基于隱孢子蟲SSU rRNA 基因位點(diǎn)，60 份腹瀉羔羊糞便DNA 樣本中有52 份成功擴(kuò)增約587 bp的條帶，與目的條帶相符（見圖2）。

圖2 隱孢子蟲SSU rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)PCR 擴(kuò)增可知，腹瀉羔羊的隱孢子蟲的陽性率為86.67%（52/60），其中，杜泊羊、澳湖羊、澳洲白羊、 湖羊羔羊的隱孢子蟲陽性率分別為85.71%（6/7）、89.29%（25/28）、100%（8/8）、76.47%（13/17）（見表2）。 52 份隱孢子蟲陽性樣本均成功雙向測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)分析，所獲隱孢子蟲序列均與我國大慶市奶牛源微小隱孢子蟲 （GenBank 序列登錄號(hào)：OQ456120） 和法國山羊羔羊源微小隱孢子蟲（GenBank 序列登錄號(hào)：OQ938540）序列同源性為100%，均鑒定為微小隱孢子蟲（見表2）。

表2 某規(guī)?；d羊養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉羔羊隱孢子蟲感染情況

2.3 微小隱孢子蟲gp60 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果及基因亞型鑒定

基于gp60 基因位點(diǎn)對(duì)52 份微小隱孢子蟲陽性樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，49 份樣本成功擴(kuò)增出約850 bp 大小的條帶，與目的片段相符（見圖3），有3 份樣本未能擴(kuò)增成功。

圖3 隱孢子蟲gp60 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

49 份微小隱孢子蟲陽性樣本均成功雙向測(cè)序， 經(jīng)序列比對(duì)分析，49 條微小隱孢子蟲序列均與我國安徽山羊源微小隱孢子蟲亞型ⅡdA19G1（GenBank 序列登錄號(hào)：MH049734）和陜西奶山羊源微小隱孢子蟲亞型ⅡdA19G1（GenBank 序列登錄號(hào)：KT235713）序列的同源性為100%，均鑒定為亞型ⅡdA19G1（見表3、圖4）。

圖4 基于隱孢子蟲基因亞型構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹

表3 微小隱孢子蟲gp60 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及基因亞型鑒定

2.4 微小隱孢子蟲基因亞型種系進(jìn)化分析

根據(jù)微小隱孢子蟲gp60 基因序列構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹可知， 微小隱孢子蟲不同亞型家族形成不同的進(jìn)化支，Ⅱf、Ⅱg、Ⅱi 和Ⅱq 亞型家族聚類形成一個(gè)進(jìn)化支， 與其他亞型家族形成不同分支。 該研究所獲綿羊源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA19G1 與科威特人源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA18G1，瑞典人源、我國牛源、山羊源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA19G1，葡萄牙人源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA21G1，波蘭牛源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA23G1，英國人源微小隱孢子蟲基因亞型ⅡdA24G1 等序列同處于一個(gè)亞群進(jìn)化支；與Ⅱt亞型家族形成一個(gè)亞群， 而與其他亞型家族形成不同的亞群分支。

3 討論

世界范圍內(nèi)，綿羊感染隱孢子蟲較普遍，以羔羊更易感， 隨宿主年齡增長而隱孢子蟲感染率呈下降趨勢(shì)。 至少有14 個(gè)隱孢子蟲種/基因型可感染羊，在歐洲，綿羊以微小隱孢子蟲為優(yōu)勢(shì)感染蟲種；在大洋洲、亞洲和非洲，肖氏隱孢子蟲為綿羊的優(yōu)勢(shì)感染蟲種；而在北美洲和南美洲，泛在隱孢子蟲為綿羊的優(yōu)勢(shì)感染蟲種。上述研究結(jié)果提示，不同地理環(huán)境分布的綿羊感染隱孢子蟲蟲種/基因型存在一定的適應(yīng)性遺傳分布［13-14］。

在以色列的調(diào)查顯示，31 份2～21 日齡腹瀉綿羊羔羊的糞便樣本中，通過PCR 法檢測(cè)，有30份呈隱孢子蟲感染陽性， 感染率為96.77%（30/31），均為微小隱孢子蟲［15］；在羅馬尼亞的調(diào)查顯示，175 份＜21 日齡羔羊的腹瀉糞便樣本中， 通過顯微鏡觀察檢測(cè)， 有24 份呈隱孢子蟲感染陽性，感染率為13.71%（24/175），鑒定出3 種隱孢子蟲，以微小隱孢子蟲為優(yōu)勢(shì)感染蟲種（20/24），同時(shí)發(fā)現(xiàn)泛在隱孢子蟲（2/24）和肖氏隱孢子蟲（2/24）［16］。該研究通過顯微鏡觀察， 發(fā)現(xiàn)腹瀉羔羊隱孢子蟲的陽性率為63.33%（38/60）；通過PCR 法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腹瀉羔羊隱孢子蟲的陽性率為86.67%（52/60），均為微小隱孢子蟲；調(diào)查結(jié)果與上述報(bào)道相一致，表明微小隱孢子蟲是感染新生羔羊的主要隱孢子蟲蟲種，可引起羔羊腹瀉。

研究發(fā)現(xiàn)， 感染綿羊的微小隱孢子蟲亞型主要是Ⅱa 和Ⅱd 亞型，其基因亞型呈現(xiàn)多樣遺傳分布特征。在西班牙，Díaz 等［17］報(bào)道無腹瀉癥狀綿羊羔羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA15G2R1 和ⅡaA14G2R1；在希臘，Papanikolopoulou 等［18］調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 腹瀉綿羊羔羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA15G2R1、 ⅡaA20G1R1、 ⅡdA15G1 和ⅡdA16G1；在以色列，Tako 等［15］報(bào)道腹瀉綿羊羔羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA15G1R1、ⅡaA15G2R1、 ⅡaA16G1R1、 ⅡaA16G2R1、 ⅡaA17G1R1、 ⅡaA17G2R1、 ⅡaA19G2R1、 ⅡaA21G1R1、ⅡdA20G1 和ⅡdA22G1；在羅馬尼亞，Imre 等［16］報(bào)道腹瀉綿羊羔羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA16G1R1、ⅡaA17G1R1、ⅡdA20G1、ⅡdA24G1 和ⅡdA22G2R1；在波蘭，Kaupke 等［19］報(bào)道綿羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA17G1R1；在巴西，Paz 等［20］報(bào)道綿羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡaA15G2R1。在我國，Mi 等［4］報(bào)道北京市、上海市、山東省、吉林省等地綿羊感染的微小隱孢子蟲亞型有ⅡaA15G2R1、ⅡaA17G2R1、ⅡdA15G1、ⅡdA18G1、ⅡdA19G1；Qi 等［8］報(bào)道新疆維吾爾自治區(qū)綿羊感染的微小隱孢子蟲亞型為ⅡdA15G1。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 某規(guī)?；瘓?chǎng)腹瀉羔羊源微小隱孢子蟲均為ⅡdA19G1，提示綿羊源微小隱孢子蟲具有區(qū)域適應(yīng)性。

4 結(jié)論

該結(jié)果表明，新疆維吾爾自治區(qū)某規(guī)?；d羊養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉羔羊隱孢子蟲感染率較高，感染蟲種為微小隱孢子蟲， 鑒定出的基因亞型為ⅡdA19G1。調(diào)查結(jié)果為綿羊隱孢子蟲種屬鑒定與遺傳進(jìn)化研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。